劉云章，何佳遠(yuǎn)，肖 蕓，陳麗珍，王建龍

（1. 中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030051；2. 湖北東方化工有限公司，湖北 襄陽(yáng) 441404）

1 引言

1，3?二氯?2，4，6?三硝基苯（DCTNB）是一種淺黃色片狀晶體，易溶于二氯甲烷等有機(jī)溶劑，但不溶于水［1］。由于硝基的影響，苯環(huán)上位于硝基鄰位或?qū)ξ坏柠u原子比較活潑，容易發(fā)生親核取代反應(yīng)，硝基越多，鹵原子就越活潑。因此它是一種重要的含能化合物中間體，能夠與鹵代芳香硝基化合物發(fā)生Ullmann反應(yīng)，生成具有較高熔點(diǎn)的多硝基聯(lián)苯類耐熱炸藥，如二 氨 基 六 硝 基 聯(lián) 苯（DIPAM）［2］、九 硝 基 三 聯(lián) 苯（NONA）［3］等，還可與含有氨基的化合物進(jìn)行偶聯(lián)得到性能優(yōu)異的含能化合物。

純度是含能化合物中間體品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，對(duì)后續(xù)合成各種含能化合物的品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生重大的影響。純度的常用測(cè)試方法主要包括滴定法［4］、凝固點(diǎn)下降法［5］、差熱分析法（DSC）［6］、核磁共振氫譜法（1H NMR）［7］和高效液相色譜法（HPLC）［8］等。HPLC因其樣品用量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好及自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)而廣泛應(yīng)用于含能化合物的純度分析［9-13］，是含能化合物定性定量分析的重要方法之一。

近年來(lái)，關(guān)于DCTNB 的研究工作主要集中在合成工藝優(yōu)化及晶體結(jié)構(gòu)鑒定［14-16］，缺乏相應(yīng)的純度分析方法研究，不利于其合成過(guò)程的純度檢測(cè)與質(zhì)量控制。 為此，本研究基于反相高效液相色譜法（RP?HPLC），對(duì)DCTNB 與其合成過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)（1，5?二氯?2，4?二硝基苯（DCDNB）和2，3，4?三氯?1，5?二硝基苯（TCDNB））進(jìn)行分離，探究最優(yōu)色譜條件，通過(guò)建立DCTNB 及其合成過(guò)程中雜質(zhì)的高效液相色譜分析方法，為DCTNB 的純度分析和質(zhì)量控制提供可靠的參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（包括P1100 系列恒流泵A/B、GM1100 梯度混合器、D1100 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、O1100 色譜柱恒溫箱、Elitapex 色譜數(shù)據(jù)工作站），Agress1100 型，大連依利特分析儀器有限公司。色譜柱，Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司。電子天平，AL104 型，精確度0.0001 g，梅特勒—托利多集團(tuán)。超聲清洗儀，KQ5200M 型，東莞市科橋有限公司。紫外分光光度計(jì)，UV?2802S 型，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

DCDNB，DCTNB 及TCDNB，分別在無(wú)水乙醇中多次重結(jié)晶，純度均大于99.0%，實(shí)驗(yàn)室自制。無(wú)水乙醇，分析純，純度大于99.5%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇（MeOH），色譜純，純度大于99.9%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司。乙腈（ACN），色譜純，純度大于99.9%，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司。

2.2 樣品的處理

準(zhǔn)確稱取20.00 mg 的DCTNB 粗品，置于100 mL的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解樣品并定容至容量瓶刻度線處，然后使用超聲震蕩使其完全溶解，配置成200 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。準(zhǔn)確稱取25.00 mg 的DCTNB 純 品，12.50 mg 的DCDNB 純 品 及12.50 mg的TCDNB 純品，分別加入到三個(gè)50 mL 的棕色容量瓶中，使用乙腈溶解樣品并定容至容量瓶刻度線處，然后使用超聲震蕩使其完全溶解，配置成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；再分別對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配置成500，250，100，50，20，10，5 mg·L-1等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢測(cè)限等相關(guān)研究。所有樣品在進(jìn)行HPLC 分析前，都經(jīng)過(guò)孔徑為0.45 μm 的尼龍66 過(guò)濾膜過(guò)濾，避光保存。

2.3 HPLC 方法的優(yōu)化

以乙腈為溶劑，配制濃度約為10 mg·L-1的DCD?NB，DCTNB 及TCDNB 乙腈溶液，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，掃描波長(zhǎng)范圍設(shè)置為200～800 nm，得到三種化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)，進(jìn)而確定檢測(cè)波長(zhǎng)。HPLC 分析方法的研究主要在大連依利特Agress1100 高效液相色譜儀上進(jìn)行，使用標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，對(duì)流動(dòng)相體系及比例、流速、柱溫及進(jìn)樣量等影響色譜分析的因素進(jìn)行選擇，確定最優(yōu)色譜條件。HPLC 分析、數(shù)據(jù)采集及定量分析均在Elitapex 色譜數(shù)據(jù)工作站上進(jìn)行。

2.4 HPLC 方法的驗(yàn)證

建立DCTNB 高效液相色譜分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)分析靈敏度、精密度、重復(fù)性及準(zhǔn)確度等參數(shù)，對(duì)建立的HPLC 分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。

基于不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液來(lái)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以信噪比S/N=3 時(shí)的濃度為檢出限（LOD）來(lái)分析該方法的檢出限，以信噪比S/N=10 時(shí)的濃度為定量限（LOQ）來(lái)分析該方法的定量限，以此來(lái)評(píng)價(jià)該方法的靈敏度。

在最優(yōu)色譜條件下，對(duì)樣品溶液進(jìn)行三次平行測(cè)定，間隔5 h 后對(duì)樣品溶液再次進(jìn)行三次平行測(cè)定，分析DCDNB，DCTNB 及TCDNB 的保留時(shí)間和峰面積等相關(guān)參量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評(píng)估該方法的精密度與重復(fù)性。

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在未知濃度的樣品中添加不同濃度（25，50，100 mg·L-1）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳色譜條件下，每個(gè)添加平行進(jìn)樣三次并計(jì)算加標(biāo)回收率，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液的紫外光 譜 如 圖1 所 示。由 圖1 可 知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的最大吸收波長(zhǎng)均在240 nm 附近，即三種化合物在240 nm 波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)的紫外吸收響應(yīng)，基質(zhì)干擾較少，滿足殘留檢測(cè)的要求。因此，選用240 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在乙腈溶液中的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile solution

3.1.2 流動(dòng)相體系

由于DCDNB，DCTNB 及TCDNB 在甲醇和乙腈中均可溶解，因此選用純乙腈溶解樣品，分別選用甲醇/水，乙腈/水作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，在甲醇/水，乙腈/水這兩種流動(dòng)相體系中，三種化合物紫外吸收峰的分離度均較大，分離效果良好，但在乙腈/水流動(dòng)相體系中三種化合物的響應(yīng)值明顯較強(qiáng)，且TCDNB 在乙腈/水體系中的保留時(shí)間明顯小于在甲醇/水體系中的保留時(shí)間。因此在乙腈/水體系下能夠更快實(shí)現(xiàn)三種化合物的分離，提高分離效率，并且當(dāng)乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)可以有效避免溶劑對(duì)分析造成的干擾［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用乙腈/水作為流動(dòng)相體系。

圖2 DCDNB，DCTNB及TCDNB在不同流動(dòng)相體系中的色譜圖Fig.2 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in different mobile phase systems

3.1.3 流動(dòng)相比例

由于DCTNB 及其合成過(guò)程中的雜質(zhì)均不溶于水，流動(dòng)相中的水相的占比不宜過(guò)大。因此，選取VACN/VWater分別為40/60，50/50，60/40，70/30，80/20，90/10 等不同比例的乙腈/水為流動(dòng)相研究樣品的液相色譜分離情況，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增大，流動(dòng)相的洗脫能力增強(qiáng)，三種化合物的保留時(shí)間也相應(yīng)的縮短。在VACN/VWater為40/60，50/50，60/40 時(shí)，DCDNB，DCTNB 和TCDNB依次出峰，實(shí)現(xiàn)了三種化合物的分離，但VACN/VWater為60/40 時(shí)，DCDNB 與DCTNB 兩 化 合 物 的 紫 外 吸 收 峰相連；而VACN/VWater為70/30，80/20，90/10 時(shí)，DCDNB與DCTNB 的紫外吸收峰重合，未能實(shí)現(xiàn)分離。隨后對(duì)VACN/VWater進(jìn)行了微調(diào)，最終選用流動(dòng)相VACN/VWater=55/45作為DCTNB高效液相色譜分析條件，在該條件下各組分均可實(shí)現(xiàn)基線分離，峰型對(duì)稱，分離效果良好。

圖3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同比例乙腈/水體系中的色譜圖Fig.3 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB in acetonitrile/water system with different ratio

3.1.4 流動(dòng)相流速

流動(dòng)相流速對(duì)被分析物的保留時(shí)間有較大的影響，適宜的流速能有效的減少保留時(shí)間，提高分離效率。分別考察了流動(dòng)相流速為0.6，0.8，1.0，1.2，1.5 mL·min-1對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，隨著流速的增加，三種化合物的保留時(shí)間呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)，由0.6 mL·min-1時(shí)的17.63～26.98 min縮短至1.5 mL·min-1時(shí)的7.48～11.57 min，同時(shí)分離度也逐漸減小。雖然選用的五種不同流速均能滿足液相色譜的分離要求，但流速越大，色譜柱的柱壓越高，儀器的穩(wěn)定性變差［18］，并且長(zhǎng)時(shí)間的高柱壓工作會(huì)對(duì)色譜柱的使用壽命造成影響，而流速較低時(shí)，三種化合物紫外吸收峰的峰寬變大，保留時(shí)間較長(zhǎng)，使得實(shí)驗(yàn)分析的誤差較大且效率較低。綜合考慮柱壓與保留時(shí)間，最終選擇流動(dòng)相流速為1.2 mL·min-1，在此流速下，三種化合物能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，分離效果良好，峰形對(duì)稱，柱壓適中，對(duì)儀器與色譜柱的影響較小，保留時(shí)間為9.20～14.17 min。

圖4 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同流速下的色譜圖Fig.4 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different flow rate

3.1.5 柱溫

為減少色譜柱的溫度對(duì)DCTNB 的色譜分析產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)分別考察了樣品在25，30，35，40，45 ℃等柱溫下的分離效果，結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果表明，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出峰，隨著柱溫的升高，各組分的保留時(shí)間縮短，由25 ℃時(shí)的9.20～14.17 min 縮短至45 ℃時(shí)的8.44～13.37 min，但分離度下降，并且柱溫過(guò)高會(huì)降低色譜柱的使用壽命。因此，為保護(hù)色譜柱以及操作的便捷，并參考實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度，選擇室溫25 ℃作為DCTNB 色譜分析的柱溫。

圖5 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同柱溫下的液相色譜圖Fig.5 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB at different column temperature

3.1.6 進(jìn)樣量

由于進(jìn)樣量的大小會(huì)對(duì)色譜的峰高和峰面積產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響分離效果。實(shí)驗(yàn)分別考察了樣品進(jìn)樣量為5，10，15，20 μL 時(shí)的分離效果，結(jié)果如圖6 所示。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL 時(shí)，三種化合物的分離效果良好，峰形對(duì)稱，各吸收峰響應(yīng)值適中；當(dāng)進(jìn)樣量減少為5 μL 時(shí)，雖然分離效果良好，但各峰的響應(yīng)值過(guò)低；而當(dāng)進(jìn)樣量增加至15 或20 μL 時(shí)，峰形出現(xiàn)前延現(xiàn)象，分離效果明顯下降。因此，選擇體積10 μL 為DCTNB 色譜分析的進(jìn)樣量。

圖6 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 在不同進(jìn)樣量下的液相色譜圖Fig.6 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB un?der different sample size

3.1.7 最優(yōu)色譜分析條件

綜上，本研究建立了DCTNB 純度的高效液相色譜分析方法，并獲得了最優(yōu)色譜分析條件，色譜柱為Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，流動(dòng)相為VACN/VWater=55∶45，流速為1.2 mL·min-1，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。最優(yōu)色譜條件下DCTNB 樣品的高效液相色譜圖如圖7 所示，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 依次出 峰，保留時(shí)間分別為9.20，10.50，14.17 min，各峰的分離度（R）均大于3.70，分離效果良好，最優(yōu)色譜條件下三種化合物的分離參數(shù)如表1 所示。

圖7 最優(yōu)HPLC 條件下DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的高效液相色譜圖Fig.7 Chromatograms of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

表1 最優(yōu)HPLC條件下DCDNB，DCTNB和TCDNB的分離參數(shù)Table 1 The separation parameters of DCDNB，DCTNB and TCDNB under optimum condition of HPLC

3.2 DCTNB 方法的驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

在最優(yōu)色譜條件下，對(duì)不同濃度范圍內(nèi)的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣三次，使用外標(biāo)法結(jié)合峰面積定量，獲得三種化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖8 所示。由圖8 可知，在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCDNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=27044.63X-43.70，R2=0.99942；在5～500 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCTNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=27863.51X-7.11，R2=0.99989；在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，TCDNB的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=21548.70X-17.57，R2=0.99997。將5 mg·L-1的DCDNB，DCTNB 和TCDNB 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 逐步稀釋，分別在最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得檢出限分別為0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分別為1.58，2.28，2.82 mg·L-1，表明該方法具有良好的靈敏度。

圖8 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curves of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.2 精密度與重復(fù)性

將DCDNB，DCTNB 和TCDNB 按比例（1∶1∶1）配制成總濃度為100 mg·L-1的混合樣品溶液，在最佳色譜條件下，對(duì)樣品溶液進(jìn)行3 次平行的色譜分析，間隔6 h 后對(duì)該樣品再次進(jìn)行3 次平行的色譜分析，實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)及各組分保留時(shí)間與峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，樣品中三種化合物的RSD 均小于1.27%，說(shuō)明該方法的精密度與重復(fù)性較好，滿足高效液相色譜定性及定量分析的要求。

表2 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的保留時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 The relative standard deviations of retention time and peak area of DCDNB，DCTNB and TCDNB

3.2.3 準(zhǔn)確度

采用加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)來(lái)定量分析方法的準(zhǔn)確度，回收率越接近100%，該方法的準(zhǔn)確度越高。向未知濃度的樣品溶液中分別加入濃度為25.00，50.00，100.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)色譜條件下，未知濃度樣品和每個(gè)添加水平平行進(jìn)樣3 次，求得平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加標(biāo)回收率在98.82%～102.13%之間，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的加標(biāo)回收率Table 3 The standard recovery rate of DCDNB，DCTNB and TCDNB

4 結(jié)論

對(duì)于DCTNB 的合成及應(yīng)用對(duì)于純度分析的需求，進(jìn)行了基于高效液相色譜法的DCTNB 純度分析方法的建立與驗(yàn)證。

（1）通過(guò)探索檢測(cè)波長(zhǎng)，流動(dòng)相體系及比例 流速、柱溫和進(jìn)樣量等相關(guān)因素對(duì)DCDNB，DCTNB 和TCDNB 的分離效果的影響，建立了對(duì)于DCTNB 純度分析的反相高效液相色譜分析方法。優(yōu)化后的最優(yōu)色譜條件為：Hypersil ODS2 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，流動(dòng)相為VACN/VWater=55∶45，流速1.2 mL·min-1，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)色譜條件下，DCDNB，DCTNB和TCDNB 的保留時(shí)間依次為9.20，10.50，14.17 min，且三種化合物紫外吸收峰的分離度可達(dá)3.70 以上，能夠?qū)CDNB，DCTNB 和TCDNB 達(dá)到良好的分離和分析。

（2）對(duì)所建立的分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)的驗(yàn)證，采用外標(biāo)法對(duì)DCDNB，DCTNB 和TCDNB 進(jìn)行了定量分析，在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCDNB 的濃度與色譜峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；在5～500 mg·L-1的范圍內(nèi)，DCTNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；在5～250 mg·L-1的范圍內(nèi)，TCDNB 的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。DCDNB，DCTNB和TCDNB 的檢出限分別為0.47，0.68，0.85 mg·L-1，定量限分別為1.58，2.28，2.82 mg·L-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.27%，加標(biāo)回收率98.82%～102.13%。

結(jié)果表明，本研究建立的DCTNB 色譜分析方法具有良好的靈敏度、精密度、重復(fù)性與準(zhǔn)確度，可用于DCTNB 的純度分析、含量檢測(cè)和質(zhì)量控制等研究。