梁曉瑩，肖葉玉，廖中曦，陳 杰，劉燕飛

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院影像科，廣東 汕頭 515041；2.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院影像科，廣東 廣州 510800；3.益陽市中心醫(yī)院影像科，湖南 益陽 413000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 常見慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病隱匿、早期癥狀不明顯，易被忽視而增加足潰瘍及截肢等風(fēng)險[1]。建立能夠較好模擬DPN發(fā)生的穩(wěn)定動物模型并進行研究對于早期診斷DPN具有重要臨床意義，但目前罕見與高血糖及糖基化終末產(chǎn)物等因素有關(guān)且適用于實驗室的DPN動物模型[2]。1H-MR波譜(MR spectroscopy, MRS)具有無創(chuàng)、可動態(tài)檢測活體細(xì)胞內(nèi)代謝變化及在分子水平反映生理功能和病理改變等優(yōu)勢，為近年研究熱點之一[3]。本研究建立2型DM(type 2 DM, T2DM)大鼠模型，通過單體素1H-MRS檢測大鼠右后肢腓腸肌肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)(intramyocellular lipid, IMCL)濃度，觀察其用于早期診斷DPN的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只4周齡無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級雄性SD大鼠，體質(zhì)量100～120 g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心[許可證號：SYXK(粵)2012-079)]提供。本研究獲汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(SUMC 2017-146)。

1.2 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ，購自Sigma-Aldrich)，高糖高脂飼料(蛋白質(zhì)∶糖∶脂肪=15.4∶53.5∶31.1，北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司)，檸檬酸、檸檬酸鈉(西隴科學(xué)股份有限公司)；7.0T小動物MR成像儀(美國Agilent公司)；BL-420生物信號采集和處理系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.3 建立T2DM大鼠模型 將30只SD大鼠隨機分為DM組(n=15)和正常組(n=15)，均以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周；之后對DM組以高糖高脂飼料、正常組以普通飼料飼養(yǎng)4周。動物停飼、不禁飲16 h后，經(jīng)腹腔注射1% STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液45 mg/kg體質(zhì)量。于注射后第1、3及7天分別檢測2組大鼠空腹血糖，以3次均<7.5 mmol/L為正常，DM組以3次均≥16.7 mmol/L為建立T2DM大鼠模型成功；期間對DM組以高糖高脂飼料繼續(xù)飼養(yǎng)，正常組則以普通飼料飼養(yǎng)。建模成功后，每周測量并記錄2組大鼠空腹血糖及體質(zhì)量。

1.4 單體素1H-MRS 分別于建模成功后第4、8周行7.0T單體素1H-MRS掃描。麻醉并俯臥位保定大鼠于掃描槽，以手術(shù)膠帶及自制海綿墊固定其右后肢，將射頻線圈置于大鼠右后肢腓腸肌區(qū)，并以手術(shù)膠帶固定線圈，采集大鼠右后肢軸位及矢狀位T2WI，范圍包括右后肢全段，參數(shù)：TR 3 000 ms，TE 40 ms，層厚2 mm，層間距0.1 mm；之后于軸位T2WI顯示大鼠右后肢內(nèi)側(cè)腓腸肌最大面積層面放置波譜感興趣體積(volume of interest, VOI)，體素5 mm×5 mm×5 mm(圖1)，采用點分辨選擇波譜(point resolved selective spectroscopy, PRESS)序列采集波譜，掃描范圍同上，參數(shù)：TR 2 500 ms，TE 14 ms，Average 300，手動完成勻場及水抑制掃描。采用頻譜定量分析軟件LC-Model擬合1H-MRS數(shù)據(jù)，并檢測大鼠右后肢腓腸肌IMCL濃度。

圖1 SD大鼠右后肢腓腸肌單體素1H-MRS圖示VOI(紅框) A.軸位； B.矢狀位

1.5 電生理檢測及病理觀察 建模成功后第8周處死動物，分別對2組行離體右坐骨神經(jīng)電生理檢測及HE染色。電生理檢測包括運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity, MNCV)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(sensory nerve conduction velocity, SNCV)，均為單刺激，延時100 ms，波寬1 ms，波間隔10 ms，頻率10 Hz，強度1 V。完成電生理檢測后，取長約1 cm右坐骨神經(jīng)浸泡于10%甲醛溶液中，固定48 h后進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片及HE染色等步驟，于光鏡下觀察神經(jīng)組織變化并拍照記錄。以DM組電生理檢測及鏡下均示明顯異常為建立T2DM DPN大鼠模型成功。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計量資料，行獨立樣本t檢驗，比較組間IMCL濃度、空腹血糖、體質(zhì)量、坐骨神經(jīng)MNCV及SNCV；采用配對樣本t檢驗比較組內(nèi)不同時期IMCL濃度。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖及體質(zhì)量 對DM組大鼠均成功建立T2DM模型；建模成功后第4周3只大鼠死亡、第8周再死亡5只。正常組大鼠實驗期間均未死亡。

建模后DM組大鼠各周空腹血糖均高于正常組(P均<0.01，圖2A)。實驗期間2組大鼠體質(zhì)量均呈上升趨勢，且DM組升高更顯著，各周DM組大鼠體質(zhì)量均高于正常組(P均<0.05，圖2B)。

圖2 建模成功后DM組與正常組大鼠每周空腹血糖(A)及體質(zhì)量(B)變化趨勢圖

2.2 右后肢腓腸肌IMCL濃度 建模成功后第4、8周，DM組大鼠右后肢腓腸肌IMCL濃度均顯著高于正常組(P均<0.01)，且建模成功后第8周DM組及正常組大鼠IMCL濃度均明顯高于第4周(P均<0.01)。見表1及圖3、4。

表1 建模成功后第4、8周T2DM與正常大鼠右后肢腓腸肌IMCL濃度比較(mmol/L)

圖3 建模成功后第4周大鼠右后肢腓腸肌1H-MRS擬合圖 A.DM組； B.正常組 (EMCL：肌細(xì)胞外脂質(zhì)) 圖4 建模成功后第8周大鼠右后肢腓腸肌1H-MRS擬合圖 A.DM組； B.正常組

表2 建模成功后第8周T2DM與正常大鼠右坐骨神經(jīng)MNCV及SNCV比較(m/s)

2.3 右坐骨神經(jīng) 建模成功后第8周，DM組大鼠右坐骨神經(jīng)MNCV及SNCV均明顯小于正常組(P均<0.001)，見表2；病理結(jié)果示DM組大鼠右坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維基本連續(xù)、完整，排列分布尚均勻，部分神經(jīng)纖維排列略稀疏，髓鞘著色稍淺、欠均勻，軸索形態(tài)尚可；同期正常組大鼠均未見明顯異常(圖5)。

圖5 建模成功后第8周大鼠右坐骨神經(jīng)病理圖(HE，×20) A.DM組； B.正常組

3 討論

近年來，DM發(fā)病率逐年上升，其中約50%可發(fā)展為DPN，嚴(yán)重影響預(yù)后及生存質(zhì)量[4-6]。目前對于建立T2DM向DPN發(fā)展的動物模型的具體飼養(yǎng)時間及STZ劑量均無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究以高糖高脂飼養(yǎng)大鼠4周誘導(dǎo)胰島素抵抗，并單次經(jīng)腹腔注射1% STZ溶液(45 mg/kg體質(zhì)量)建立T2DM大鼠模型[7-8]，建模成功率100%，且建模成功后第8周可見DPN，但此時DM組存活大鼠少于半數(shù)(7/15)，提示該模型更適用于診斷及防治DPN早期等研究。

臨床主要根據(jù)癥狀及體征診斷DPN，主觀性強，且難以實現(xiàn)量化。神經(jīng)電生理檢查及皮膚表皮內(nèi)神經(jīng)纖維活檢等已用于評估周圍神經(jīng)損傷，但前者成本高、耗時，且多針對有髓大神經(jīng)纖維，而早期DPN主要累及小神經(jīng)纖維及神經(jīng)末梢[9]，皮膚表皮內(nèi)神經(jīng)纖維活檢則因其有創(chuàng)而難以廣泛開展。IMCL在肌肉代謝中起重要作用，可反映脂質(zhì)代謝及多種疾病的病理生理學(xué)改變，如糖尿病、肥胖癥和胰島素抵抗等[10]。傳統(tǒng)方法主要通過肌肉組織活檢及生化分析定量檢測IMCL，難以實現(xiàn)IMCL與肌細(xì)胞外脂質(zhì)(extramyocellular lipid, EMCL)完全分離，且有創(chuàng)，不適用于重復(fù)檢測[11]。MRS可根據(jù)MR化學(xué)位移作用分析原子核及其代謝物，在體定量檢測生物組織內(nèi)代謝變化，且無創(chuàng)、無輻射。既往研究[12-13]表明，1H-MRS可用于肌肉相關(guān)研究，且能準(zhǔn)確區(qū)分IMCL與EMCL。本課題組前期研究[14]亦發(fā)現(xiàn)1H-MRS可用于早期觀察DM大鼠腓腸肌代謝物改變。有學(xué)者[15]指出，腓腸肌IMCL與糖尿病胰島素抵抗密切相關(guān)。

本研究采用1H-MRS觀察T2DM大鼠右后肢腓腸肌IMCL濃度，并分析其對早期診斷DPN的價值。建模成功后第4、8周，DM組大鼠右后肢腓腸肌IMCL濃度均顯著高于正常組，且第8周DM組及正常組大鼠IMCL濃度均明顯高于第4周，可能與胰島素抵抗隨DM進展而加重、脂肪酸氧化減少、線粒體功能障礙有關(guān)[16]，而正常組大鼠IMCL濃度升高可能系因體質(zhì)量增加引起骨骼肌內(nèi)異位脂肪堆積，誘導(dǎo)體內(nèi)胰島素抵抗，導(dǎo)致IMCL增多[10]，與既往研究[16-17]所見基本相符。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，建模成功后第8周，DM組大鼠右坐骨神經(jīng)MNCV及SNCV均明顯小于正常組，且病理結(jié)果示DM組大鼠右坐骨神經(jīng)神經(jīng)纖維基本連續(xù)、完整，排列分布尚均勻，部分神經(jīng)纖維排列略稀疏，髓鞘著色稍淺、欠均勻，軸索形態(tài)尚可。以上結(jié)果為T2DM DPN胰島素抵抗及脂毒性學(xué)說等[18]提供了間接支持。

本研究的主要不足：①DM組大鼠死亡率較高，不適用于研究中晚期DPN；②IMCL分析為活體連續(xù)檢測，而DPN為離體檢測，未能對二者進行相關(guān)性分析。

綜上所述，1H-MRS檢測腓腸肌IMCL對早期診斷T2DM大鼠DPN具有一定價值。