雷 陽，喬 寧，苗如意，楊玉花，梁燕萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因與資源研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031）

鎘（Cd）是植物體內(nèi)的有害元素，極易被植物吸收，并通過維管束從根轉(zhuǎn)移至地上部［1］。鎘元素在植物體內(nèi)大量富集會引起活性氧（ROS）積累，造成氧化脅迫，影響RNA和蛋白質(zhì)的正常表達(dá)合成，導(dǎo)致植物生長發(fā)育遲滯、光合作用受阻［2］。據(jù)統(tǒng)計，我國土壤重金屬污染情況極其嚴(yán)重，污染超標(biāo)率高達(dá)19.4%，每年因重金屬污染造成的糧食損失接近1000萬t，其中36.08%的重金屬污染為鎘含量超標(biāo)［3-4］。

谷胱甘肽（GSH）是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的水溶性氨基酸衍生物［5］，GSH可直接或間接清除ROS［6］，同時也能通過后續(xù)反應(yīng)與鎘等重金屬離子發(fā)生螯合，降低重金屬對植物的脅迫［7］。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是植物體內(nèi)GSH合成路徑上游的關(guān)鍵酶，丁硫堇（BSO）是該酶的抑制劑，能夠有效減少植物體內(nèi)GSH的含量，從而降低植物對重金屬的耐受性［8］。蔡仕珍等［9］研究表明，外源GSH可有效提高鎘脅迫下綿毛水蘇的生物量、光能的捕獲與轉(zhuǎn)換能力、抗氧化酶活性，有效緩解鎘脅迫對植株幼苗生長的抑制作用。楊志峰等［10］研究表明，GSH可有效減輕低溫脅迫下葉綠體膜脂的過氧化程度，增強黃瓜幼苗的抗寒性。Zhou等［11］研究表明，GSH可有效緩解鹽脅迫對番茄光合作用的抑制，并提高抗氧化物酶活性，而添加BSO則會起到與GSH相反的作用。

近年來，隨著我國鎘污染的情況不斷惡化，科研工作者做了大量關(guān)于緩解植物鎘脅迫的研究［12-14］。然而，關(guān)于GSH和BSO對鎘脅迫下辣椒葉片和根部生理影響的研究尚未見報道。鑒于此，本研究針對辣椒生產(chǎn)中出現(xiàn)的鎘污染問題，探究了鎘脅迫下GSH和BSO對辣椒幼苗各項生理性指標(biāo)的影響，旨在探討GSH對辣椒逆境響應(yīng)的調(diào)節(jié)機理，豐富辣椒抗逆機理的理論認(rèn)識，以期為辣椒耐重金屬栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)苯菲贩N為晉椒503（Capsicum annuumL.cv. Jinjiao 503），由山西省園藝學(xué)院辣椒育種團隊提供。CdCl2、GSH和BSO均購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗

選取均勻、無病害的晉椒503辣椒種子，用滅菌水在室溫下浸泡4～5 h。進(jìn)而用75%乙醇沖洗20 s，15%的NaClO沖洗15 min，滅菌水洗滌3次，放入真空干燥箱40℃烘干30 min，播種于72孔的穴盤中，置于25℃（光/暗，12 h/12 h）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后，取長勢一致的幼苗，分成對照組（CK，處理液為滅菌水）和4個處理組（表1）移栽至營養(yǎng)箱中。在處理12 d后分別取樣測定各指標(biāo)含量，每處理測定3株，3次重復(fù)。

表1 試驗處理

1.2.2 幼苗生理指標(biāo)的測定

葉部和根部Cd含量的測定：稱取晉椒503辣椒葉片或根部0.1 g，加入硝酸∶過氧化氫（H2O2）=3∶2的混合溶液5 mL，在消解爐中160℃消解4 h，蒸餾水定容至50 mL，火焰原子吸收分光光度計測定。

葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的測定：避光條件下取晉椒503辣椒幼苗葉片2 g，采用丙酮溶解法提取，然后分別在470、649和665 nm波長下測定。

GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率和H2O2含量的測定采用Murshed等［15］的方法。根據(jù)試劑盒說明書（蘇州格銳思生物技術(shù)有限公司）測定抗氧化物酶和抗壞血酸（AsA）-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性。過氧化物酶（POD）：在470 nm比色，記錄10 s和1 min 10 s吸光值。超氧化物歧化酶（SOD）：靜置30 min，在450 nm比色。過氧化氫酶（CAT）：靜置30 min，在510 nm比色?？箟难徇^氧化物酶（APX）：在290 nm比色，記錄30 s和5 min 30 s吸光值。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）：在340 nm比色，記錄10 s和5 min 10 s吸光值。脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）：在265 nm比色，記錄10 s和3 min 10 s吸光值。谷胱甘肽還原酶（GR）：在412 nm比色，記錄30 s和10 min吸光值。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）：在340 nm比色，記錄3 s和10 min吸光值。γ-GCS：在412 nm比色，記錄1 min吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)和作圖；SAS 1.2分析數(shù)據(jù)，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗生物量的影響

由表2可知，與CK相比，Cd處理的根長、株高、地上部鮮重和地下部鮮重均有顯著（P＜0.05，下同）下降，降幅分別為19.57%、14.69%、31.74%和29.04%。在鎘脅迫下，噴施谷胱甘肽的處理CdGSH比Cd處理的根長顯著升高了22.01%，株高顯著提高了6.59%，地上部鮮重顯著增加了39.11%，地下部鮮重顯著增加了26.47%；噴施谷胱甘肽合成抑制劑BSO可顯著降低辣椒地下部鮮重，而根長、株高和地上部鮮重與Cd處理差異不顯著；同時噴施GSH和BSO，比單獨噴施BSO的處理CdBSO在根長、地上部鮮重和地下部鮮重均有顯著提升，而比CdGSH處理均有顯著降低。

表2 GSH和BSO對鎘脅迫下辣椒幼苗生物量的影響

2.2 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗葉片光合色素含量的影響

光合色素的含量可以作為衡量植物對重金屬脅迫耐受性的一個重要指標(biāo)。由表3可知，與CK相比，處于鎘脅迫下Cd處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和葉綠素a/葉綠素b均顯著降低，分別降低了48.36%、35.03%、40.13%和18.64%。在鎘離子脅迫下，施加GSH與Cd處理相比，辣椒幼苗葉片的葉綠素a含量顯著提高了82.65%，葉綠素b顯著提高了51.33%，類胡蘿卜素含量顯著提高了32.19%，葉綠素a/葉綠素b顯著提高了20.70%。噴施谷胱甘肽合成抑制劑BOS后，葉部的3種光合色素含量較Cd處理均有顯著下降。同時噴施GSH和BSO，比單獨噴施BSO的CdBSO處理，葉片的綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均有顯著提升。

表3 GSH和BSO對鎘脅迫下辣椒幼苗光合色素的影響

2.3 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

由表4可知，各個處理的葉部鎘含量均小于根部的鎘含量。在鎘脅迫下噴施GSH后，辣椒幼苗葉部和根部的鎘含量均比Cd處理顯著升高，增幅分別為11.26%和33.26%，轉(zhuǎn)運系數(shù)有所降低，但差異不顯著。在噴施BSO后，葉部鎘含量比Cd處理顯著下降了12.82%，而根部則降低了10.53%。同時噴施GSH和BSO，比單獨噴施BSO的CdBSO處理，葉片和根部鎘含量分別顯著提升了16.34%和35.56%，而比CdGSH處理葉片和根部鎘含量分別顯著降低了10.00%和18.94%。

表4 GSH和BSO對鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

2.4 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT、APX和POD是植物重要的抗氧化酶，在植物體清除ROS的過程中起到重要作用。由圖1可知，辣椒葉部的4種抗氧化酶活性總體上均高于根部的酶活性。與CK相比，Cd處理根部的SOD活性以及根部和葉部的CAT、APX和POD活性均顯著下降。在鎘脅迫下，噴施GSH對根部的SOD、CAT、APX和POD活性均顯著提升，比Cd處理分別增加了49.63%、68.15%、51.60%和59.72%；噴施GSH對葉部的CAT、APX和POD酶活性均顯著提升，相比于Cd處理分別有28.11%、64.86%和40.47%的增幅。在噴施BSO后，辣椒葉部SOD、CAT和POD活性均顯著下降。同時噴施GSH和BSO，葉部的CAT、APX和POD酶活性和根部的SOD、CAT、APX、POD酶活性比CdBSO處理均顯著提升。

圖1 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒抗氧化物酶活性的影響

2.5 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗AsAGSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

AsA-GSH循環(huán)是除了抗氧化物酶系統(tǒng)以外，另一套植物體清除ROS的重要系統(tǒng)，GR、DHAR、MDHAR、GPX和γ-GCS是該系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。由圖2可知，與CK相比，Cd處理根部和葉部的GR、DHAR、MDHAR和γ-GCS活性均顯著降低，而GPX活性則顯著升高。在鎘脅迫下，補充GSH可顯著提升GR、DHAR、MDHAR和GPX在辣椒葉片和根部的活性，而γ-GCS活性在葉部降低，在根部則與Cd處理差異不顯著。在施加了BSO后，葉部的GR、DHAR、GPX、γ-GCS活性和根部的MDHAR、DHAR、GPX、γ-GCS活 性 與Cd處理相比均顯著降低。同時噴施GSH和BSO，葉部和根部的GR、DHAR、MDHAR、GPX酶活性比CdBSO處理均顯著提升。

圖2 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

2.6 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗GSH循環(huán)的影響

GSH是植物體內(nèi)清除ROS的重要還原性物質(zhì)，GSH/GSSG代表了細(xì)胞內(nèi)還原氧化性物質(zhì)的能力，與植物抵抗非生物脅迫能力相關(guān)。由圖3可知，Cd處理比CK處理根部和葉部的GSH、GSSG含量顯著升高，葉部GSH/GSSG顯著降低，而根部GSH/GSSG變化不顯著。相比于Cd處理，CdGSH處理可顯著提升鎘脅迫下的辣椒葉片和根部GSH、GSSG含量和GSH/GSSG，增幅分別為165.83%、62.62%、37.18%和15.89%、93.78%、40.32%。相比于Cd處理，CdBSO處理可顯著降低辣椒葉部和根部GSH、GSSG含量以及葉部的GSH/GSSG。同時噴施GSH和BSO，葉部和根部GSH、GSSG含量和GSH/GSSG比CdBSO處理均顯著提高；與CdGSH處理相比，CdGSHBSO處理葉部的GSH、GSSG含量和GSH/GSSG均顯著下降，根部只有GSH顯著下降。

圖3 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒GSH循環(huán)的影響

2.7 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗ROS的影響

O2·-和H2O2是植物體內(nèi)主要的ROS，O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量可代表植物細(xì)胞內(nèi)ROS的積累程度。由圖4可知，與CK相比，Cd處理葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率分別顯著下降44.01%和60.63%，H2O2含量在葉部和根部分別顯著下降53.83%和119.98%。在鎘脅迫下，噴施GSH后，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率比Cd處理分別降低27.92%和23.99%，H2O2含量分別降低24.99%和31.81%。在噴施BSO后，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率和根部的H2O2含量均顯著升高。同時噴施GSH和BSO，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量比CdBSO處理均顯著降低，而與CdGSH處理相比則顯著上升。

圖4 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

3 討論

3.1 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗生物量和光合色素的影響

鎘脅迫會導(dǎo)致植物體內(nèi)過量的ROS迅速積累，影響光合色素的穩(wěn)定性，阻礙光合作用對能量的轉(zhuǎn)化，破壞營養(yǎng)物質(zhì)的正常積累，從而嚴(yán)重影響植物生物量的增長［16］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫條件下辣椒幼苗根長、株高、地上部鮮重和地下部鮮重以及葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量明顯下降，在葉面噴施GSH則可有效提升鎘脅迫下辣椒生物量和光合色素的含量，而噴施GSH合成抑制劑BSO則會加重鎘脅迫下辣椒生物量和光合色素含量的下降。正面和反面的結(jié)果共同說明GSH可以緩解鎘脅迫辣椒幼苗生長發(fā)育的抑制和對光合色素的降解，有效保護(hù)辣椒光合系統(tǒng)，從而提升幼苗對鎘脅迫的耐受性。

3.2 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

GSH可通過聚合反應(yīng)形成多聚物骨架，進(jìn)而與重金屬陽離子發(fā)生螯合形成螯合肽，在重金屬吸收和轉(zhuǎn)運方面起著重要作用［17-18］。本研究結(jié)果表明，在葉面噴施GSH可增加葉部和根部的鎘含量，其中根部鎘含量的增加更為明顯，因此轉(zhuǎn)運系數(shù)反而下降；噴施BSO可同等程度地降低葉部和根部的鎘含量，因此轉(zhuǎn)運系數(shù)變化不顯著。Yuan等［19］的研究表明，對馬藺噴施GSH會顯著增加根部和葉部的鉛含量，這與本研究結(jié)果相一致，但馬藺對鉛的轉(zhuǎn)移系數(shù)會因GSH而增加，這與本研究結(jié)果不同。Nakamura等［20］的研究結(jié)果表明，對油菜噴施BSO可降低根中鎘含量，但會增加油菜莖葉中的鎘含量，也與本研究結(jié)果部分不同，這可能是植物種類、重金屬種類和施用方式不同導(dǎo)致的。噴施GSH顯著增加了辣椒根部和葉部的鎘含量，但卻沒有對辣椒的生長和光合作用造成損害，反而增加了辣椒的生物量和光合色素含量。這可能是由于GSH通過螯合作用將原本可自由移動的鎘離子固定為金屬螯合肽，螯合物可被轉(zhuǎn)運蛋白運送至細(xì)胞外或儲存于液泡內(nèi)。辣椒鎘元素的總含量雖然在上升，但是可對植物細(xì)胞產(chǎn)生脅迫的活性鎘的有效濃度卻明顯下降，因此減輕了細(xì)胞膜的過氧化程度，保護(hù)了光合色素的穩(wěn)定性，維護(hù)了營養(yǎng)物質(zhì)的正常積累。

3.3 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗抗氧化物酶的影響

植物體內(nèi)清除O2·-和H2O2等ROS的機制可分為抗氧化酶和非酶2個清除系統(tǒng)：抗氧化酶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶為POD、SOD、CAT、APX；非酶系統(tǒng)又稱為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)［21］。SOD可將O2·-催化分解為H2O2和O2，而H2O2可分別由POD催化還原型輔酶代謝以及APX催化AsA代謝，或者是CAT直接清除，因而抗氧化酶在響應(yīng)重金屬脅迫中具有重要作用［22］。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫會造成辣椒幼苗的抗氧化物酶活性降低，這可能是鎘離子替換了抗氧化酶活性中心的鎂、鐵和錳等金屬陽離子，造成部分酶的功能喪失。對鎘脅迫下的辣椒幼苗噴施外源GSH后，抗氧化物酶活性均顯著提高，而添加BSO則會抑制這些酶的活性，從正反兩方面說明GSH可有效保護(hù)抗氧化物酶行使正常功能，降低鎘脅迫對酶活性的影響。

3.4 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗AsAGSH循環(huán)及其關(guān)鍵酶活性的影響

AsA和GSH可直接還原ROS，氧化產(chǎn)物分別為DHA和GSSG。GR則可將氧化態(tài)的GSSG還原為GSH［23］，MDHAR和DHAR酶可分別將單脫氫抗壞血酸（MDHA）和DHA還原為AsA［24］，GPX以GSH為電子供體還原ROS，γ-GCS是植物體內(nèi)GSH合成路徑上游的關(guān)鍵酶［25-28］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫下，辣椒根部和葉部的GR、DHAR、MDHAR和γ-GCS活性以及GSH/GSSG均顯著降低，而GPX活性以及GSH、GSSG含量則顯著上升。同時本研究結(jié)果也表明，補充GSH可顯著提升辣椒葉片和根部GR、DHAR、MDHAR和GPX的活性以及GSH、GSSG含量和GSH/GSSG，而γ-GCS在葉部的活性則隨著GSH的增加而降低；添加BSO可不同程度地降低MDHAR、GR、DHAR、GPX和γ-GCS活性以及GSH、GSSG含量和GSH/GSSG。結(jié)果從正反兩方面說明GSH可通過激活A(yù)sA-GSH循環(huán)系統(tǒng)關(guān)鍵酶活性來提升AsA-GSH的循環(huán)速率，通過提高GSH循環(huán)系統(tǒng)還原態(tài)/氧化態(tài)比例來加快清除ROS效率。

3.5 谷胱甘肽和丁硫堇對鎘脅迫下辣椒幼苗ROS的影響

在非脅迫狀態(tài)下，植物細(xì)胞內(nèi)的O2·-和H2O2等ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而過多的鎘離子會打破該平衡狀態(tài)［29］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫下，辣椒幼苗葉部和根部O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量均顯著升高，噴施GSH可有效清除辣椒體內(nèi)的ROS，而BSO則會加劇ROS的積累。結(jié)合上文的結(jié)果不難得出，鎘脅迫下辣椒體內(nèi)的抗氧化酶和非酶清除系統(tǒng)受到抑制，造成了體內(nèi)ROS的大量積累，而補充GSH則一方面可直接參與ROS的清除，另一方面可通過提高抗氧化酶系統(tǒng)和AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的ROS清除效率，有效緩解鎘離子造成的細(xì)胞ROS脅迫效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究以在高濃度鎘脅迫下的晉椒503為試驗材料，探究鎘脅迫下GSH和BSO對辣椒幼苗葉部和根部各項生理性指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，高濃度鎘離子對辣椒的脅迫主要表現(xiàn)在抑制抗氧化酶和AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性而造成ROS過度積累，添加外源GSH一方面可直接清除ROS，另一方面可顯著提高POD、SOD、CAT、APX、GR、DHAR、MDHAR和GPX酶活性，提高GSH循環(huán)系統(tǒng)還原態(tài)/氧化態(tài)比例，兩個路徑共同作用降低了O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2的含量，緩解了鎘對辣椒幼苗的正常生長和光合作用的抑制效應(yīng)；而添加GSH合成抑制劑BOS則會逆轉(zhuǎn)上述作用，從反面證明了GSH在辣椒響應(yīng)鎘脅迫的過程中起到重要作用。外源GSH雖然增加了辣椒幼苗鎘的總含量，但未對辣椒的各項生理指標(biāo)產(chǎn)生副作用，這可能是由于GSH與鎘離子形成了螯合肽，被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外和液泡內(nèi)，降低了葉綠體內(nèi)和各個酶活動區(qū)域的鎘離子濃度，從而緩解了鎘對于光合作用和ROS清除系統(tǒng)的抑制作用。而在噴施外源GSH和BSO的條件下，辣椒細(xì)胞內(nèi)重金屬螯合肽與活性鎘離子的具體變化情況還需要進(jìn)一步研究。