劉蘇瑤，雷繩尾，張宏鑫，牛秋紅

南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院（南陽 473061）

環(huán)境中的抗生素被認為是新型污染物。據(jù)報道，我國抗生素年使用量約為15～20萬 t[1]，它可影響污水生物處理系統(tǒng)的功能[2-4]，導(dǎo)致微生態(tài)失衡。林可霉素可廣泛抑制大多數(shù)革蘭陽性菌和某些厭氧的革蘭陰性菌[5-6]。林可霉素及其復(fù)方抗生素被廣泛應(yīng)用于食用動物的疾病治療及控制，由此產(chǎn)生的耐藥菌具有交叉耐藥性[7]。這種多藥耐藥性對人類和生態(tài)系統(tǒng)健康造成了嚴重威脅。因此，減少林可霉素的釋放及降解環(huán)境中的殘余林可霉素至關(guān)重要。

林可霉素類藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，經(jīng)常在環(huán)境中可檢測到[8-9]。Kuchta等[10]研究發(fā)現(xiàn)來自農(nóng)田的融雪徑流樣品中林可霉素質(zhì)量濃度為0.008～0.84 μg/L，在土壤中含量可達2.5～240 μg/L。此外，發(fā)酵廢渣中殘留的林可霉素含量高且不易降解，對環(huán)境造成極大危害。因此，尋找可降解林可霉素的菌株進行生物降解環(huán)境及發(fā)酵藥渣中殘余的林可霉素，可能是新型林可霉素減排利用的雙贏策略，也是將發(fā)酵廢渣實現(xiàn)廢物利用的關(guān)鍵步驟。

基于此，此次試驗從林可霉素生產(chǎn)藥廠的大量廢水廢渣中篩選到一株對林可霉素具極高降解活性、對環(huán)境有益的酵母菌菌株，對其進行分類鑒定，并對該菌株的降解因子初步探究，找到了其降解分子機制，研究結(jié)果為后續(xù)的研發(fā)提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品

菌種分離樣品，來源于南陽普康藥業(yè)有限公司林可霉素生產(chǎn)藥廠的廢水廢渣。

指示菌藤黃八疊球菌，來源于南陽普康藥業(yè)有限公司林可霉素生產(chǎn)藥廠的廢水廢渣。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

篩選培養(yǎng)基：0.1 g磷酸二氫鉀、0.05 g硝酸鉀、0.01 g硫酸鎂、0.01 g硫酸亞鐵、0.6 g林可霉素和1.5 g瓊脂，定容100 mL。

試管種培養(yǎng)基：0.5%酵母粉、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖、瓊脂1.5%；pH 3～6。將菌體接種到培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)3 d，獲得試管種。

液體擴大培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物、0.5%蛋白胨、1%葡萄糖；pH 3～6。

培養(yǎng)條件：將試管種接種到500 mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝200 mL，在25 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間3 d，轉(zhuǎn)速為250 r/min。

1.3 降解菌株篩選

初篩：從林可霉素生產(chǎn)藥廠的廢水廢渣中收集、取樣，稀釋到合適倍數(shù)，接種到僅用林可霉素（1.2 g/mL）作為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中，獲得了一些能夠在無機鹽和林可霉素固體瓊脂平板上生長的菌株。后續(xù)長出的酵母菌進行復(fù)篩，選取降解活性最大的菌株用于后期試驗。

復(fù)篩：使用杯碟法測定各菌株對林可霉素的降解效果。以藤黃八疊球菌作為指示菌，將初篩獲得的菌株分別加入藥渣中，通過測定抑菌圈的大小差異來檢測發(fā)酵液中殘留林可霉素的含量，進而計算出各菌株的降解能力，按式（1）計算。每個處理重復(fù)3次。

1.4 降解活性測試

使用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法定量復(fù)篩菌株對林可霉素的降解率。在微孔板包被有林可霉素偶聯(lián)抗原，加入林可霉素標準品或樣品，游離林可霉素與微孔條上預(yù)包被的林可霉素偶聯(lián)抗原互相競爭抗林可霉素抗體酶標記物，用TBM底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色，用酶標儀在450 nm波長下進行檢測，吸光度與樣品中林可霉素含量呈反比，通過標準曲線計算樣品中林可霉素的含量，從而獲得菌株對林可霉素的降解效果。

1.5 降解菌株鑒定

對篩選菌株的菌落及細胞形態(tài)、繁殖方式進行觀察[17]。通過糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、類淀粉化合物生成試驗、產(chǎn)酯試驗、產(chǎn)酸試驗等生理生化特征對篩選菌株進行鑒定[11-12]。利用通用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）與NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），以酵母菌基因組為模板，擴增26S rDNA D1/D2區(qū)序列，將其克隆到載體中再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆提交至生工生物工程（上海）股份有限公司測序[13]。將測定的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，使用BLAST程序與已有菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進行相似性比較，確定該菌株的分類地位。

1.6 降解基因克隆

通過DNA文庫構(gòu)建及功能篩選的方法獲得酵母菌中可降解林可霉素的目的基因。酵母菌菌株基因組提取按照參考文獻[14]進行。文庫構(gòu)建使用Epicentre公司pWEB::TNC Cosmid Cloning Kit試劑盒（方法參照其說明書）。取0.5 μg純化的總DNA，補平DNA末端，然后在低熔點瓊脂糖上進行電泳并回收DNA。補平并回收的DNA與試劑盒中的載體pWEB::TNC連接，連接產(chǎn)物經(jīng)包裝蛋白包裝后侵染宿主菌EPI100并涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上。

用平板影印法將文庫影印到降解活性測試平板上，將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，篩選陽性克隆。將陽性克隆復(fù)測活性驗證后，提取質(zhì)粒進行基因亞克隆操作，提取質(zhì)粒送交大連寶生物公司進行測序。

1.7 降解基因表達及活性測定

構(gòu)建降解基因的酵母表達載體ehS1/pWX530，在宿主釀酒酵母細胞中表達，用離子交換層析純化表達產(chǎn)物。利用上述方法對基因表達產(chǎn)物測試降解能力，PBS作為陰性對照，S1菌液作為陽性對照。

2 結(jié)果和分析

2.1 降解林可霉素酵母菌的篩選和分離

從林可霉素制藥廠附近采來5份水樣和10份土樣，在以林可霉素為唯一碳源的培養(yǎng)基上分離，獲得了6株酵母菌，分別為M4、M8、G6、S1、N2、N3。對這6株酵母菌純化后，進行林可霉素降解活性測試。結(jié)果表明：在發(fā)酵7，10和15 d后，在裝有無菌水的牛津杯上，陰性對照的抑制圈分別為29.98，30.05和30.17 mm，而6種酵母菌株的抑制圈直徑范圍17.79～25.51 mm（表1），這6株酵母菌均顯示對林可霉素的降解能力。其中，編號為S1的菌株顯示最弱的抑菌圈，這一結(jié)果表明菌株S1表現(xiàn)出最強的林可霉素降解活性，用于后續(xù)試驗對象。

表1 林可霉素降解菌株的篩選結(jié)果

2.2 酵母菌S1的降解活性測試

所獲得的每個濃度的標準溶液和樣本吸光度的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度（B0）再乘以100%，即百分吸光度。其中：B表示標準溶液或樣本溶液的平均吸光度；B0表示0 μg/L標準溶液的平均吸光度。

以林可霉素質(zhì)量濃度為X軸，抑菌圈直徑為Y軸，繪制林可霉素標準樣品質(zhì)量濃度與抑菌圈直徑間線性關(guān)系的標準曲線圖，如圖1所示。

圖1 林可霉素濃度與抑菌圈直徑關(guān)系線型圖

酵母菌S1菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物對林可霉素發(fā)酵藥渣中的殘余林可霉素具有較好的降解效果。處理廢渣7，10和14 d的降解率分別達到27.2%，31.6%和33.8%（表2）。在同樣條件下，對照處理廢渣，其中林可霉素的濃度幾乎不變，從而進一步證明了酵母菌S1菌株對廢渣中殘余林可霉素的降解功能。

表2 酵母菌S1菌株對林可霉素的降解率測定結(jié)果

2.3 酵母菌S1菌株的鑒定

酵母菌S1菌株在平板上光滑，飽滿圓潤，后期呈現(xiàn)雪花狀，顏色為白色，呈薄層狀，表面比較干燥，四周有絨絲狀物質(zhì)，中間沒有突起（圖2A）；該菌的菌落直徑約4～5 cm；細胞體積大小為（1.60～2.36 μm）×（1.6～4.9 μm）；光學(xué)顯微鏡下觀察S1大多數(shù)細胞的形態(tài)呈橢圓形、腎形、圓柱形，有些細胞與其子代細胞連在一起成為鏈狀細胞的生殖方式為裂殖（圖2B）。

圖2 菌株S1的菌落和細胞形態(tài)特征

注：發(fā)育樹節(jié)點的數(shù)字表示Bootstrap值；括號中的數(shù)字為序列登錄號。

以S1菌株的基因組為模板，以NLI和NL4為引物做PCR，菌株的26S rRNA 擴增得到特異性條帶，測序后，將序列分別與GenBank中的序列進行比對，菌株S1與Galactomyces candidumstrain CBS 606.85 26S rRNA（JN974267.1）的同源性達到99.1%。選擇同源性高的前12條序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)S1與G.candidumCBS 606.85聚在同一個分支（圖3）。

通過對S1菌株進行形態(tài)學(xué)及分子鑒定，最終確定為白地霉酵母菌Galactomyces。

2.4 降解基因的克隆與分析

提取了該菌株S1的總DNA，以柯斯質(zhì)粒為載體構(gòu)建了1個含約9 600個克隆的宏基因組文庫，對文庫進行活性篩選，獲得1個具有降解林可霉素活性的克隆。根據(jù)對這些突變文庫的篩選，獲得一個能夠高效降解林可霉素的突變株。經(jīng)過亞克隆及測序分析發(fā)現(xiàn)該突變株編碼1個潛在的降解林可霉素相關(guān)基因，全長1 200 bp，將其命名為dgs1基因，該基因共編碼399個氨基酸的ORF（Open Reading Frame），其氨基酸序列與1個來源于Cryptococcus gattiiWM276的epoxide hydrolase 1基因（XP 003197630）的同源性最高，兩者的一致性為99%，相似性為86.47%。

根據(jù)氨基酸Blast結(jié)果，選取前12個與Dgs1蛋白同源性最高的序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示Dgs1蛋白與來自于C.gattiiWM276環(huán)氧化物水解酶基因聚在一個分支（圖4），該結(jié)果與前面Blast結(jié)果一致。

圖4 菌株S1中環(huán)氧化物水解酶Dgs1的系統(tǒng)發(fā)育分析

以上結(jié)果表明，酵母菌S1中的環(huán)氧化物水解酶基因dgs1可能參與了該菌株降解林可霉素的過程。

2.5 降解基因表達產(chǎn)物及活性

為了進一步驗證dgs1基因的功能，將其連接酵母表達載體ehs9/pWX530，進行異源表達，表達產(chǎn)物在釀酒酵母細胞中分泌表達，用離子交換層析純化表達產(chǎn)物，得到分子量大小為45 kDa的電泳純條帶（圖5）。

圖5 dgs1基因表達純化SDS-PAGE電泳

對純化得到的重組蛋白Rm-Dgs1進行降解活性驗證，結(jié)果如圖6所示。PBS對照、S1菌液和重組蛋白Rm-Dgs1作用藥渣14 d后，抑菌圈直徑分別是13.1，7.7及1.2 mm。Rm-Dgs1的降解能力達到33.95%。結(jié)果表明Rm-Dgs1對林可霉素有明顯的降解作用。

圖6 重組蛋白Rm-Dgs1的降解活性的平板測試結(jié)果

3 討論

在我國大部分采用微生物發(fā)酵法制備抗生素。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢渣盡管富含粗蛋白、氮磷鉀無機鹽、氨基酸和維生素等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但是由于其殘留林可霉素藥效成分而導(dǎo)致其成為難以治理和綜合利用的危險廢棄物[15]，同時，林可霉素發(fā)酵相關(guān)企業(yè)每年投入大量的資金用于運輸和處理這些菌渣。因而，如何將林可霉素菌渣變廢為寶、減少對周圍環(huán)境的污染，成為擺在抗生素生產(chǎn)企業(yè)面前函待解決的一個難題。

目前，對林可霉素的降解有物理、化學(xué)和生物等多種方法。Liu等[16]通過土地利用糞便熱解產(chǎn)生的生物炭進行糞便管理，利用糞污生物炭將水中殘余的林可霉素吸附出來，實現(xiàn)抗生素減排。最近，Morsi等[17]采用固定化大豆過氧化物酶耦合生物催化劑來實現(xiàn)各種新興污染物的有效降解，他們的研究結(jié)果證實與游離酶相比，TiO2和ZnO固定化大豆過氧化物酶對林可霉素等新興污染物的降解效率更高。Mariusz等[18]認為土壤中殘余的抗生素經(jīng)歷不同的生物或非生物的降解過程，包括轉(zhuǎn)化降解、吸附解離、植物吸收或光催化降解等。他們認為抗生素也可能通過還原性或氧化性降解轉(zhuǎn)化，而關(guān)于這些過程的數(shù)據(jù)仍然很少。

國內(nèi)有關(guān)林可霉素發(fā)酵藥渣中殘留抗生素降解技術(shù)的研究報道甚少。有關(guān)林可霉素降解的報道也屈指可數(shù)。任省濤[19]以林可霉素菌渣為研究對象，研究了堆肥過程中林可霉素降解產(chǎn)物以及降解機制，結(jié)果表面堆肥化方式處理林可霉素菌渣可以實現(xiàn)其無害化和資源化。王瑩等[20]從環(huán)境中篩選獲得高效降解林可霉素的菌株寡養(yǎng)單胞菌屬LD25#，并對其降解特性進行了研究，但其降解機制仍不清楚。

此次試驗對林可霉素的降解提出了一種創(chuàng)新的雙贏戰(zhàn)略：利用酵母菌降解廢渣中高濃度的林可霉素，這不僅變廢為寶，還能解決環(huán)境污染問題，可謂一舉兩得。酵母菌是單細胞真核微生物，菌體蛋白質(zhì)含量高，富含多種維生素，能夠用作飼料，可利用工廠排出的有機廢料、廢水生長繁殖。在微生物家族中，酵母菌是食品、飼料等工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)最成熟的種類，研究開發(fā)酵母菌藥渣飼料有著重要的意義。

4 結(jié)論

研究從生產(chǎn)藥廠的大量廢水廢渣中篩選到可降解林可霉素的地霉菌屬酵母菌S1菌株，該菌株可在林可霉素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。對S1菌株降解林可霉素作用機理研究發(fā)現(xiàn)，其降解功能主要源于發(fā)酵液中的某種代謝物質(zhì)成分，主要作用機理是菌株產(chǎn)生的某種代謝物質(zhì)作用于林可霉素結(jié)構(gòu)中的某個關(guān)鍵化學(xué)鍵，從而使其分解成小分子物質(zhì)。進一步通過構(gòu)建基因文庫，活性篩選獲得1個具有降解林可霉素活性的環(huán)氧化物水解酶基因dgs1，對該基因異源表達后，重組蛋白具有顯著的降解功能，從而證明了S1菌株中環(huán)氧化物水解酶基因dgs1在降解林可霉素過程中發(fā)揮重要作用。

此次研究結(jié)果為今后林可霉素高效降解工程菌的構(gòu)建、林可霉素藥渣環(huán)保處理及資源化利用奠定基礎(chǔ)，研究意義在于對于去除生產(chǎn)廢渣中抗生素在環(huán)境中的殘留、提高環(huán)境質(zhì)量、保護生態(tài)平衡及對抗生素生產(chǎn)行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。