莊思遠(yuǎn)，周旭，劉箬瑤，劉春明，李賽男，張語遲

長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)春 130032）

茯神（Poria cumRadix Pini）是多孔菌科（Polyporaceace）真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]的干燥菌核中間抱有松根的部分。茯神中主要含有多糖類和三萜類化學(xué)成分[1-3]，其三萜類化合物是主要的藥效成分之一[4]?，F(xiàn)代研究表明，三萜具有抗炎[5]、抗腫瘤[6]、抗病毒[7]、抗氧化[8]等作用。

常用的三萜提取方法有浸提法、回流法、超聲微波協(xié)同提取法。傳統(tǒng)的浸提法，提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗高、提取率低。超聲提取是一種新型的物理提取技術(shù)，能顯著提高活性成分得率[9-10]。此次試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助溶劑提取法提取茯神中總?cè)瞥煞?，?duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

乳酸脫氫酶是生物體內(nèi)糖酵解途徑中一種至關(guān)重要的氧化還原酶。腫瘤對(duì)人類健康有著極大的危害。乳酸脫氫酶在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞之間的能量代謝的過程中具有重要作用，使其成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)[11]。以超濾技術(shù)作為快速活性篩選方法，以茯神三萜類化合物為研究目標(biāo)，篩選茯神中乳酸脫氫酶抑制劑。

超濾質(zhì)譜是“超濾”技術(shù)和“質(zhì)譜”技術(shù)的一種完美結(jié)合[12-13]。首先選取生物酶如乳酸脫氫酶等作為與疾病相關(guān)的生物靶分子，將酶和小分子在體外進(jìn)行孵化和結(jié)合，對(duì)結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行分離并進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選能夠與酶結(jié)合的分子。超濾質(zhì)譜技術(shù)適用于從傳統(tǒng)中藥中篩選乳酸脫氫酶抑制劑，該方法快速、靈敏，具有高通量的特點(diǎn)，為腫瘤等治療藥物的篩選與開發(fā)提供了科學(xué)有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

茯神，長(zhǎng)春市同仁堂藥店，經(jīng)長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室劉春明教授鑒定為茯神。

1.1.2 供試試劑

乳酸脫氫酶（生產(chǎn)批號(hào)：1001918117），瑞士Fluka公司；齊墩果酸（批號(hào)：H04J9Z62784）、對(duì)照品3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸（Y03D7S25360）、茯苓酸（Y05J8S39371）和松苓新酸（Y08J7H8750），上海源葉生物科技有限公司；其他試劑（均為分析純），北京化工廠；PBS緩沖溶液，瑞士Bueke公司；UPLC流動(dòng)相所用乙腈（色譜純），美國(guó)Thermo Fisher公司；試驗(yàn)用水為超純水，美國(guó)Millipore公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；分析型色譜柱（Sun FireTMC18色譜柱250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），美國(guó)Waters公司；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；UPLC-Q Extractive MS超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；超濾離心管，德國(guó)Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 茯神總?cè)频奶崛」に?/p>

將茯神置于攪拌機(jī)中絞碎，稱取1.0 g粉末于燒杯中，按一定比例加入適量體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在一定溫度和時(shí)間下進(jìn)行超聲提取。提取結(jié)束后，將提取液進(jìn)行過濾。將濾液定容到25 mL容量瓶中，備用。

1.2.2 茯神提取總?cè)频膯我蛩卦囼?yàn)

設(shè)計(jì)提取試驗(yàn)中各單因素考察情況，如表1所示。除說明考察變量條件不同外，其他影響因素均設(shè)置為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時(shí)間1 h、提取次數(shù)1次。

表1 茯神提取總?cè)茊我蛩卦囼?yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.3 茯神總?cè)铺崛÷蕛?yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)總?cè)铺崛〉挠绊懸蛩剡M(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，進(jìn)行分析，研究茯神總?cè)频淖罴烟崛」に嚒Ｔ囼?yàn)中茯神總?cè)铺崛÷实母饔绊懸蛩嘏c其對(duì)應(yīng)的水平編碼設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面法分析因子及水平表

1.2.4 總?cè)坪康臏y(cè)定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取5.0 mg干燥的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，稀釋至刻度搖勻，即為質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精確吸取0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6和0.7 mL該標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5 mL容量瓶中，水浴揮盡溶劑，加0.3 mL新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，于75 ℃反應(yīng)15 min，冰水冷卻，加冰醋酸至刻度，搖勻，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[10]。以齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度與濃度的回歸方程y=72.314x-0.066 4，R2=0.999。結(jié)果表明齊墩果酸在0.002～0.014 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.2 茯神總?cè)频奶崛〖昂繙y(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g茯神粉末，加入一定體積的乙醇溶液，在規(guī)定溫度下超聲提取一定時(shí)間后，減壓過濾，定容至25 mL容量瓶中，吸取2 mL，按照1.2.4.1測(cè)定樣品吸光度，按式（1）計(jì)算總?cè)频寐蔥14]。

采用單因素試驗(yàn)考察超聲時(shí)間、超聲次數(shù)、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茯神總?cè)铺崛÷实挠绊?，依?jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素水平范圍，利用Design-Expert 8.0為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Sun FireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），以乙腈（A）和水（B）作為液相色譜流動(dòng)相，洗脫方式為梯度洗脫。流動(dòng)相梯度程序：0～20 min，50%～80% A，20～35 min，80%～92% A，35～42 min，92% A，42～52 min，92%～95% A，52～57 min，95% A，57～90 min，95%～100% A；流速：0.3 mL/min；波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。

1.2.6 UPLC-Q-Exactive條件

高效液相色譜選擇二元線性梯度洗脫：流動(dòng)相A為0.2%醋酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。流動(dòng)相梯度程序：樣品進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃。液相色譜二極管陣列檢測(cè)器（DAD）通過三通閥與質(zhì)譜連接，質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源（ESI），分析模式為負(fù)離子模式；掃描范圍m/z100～1000；離子肼條件：離子源噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣輔助氣為氮?dú)猓魉贋?0 L/min，離子肼壓力為3.1×107Pa；金屬毛細(xì)管溫度為350 ℃，金屬毛細(xì)管電壓為3.5V。

1.2.7 乳酸脫氫酶抑制劑活性測(cè)定

20 μL 50 mg/mL樣品溶液分別與90 μL 0.2 U/mL乳酸脫氫酶、0.5 U/mL乳酸脫氫酶、1.0 U/mL乳酸脫氫酶，在100 μL PBS緩沖溶液37 ℃水浴鍋中孵育30 min，將未結(jié)合的小分子與結(jié)合的復(fù)合物通過超濾膜分離。在室溫下，用超濾膜過濾（YM-30000 Da）并離心（12000×g）10 min。加入100 μL 50%甲醇水溶液（50∶50，V/V，pH 3.30）沖洗結(jié)合的化合物，通過離心機(jī)離心10 min，若膜上還殘留有結(jié)合的復(fù)合物，則重復(fù)上一步驟?？瞻捉M試驗(yàn)用相同體積的PBS緩沖溶液替代酶，其他條件與試驗(yàn)組相同，最后得到的溶液用高效液相色譜檢測(cè)。

增強(qiáng)因子反映了三萜類物質(zhì)與乳酸脫氫酶的結(jié)合能力的大小[15]。樣品對(duì)酶的增強(qiáng)因子按式（2）計(jì)算。

式中：A1為與乳酸脫氫酶結(jié)合的化合物的吸光度；A2為未與乳酸脫氫酶結(jié)合的化合物初始的吸光度。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

稱取1.0 g茯神粉末，分別加入20 mL 60%，70%，80%，90%和95%乙醇，超聲提取1 h，提取1次，離心，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總?cè)铺崛÷?，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

如圖2所示，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率呈現(xiàn)出先增大而后逐漸下降的趨勢(shì)，在70%時(shí)提取率達(dá)到最高。主要原因可能是增大乙醇體積分?jǐn)?shù)可以促使細(xì)胞溶脹，有利于提取劑向細(xì)胞內(nèi)部的滲透，從而提高總?cè)频奶崛÷?。但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，導(dǎo)致溶液體系的極性下降，使茯神中的醇溶性與脂溶性雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶劑，水溶性三萜不易溶出，導(dǎo)致總?cè)铺崛÷食尸F(xiàn)出下降的趨勢(shì)。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為最佳提取體積分?jǐn)?shù)。

2.1.2 料液比對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

稱取1.0 g茯神粉末，分別加入10，15，20，25和30 mL 70%乙醇，超聲提取1 h，離心，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總?cè)铺崛÷?，料液比與總?cè)铺崛÷实年P(guān)系如圖3所示。

由圖3可知，隨溶劑用量的增加，總?cè)频奶崛÷氏鄳?yīng)增高，由于溶劑用量增加，藥材與溶劑接觸面積增大，并且能夠增大固液濃度差，有利于擴(kuò)散速度的提高。當(dāng)溶劑用量大于15 mL時(shí)，總?cè)频奶崛÷试龈呲厔?shì)變緩，為避免溶劑浪費(fèi)，料液比選擇1∶15（g/mL）。

圖3 料液比對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

稱取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，分別超聲提取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，離心，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總?cè)铺崛÷?，超聲時(shí)間與總?cè)铺崛÷实年P(guān)系如圖4所示。

由圖4可知，超聲波在較短時(shí)間內(nèi)能夠?qū)蛏窨側(cè)七M(jìn)行充分的提取，超聲時(shí)間越長(zhǎng)，總?cè)铺崛÷试礁?。但超過1 h，總?cè)铺崛÷试龃缶徛?，可能由于超聲時(shí)間過長(zhǎng)，其他物質(zhì)也會(huì)溶出，在提取溶劑量不變的情況下會(huì)影響三萜物質(zhì)的溶出。故超聲時(shí)間選取1 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)三萜提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)三萜提取率的影響

稱取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，超聲提取1.0 h，分別提取1，2，3和4次，離心，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定樣品吸光度，計(jì)算總?cè)铺崛÷?，超聲時(shí)間與總?cè)铺崛÷实年P(guān)系如圖5所示。

由圖5可知，隨提取時(shí)間的增加，總?cè)频奶崛÷氏鄳?yīng)增高，可能是提取次數(shù)增加，可以使藥材與溶劑接觸面積增大，提取率不斷增大。當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，總?cè)频奶崛÷试龈呲厔?shì)變緩。為了節(jié)省時(shí)間，提取次數(shù)選取3次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化茯神總?cè)铺崛」に?/h3>

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

響應(yīng)面優(yōu)化茯神總?cè)铺崛≡囼?yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，求得茯神總?cè)铺崛÷剩╕）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時(shí)間（D）的方程：Y=0.54+8.556E-003A+0.028B+0.041D+0.012C+0.012AB-0.02AC+0.026AD+0.019BC+7.937E-003BD-3.313E-003CD-0.023A2-0.064B2-0.055C2+1.586E-004D2。因素的方差分析見表4。

表4 方差分析

由表4可以得出，模型F=40.90，p＜0.000 1，建立的模型極顯著（p＜0.01）。該數(shù)學(xué)模型與茯神總?cè)频膶?shí)際提取率情況擬合良好。對(duì)各因素進(jìn)行綜合分析表明：一次項(xiàng)A、D不顯著，B、C極顯著，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間2個(gè)因素的影響較小，提取次數(shù)對(duì)提取率影響顯著且最大，其次為料液比；交互項(xiàng)基本不顯著，說明4個(gè)因素之間的交互變化影響相對(duì)較小。在超聲提取過程中，各因素對(duì)總?cè)铺崛〉寐视绊懙娜S響應(yīng)面如圖6所示。

圖6 茯神總?cè)瞥曁崛№憫?yīng)面圖

由圖6可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，三萜提取率先升高后降低，這可能的原因是：其他醇溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致三萜類組分的溶出量相對(duì)減少，但乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)三萜提取率影響不大；增加提取時(shí)間，能夠提高三萜提取率，但是增加的比例比較緩慢，說明增加提取時(shí)間對(duì)三萜提取率的影響不大；增加料液比和提取次數(shù)，能提高三萜提取率，可能是由于增加料液比與次數(shù)有利于三萜物質(zhì)的溶出。

2.2.2 最佳提取工藝的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 8.0建立的數(shù)學(xué)模型確定優(yōu)化后的茯神總?cè)铺崛」に嚄l件：乙醇提取體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間1 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下，模型推測(cè)提取率為1.98%。對(duì)優(yōu)化后的茯神總?cè)铺崛」に嚄l件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，茯神總?cè)铺崛÷蕿?.106%±0.002%，符合預(yù)期結(jié)果。

2.3 茯神三萜提取物對(duì)乳酸脫氫酶的抑制作用

20 μL茯神提取物溶液（50 mg/mL）未與乳酸脫氫酶結(jié)合的對(duì)照組以及分別與20 μL不同活度乳酸脫氫酶（0.2，0.5和1.0 U/mL）結(jié)合的試驗(yàn)組的液相色譜圖如圖7所示。

圖7 茯神石油醚層提取物與乳酸脫氫酶結(jié)合的HPLC圖

圖7表明，茯神提取物中有4個(gè)成分可以與0.2，0.5和1.0 U/mL乳酸脫氫酶結(jié)合。分別對(duì)比各液相色譜峰面積，考察化合物與乳酸脫氫酶的結(jié)合能力。結(jié)果表明：化合物1，2，3和4對(duì)0.5 U/mL乳酸脫氫酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，特別是化合物3抑制酶活性效果顯著?；衔?，2，3和4與不同濃度的乳酸脫氫酶的增強(qiáng)因子如表5所示。

表5 茯神提取物與乳酸脫氫酶結(jié)合強(qiáng)度表 單位：%

綜上，茯神提取物中化合物1，2，3和4與乳酸脫氫酶具有生物親和能力，對(duì)乳酸脫氫酶有一定的抑制作用，具有潛在的抗腫瘤的活性。各化合物對(duì)乳酸脫氫酶抑制效果強(qiáng)弱順序?yàn)檐蜍咚幔ɑ衔?）＞松苓新酸（化合物4）＞去氫茯苓酸（化合物2）＞3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸（化合物1）。

2.4 應(yīng)用HPLC-ESI-MS分析茯神石油醚層提取物中化學(xué)成分

按1.2.6小節(jié)操作，茯神石油醚層提取物中的化合物得到較好的分離，液相色譜圖如圖8所示。采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)方法，對(duì)液相色譜主要化合物色譜峰相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表6所示。

圖8 茯神石油醚層提取物

表6 茯神石油醚層有效成分的UPLC-Q-Exactive分析

化合物1的保留時(shí)間為37.50 min，在一級(jí)質(zhì)譜中母離子為513.36[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜離子主要碎片是m/z467.35，m/z453.33，m/z451.32和m/z391.30，其中m/z467.35是母離子失去一個(gè)HCOOH產(chǎn)生的，m/z453.33是母離子失去一個(gè)CH3COOH產(chǎn)生的，m/z451.32是母離子失去一個(gè)HCOOH和一個(gè)CH4產(chǎn)生的，m/z391.30是母離子失去一個(gè)CH4、一個(gè)HCOOH和一個(gè)CH3COOH產(chǎn)生的[16]。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸的主要碎片一致，其保留時(shí)間與3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，故推測(cè)為3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸。

化合物2的保留時(shí)間為39.13 min，在一級(jí)質(zhì)譜中母離子為525.34[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜離子主要碎片是m/z509.32，m/z465.34，m/z447.32和m/z355.22，其中m/z509.32是母離子失去一個(gè)CH4產(chǎn)生的，m/z465.34是母離子失去一個(gè)CH3COOH產(chǎn)生的，m/z447.32是母離子失去一個(gè)H2O和一個(gè)CH3COOH產(chǎn)生的，m/z355.22是母離子失去一個(gè)C9H14O2和一個(gè)CH4產(chǎn)生的[17]。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道去氫茯苓酸的主要碎片一致，其保留時(shí)間與去氫茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，故推測(cè)為去氫茯苓酸。

化合物3的保留時(shí)間為39.75 min，在一級(jí)質(zhì)譜中母離子為527.37[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜離子碎片主要是m/z465.34，m/z467.35和m/z405.31，其中m/z465.34是母離子失去一個(gè)CH4和一個(gè)HCOOH產(chǎn)生的，m/z467.35是母離子失去一個(gè)CH3COOH產(chǎn)生的，m/z405.31是母離子失去一個(gè)HCOOH、一個(gè)CH3COOH和一個(gè)CH4產(chǎn)生的[18]。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道茯苓酸主要碎片一致，其保留時(shí)間與茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，故推測(cè)為茯苓酸。

化合物4的保留時(shí)間為49.12 min，在一級(jí)質(zhì)譜中母離子為453.34[M-H]-，其二級(jí)質(zhì)譜離子碎片主要是m/z435.27和m/z337.33，其中m/z435.27是母離子失去一個(gè)H2O產(chǎn)生的，m/z337.33是母離子失去兩分子CH4以及C24雙鍵麥?zhǔn)现嘏藕蟮漠a(chǎn)物[19-20]。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道松苓新酸主要碎片一致，其保留時(shí)間與松苓新酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，故推測(cè)為松苓新酸。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將茯神總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化，建立可較為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)茯神總?cè)铺崛÷实臄?shù)學(xué)模型。各變量因素的影響強(qiáng)度：提取次數(shù)（C）最大，其次為料液比（B），乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和提取時(shí)間（D）影響較小。茯神總?cè)铺崛〉淖罴褩l件為乙醇提取體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間1 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶15（g/mL），總?cè)铺崛÷士蛇_(dá)到2.106%±0.002%。

以液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)作為研究方法，根據(jù)負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)茯神石油醚層提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，茯神石油醚層提取物中的化學(xué)成分主要為三萜類化合物。根據(jù)各色譜峰在質(zhì)譜中的分子量和色譜保留時(shí)間，成功鑒定了茯神石油醚層提取物中4種三萜類化合物，分別為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、茯苓酸和松苓新酸。

利用超濾質(zhì)譜法研究茯神石油醚層提取物對(duì)乳酸脫氫酶的抑制作用，結(jié)果表明對(duì)0.5 U/mL乳酸脫氫酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，驗(yàn)證了超濾質(zhì)譜法是研究配體與酶的相互作用快速、靈敏、有效的分析方法。4種三萜類化合物與乳酸脫氫酶均具有生物親和能力，可以抑制乳酸脫氫酶生物活性，具有潛在的抗腫瘤活性。