許子潔 曹子健 胡寶 徐子昕 王晶 鄭素月 王春霞

摘要：為探究低溫誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳菌絲成熟的機(jī)制，為糙皮側(cè)耳在實際栽培與生產(chǎn)中提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，以糙皮側(cè)耳菌株“雙抗黑平”為試驗材料，測定不同溫度誘導(dǎo)處理后糙皮側(cè)耳的出菇情況及菌絲生理指標(biāo)的變化。設(shè)置3種不同溫度處理，分別為對照組（25 ℃）、低溫處理組（17 ℃）、高溫處理組（33 ℃）。結(jié)果表明，經(jīng)低溫17 ℃誘導(dǎo)處理糙皮側(cè)耳后可正常出菇，而25、33 ℃誘導(dǎo)處理后均無原基形成，無法形成子實體。經(jīng)不同溫度誘導(dǎo)處理后，DAB染色顯示處理組中菌絲的染色程度較深。經(jīng)不同溫度誘導(dǎo)處理后，處理組中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量顯著高于對照組（P<0.05），并且33 ℃高溫處理組中各個物質(zhì)的含量最高;丙二醛和相對電導(dǎo)率的變化趨勢基本一致，均是處理組顯著高于對照組（P<0.05）;菌絲中CAT活性的大小依次為33 ℃處理組>17 ℃處理組>25 ℃處理組;高溫處理組菌絲POD活性最高，達(dá)到115.63 U/（g·min），但17 ℃處理組與對照組無明顯差別（P>0.05）;不同溫度誘導(dǎo)處理7 d，對照組中SOD活性最高，然而經(jīng)12 h和24 h處理后，處理組顯著高于對照組。

關(guān)鍵詞：糙皮側(cè)耳;低溫刺激;DAB;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);電導(dǎo)率;保護(hù)酶

中圖分類號：S646.1+41.04 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0133-07

目前，“一葷一素一菇”被稱為最恰當(dāng)?shù)纳攀辰Y(jié)構(gòu)[1]。糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）是食用菌范圍里栽培歷史深遠(yuǎn)、種植廣、發(fā)展快、產(chǎn)量高的菌種，又名平菇、牡蠣菇[2]，良好的市場銷路和豐富的價值，使其成為世界上最受歡迎的食用菌之一[3]。

環(huán)境溫度是調(diào)控食用菌生長發(fā)育最活躍和具有重大意義的因素，食用菌在不一樣的生長階段，對溫度的要求也都不同，菌絲發(fā)育期一般所需溫度較高，而子實體期相對較低。郭勇等分析鳳尾菇、靈芝等菌絲在不同溫度下的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在最適溫度時菌絲生長迅速且顏色濃白、邊緣整齊;當(dāng)溫度降低10 ℃時，菌絲生長速度降低，顏色變淺，邊緣不整齊，菌絲間橫隔較短，鎖狀聯(lián)合密集，菌絲發(fā)育不健全[4]。沈穎越等發(fā)現(xiàn)短時間冷刺激或持續(xù)溫差刺激可使肺形側(cè)耳從營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)化進(jìn)入生殖期[5]。Sakamoto等研究發(fā)現(xiàn)金針菇菌絲在常溫黑暗條件下無法出菇，經(jīng)過13～16 ℃低溫刺激后，金針菇子實體形成[6]。溫嘉偉對白靈側(cè)耳菌絲進(jìn)行 0～4 ℃持續(xù)3～5 d的低溫脅迫，促使原基形成[7]。因此，低溫誘導(dǎo)對食用菌菌絲成熟、原基形成及子實體生長發(fā)育過程都具有重要作用。

糙皮側(cè)耳作為變溫結(jié)實性食用菌之一，需經(jīng)歷復(fù)雜的生化、生理低溫應(yīng)激反應(yīng)，才能促使菌絲成熟，完成營養(yǎng)生長往生殖生長的轉(zhuǎn)變。目前，關(guān)于糙皮側(cè)耳的研究多集中于栽培料[8-9]、不同基質(zhì)及外源添加物[10-11]對平菇生長的影響，對低溫誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳菌絲成熟機(jī)制的研究甚少。本研究以糙皮側(cè)耳菌株“雙抗黑平”為試驗材料，測定低溫誘導(dǎo)處理糙皮側(cè)耳菌絲后出菇情況、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（perxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyd，MDA）等生理指標(biāo)的變化，研究菌絲成熟的生理機(jī)制，為更加深入理解糙皮側(cè)耳菌絲的生長發(fā)育過程，進(jìn)一步為實際栽培生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糙皮側(cè)耳菌株“雙抗黑平”，保存于河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院食用菌研究室。

1.2 培養(yǎng)環(huán)境與方法

本試驗于2020年3月至2021年6月在河北工程大學(xué)食用菌研究室完成。

1.2.1 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，瓊脂粉20.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B 10 mg，1 L水。

1.2.2 菌絲培養(yǎng)

在超凈工作臺中無菌環(huán)境下將待測菌株接種于一次性35 mm小培養(yǎng)皿中，待菌絲長滿后，選取長勢良好的“雙抗黑平”再次重復(fù)接種操作進(jìn)行活化，活化3次后備用;接種直徑5 mm菌絲于鋪有玻璃紙的一次性直徑90 mm培養(yǎng)皿中，25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中暗處理7 d。7 d后，將所有菌絲分3組處理，對照組為25 ℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)7 d，低溫處理組為17 ℃低溫處理7 d，高溫處理組為33 ℃高溫脅迫7 d。然后收集不同溫度處理的菌絲，液氮中速凍，放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２煌瑴囟忍幚淼木z見圖1。

1.3 各項生理指標(biāo)的測定

DAB染色，參照二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine-HC1，DAB）染色檢測法[12]?？捡R斯亮藍(lán)法[13]測可溶性蛋白含量，蒽酮比色法[14]測可溶性糖含量，酸性茚三酮法[13]測游離脯氨酸含量，MDA含量測定使用硫代巴比妥顯色測定法[13]，相對電導(dǎo)率測定參考周冰謙等的方法[15]，3種保護(hù)酶（CAT、POD、SOD）活性測定參考王學(xué)奎的方法[13]進(jìn)行調(diào)整。

1.4 栽培管理

按照玉米芯86%、麥麩10%、石灰3%、石膏1%、含水量60%，裝袋后，高壓滅菌1.5 h，冷卻接種。所有菌棒放置25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，待菌絲長滿料袋后，將料袋隨機(jī)分成3個處理組，分別于17、25、33 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光進(jìn)行培養(yǎng)，濕度控制在80%～90%，原基形成后，每天早、中、晚各噴水1次，當(dāng)子實體分化5～7 d、菌蓋平展、邊沿略有波浪狀時進(jìn)行采摘，標(biāo)記并記錄體質(zhì)量、生物學(xué)效率。

生物學(xué)效率=子實體濕質(zhì)量（g）/培養(yǎng)料干質(zhì)量（g）×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素ANOVA差異顯著性分析，進(jìn)行平均值Duncans多重比較（α=0.05），所有試驗數(shù)據(jù)運(yùn)用Microsoft Excel 2016 統(tǒng)計、計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳出菇的影響

對糙皮側(cè)耳進(jìn)行不同溫度誘導(dǎo)處理后發(fā)現(xiàn)，僅有經(jīng)過17 ℃低溫處理的菌絲才能正常形成原基，其顏色有藍(lán)黑和黑色2種，25、33 ℃處理的菌絲均未有原基產(chǎn)生，從而導(dǎo)致無法出菇。由表1可知，經(jīng)過17 ℃低溫刺激后，原基到子實體的過程顏色由深黑、藍(lán)黑逐漸轉(zhuǎn)為淺黑、灰色，子實體菌蓋直徑在5.199～6.828 cm之間，菌蓋厚度在1.272～1.862 cm之間，菌柄長度在3.851～4.658 cm之間，菌柄直徑在1.540～1.633 cm之間，單朵質(zhì)量范圍在169.4～187.5 g之間，生物學(xué)效率最低62.8%，最高達(dá)82.3%。

2.2 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳菌絲中活性氧（ROS） 的影響

為檢測經(jīng)不同溫度誘導(dǎo)處理后活性氧的積累，用DAB染色檢測了糙皮側(cè)耳菌絲中H2O2和O-2·的水平，由圖2可知，25 ℃處理后菌絲的染色程度較弱，菌絲顏色較淺（圖2-A）;與對照相比較，17 ℃ 和33 ℃誘導(dǎo)處理后的菌絲能觀察到顯著的染色斑點且顏色深，說明溫度對菌絲造成影響會積累H2O2和O-2·，且33 ℃處理后菌絲的顏色更深，提示積累了更多ROS（圖2-B、圖2-C）。

2.3 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

可溶性糖、可溶性蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡的重要物質(zhì)，物質(zhì)含量與提高細(xì)胞液濃度呈正相關(guān)，含量增加可以穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)內(nèi)外平衡，從而增強(qiáng)對脅迫環(huán)境的抵抗能力[16]。不同溫度處理對糙皮側(cè)耳菌絲中可溶性糖含量的影響見圖 3-A，17、33 ℃誘導(dǎo)處理后，可溶性糖含量分別為3.51%和5.98%，顯著高于對照組（P<0.05），可溶性糖含量大幅提高，上升幅度分別為55%及165%。

可溶性蛋白含量的增多有利于抵御外界溫度變化對自身的影響，增加抗逆性[17]。糙皮側(cè)耳菌絲中可溶性蛋白含量在不同溫度處理誘導(dǎo)下的變化趨勢見圖3-B，可溶性蛋白含量變化趨勢與可溶性糖含量變化趨勢基本保持一致，17、33 ℃處理7 d后，菌絲中可溶性蛋白含量與對照組相比較，顯著提高41.94%和66.01%（P<0.05），分別達(dá)到11.93、13.95 mg/g，且33 ℃處理組中可溶性蛋白含量顯著高于17 ℃處理組（P<0.05）。

2.4 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳菌絲中游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸同樣是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[18-19]，脯氨酸作為最大的水溶性氨基酸，是細(xì)胞組織內(nèi)的防凍劑、膜穩(wěn)定劑[20]，可抵御或減緩不同溫度脅迫對細(xì)胞的損傷。糙皮側(cè)耳菌絲中游離脯氨酸含量變化見圖4，不同溫度處理對菌絲中游離脯氨酸含量的影響比較顯著，對照組中游離脯氨酸的含量為0.002 1%，經(jīng)17 ℃和33 ℃誘導(dǎo)處理后，游離脯氨酸含量顯著增加（P<0.05），分別提高230.10%和449.17%。并且33 ℃處理組含量最高，與17 ℃低溫處理相比，游離脯氨酸顯著升高（P<0.05）。

2.5 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳菌絲中丙二醛（MDA）含量和相對電導(dǎo)率的影響

在逆境環(huán)境下，細(xì)胞膜系統(tǒng)是最先遭受傷害，也是最先反應(yīng)的系統(tǒng)[21]。MDA含量與植物抗逆性呈負(fù)相關(guān)[22]，逆境中其含量將會增加。糙皮側(cè)耳菌絲中MDA含量的變化趨勢見圖5-A，MDA含量依次為33 ℃處理組（11.24 μmol/g）>17 ℃處理組（9.54 μmol/g）>25 ℃處理組（7.86 μmol/g），低溫

及高溫誘導(dǎo)處理后，MDA含量均明顯升高（P<0.05），提示遇到外界溫度脅迫時菌絲通過提高M(jìn)DA含量來增強(qiáng)自身的抵抗能力。

環(huán)境脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜透性加大，電解質(zhì)受影響出現(xiàn)紊亂，引起相對電導(dǎo)率變化，并反映了細(xì)胞膜受損程度[23]。相對電導(dǎo)率變化趨勢與MDA基本一致，由圖5-B可知，對照組的相對電導(dǎo)率為33.81%，經(jīng)過不同溫度誘導(dǎo)處理后，菌絲的相對電導(dǎo)率發(fā)生差異性變化，都呈現(xiàn)出明顯上升趨勢（P<0.05），與對照組相比較，17 ℃處理組中相對電導(dǎo)率增幅為60.8%，33 ℃處理組最高 增幅達(dá)到90.2%，說明高溫誘導(dǎo)處理導(dǎo)致菌絲電解質(zhì)外滲嚴(yán)重增加，細(xì)胞膜受損最嚴(yán)重。

2.6 不同溫度誘導(dǎo)處理對糙皮側(cè)耳菌絲中CAT、POD及SOD活性的影響

CAT和POD是植物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分，能有效清除植物體內(nèi)H2O2和其他過氧化產(chǎn)物，避免細(xì)胞膜的過氧化傷害[24]。糙皮側(cè)耳菌絲中CAT活性在不同溫度誘導(dǎo)處理下的變化情況見圖6。由圖6可知，對照組25 ℃條件下CAT活性為 121.36 mg/（g·min）。17 ℃低溫誘導(dǎo)處理后，CAT活性增加了27.21%，達(dá)到154.39 mg/（g·min）。在33 ℃高溫誘導(dǎo)處理后，CAT活性比17 ℃處理組有小幅增加，達(dá)到169.35 mg/（g·min），但比對照組顯著增加（P<0.05），增幅達(dá)39.5%。

糙皮側(cè)耳菌絲中POD活性的變化趨勢如圖7所示，POD活性變化趨勢與CAT基本一致，大小依次為：33 ℃處理組>17 ℃處理組>25 ℃處理組，25 ℃ 條件下POD活性為80.62 U/（g·min），17 ℃低溫誘導(dǎo)使得POD活性增加，但與對照相比較變化不顯著（P>0.05），然而33 ℃高溫誘導(dǎo)處理后，POD活性顯著增加（P<0.05），平均增幅為43.42%，POD活性高達(dá)115.63 U/（g·min），因此推測糙皮側(cè)耳菌絲對高溫更加敏感，當(dāng)遇到高溫脅迫時，細(xì)胞中POD活性能夠達(dá)到相對較高的水平，從而能快速有效清除多余的H2O2和其他過氧化物，使菌絲內(nèi)部的活性氧和氧自由基處于低含量的狀態(tài)，在一定程度上減緩高溫脅迫對菌絲的影響。

SOD同樣是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一[25]，在逆境脅迫下，能有效清除超氧陰離子自由基，起到保護(hù)作用。糙皮側(cè)耳菌絲中SOD活性在不同溫度誘導(dǎo)下的變化情況見圖8，由圖8可知，對糙皮側(cè)耳菌絲進(jìn)行誘導(dǎo)處理7 d后發(fā)現(xiàn)對照組（25 ℃）菌絲中SOD活性最高，達(dá)到1 237.74 U/g，高于17 ℃和33 ℃處理組。這與POD活性的變化趨勢不一致，因此推測可能是在溫度誘導(dǎo)處理時，短時間內(nèi)SOD活性快速上升，導(dǎo)致處理組菌絲中SOD活性顯著高于對照組，隨著處理時間增加，溫度脅迫會對菌絲的生理狀態(tài)產(chǎn)生非常嚴(yán)重的破壞，所以溫度誘導(dǎo)處理7 d后，對照組中SOD活性最高。為了驗證這一猜想，又對菌絲進(jìn)行了12 h和24 h的溫度誘導(dǎo)處理，試驗結(jié)果顯示處理12 h后，處理組中SOD活性顯著高于對照組;處理24 h后33 ℃處理組中SOD活性最高，17 ℃ 處理組與對照組沒有顯著差別，這與推測基本相符。

3 討論與結(jié)論

糙皮側(cè)耳菌絲適宜生長溫度25 ℃，子實體分化需要的適宜溫度為17 ℃左右，是典型的變溫結(jié)實性食用菌。在經(jīng)受環(huán)境溫度改變時，生物體內(nèi)的活性氧、可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸及保護(hù)酶等都與其抗逆性密切相關(guān)。可溶性糖、可溶性蛋白及游離脯氨酸利用其特質(zhì)調(diào)節(jié)含量，維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡[26]，其含量的高低與抗性能力呈正相關(guān)。本研究中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸在高溫及低溫誘導(dǎo)處理下，含量都有明顯升高，且33 ℃高溫組中這些物質(zhì)的含量最高，變化最顯著，提示糙皮側(cè)耳菌絲對高溫更加敏感，表現(xiàn)出對高溫更強(qiáng)的抵抗能力，同時也表明了相對于17 ℃低溫處理，菌絲在高溫處理下遭受到了嚴(yán)重的破壞，因此推測菌絲可能在高溫下受損程度嚴(yán)重，所以導(dǎo)致后期無法形成子實體，造成不出菇的現(xiàn)象。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物之一，是質(zhì)膜受損的重要指標(biāo)[27]。在本研究中菌絲中MDA含量的變化趨勢與相對電導(dǎo)率基本一致，處理組中MDA及相對電導(dǎo)率顯著高于對照組，且33 ℃處理組中最高，本研究結(jié)果也說明了菌絲在高溫下遭受到了相對更加嚴(yán)重的破壞。

當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生溫度變化時，食用菌菌絲內(nèi)部的保護(hù)酶系統(tǒng)會被立即激活，抵御逆境對菌絲的傷害。在17、33 ℃溫度誘導(dǎo)處理后，CAT活性顯著高于對照組25 ℃，且33 ℃處理組最高，說明CAT能快速有效清除多余的H2O2和其他過氧化物，使菌絲內(nèi)部的活性氧和氧自由基處于低含量的狀態(tài)，在一定程度上減緩溫度脅迫對菌絲的影響。POD活性變化趨勢與CAT基本一致，大小依次為：33 ℃處理組>17 ℃處理組>25 ℃處理組，17 ℃低溫誘導(dǎo)使得POD活性增加，與對照相比較增加幅度較低（P>0.05），然而33 ℃高溫誘導(dǎo)處理后，POD活性顯著增加（P<0.05）。SOD活性的變化情況與前兩者有所不同，經(jīng)7 d誘導(dǎo)處理后，不同處理組SOD活性均低于對照組25 ℃。然后又測了另外2個時間點SOD的活性分別是誘導(dǎo)處理12 h和24 h，結(jié)果顯示在不同溫度處理12 h后，SOD活性的大小依次為33 ℃處理組>17 ℃處理組>25 ℃處理組，且33 ℃和17 ℃處理組都顯著高于對照組。繼續(xù)低溫或高溫處理24 h后，SOD活性的變化趨勢沒有太大改變，依然是33 ℃處理組最高，但是低溫處理組即 17 ℃ 誘導(dǎo)處理24 h后，菌絲中SOD活性與對照組相比沒有顯著上升。因此，推測低溫結(jié)實性菇類在溫度脅迫初期反應(yīng)強(qiáng)烈，SOD活性快速上升，尤其是高溫脅迫后快速響應(yīng)，說明高溫對菌絲傷害性更大，但隨著脅迫時間的延長，SOD活性快速增加之后將不再持續(xù)增加，這與管道平、郝海波等的研究結(jié)果[28-29]相似，活性氧在生物體內(nèi)含量的多少，需要整個防御清除系統(tǒng)協(xié)調(diào)合作[30]，部分酶活性的高低不能作為直接判斷因素，植物有利用酶促防御系統(tǒng)，達(dá)到減緩衰老的目的[31]，這可能是SOD酶活性后期出現(xiàn)對照組較高的原因，因此深入透徹了解糙皮側(cè)耳菌絲應(yīng)對溫度脅迫的生理變化過程就需要多層次、多方位、多角度進(jìn)行研究。

綜上所述，研究低溫誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳菌絲成熟時各個生理指標(biāo)變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸）、MDA、相對電導(dǎo)率和抗氧化保護(hù)酶活性（CAT、POD和SOD）均有明顯變化，DAB染色后顏色深淺也顯現(xiàn)氧化脅迫狀態(tài)的不同，且33 ℃高溫處理組的各個物質(zhì)的含量最高，說明菌絲對高溫比較敏感，在高溫下受到更加嚴(yán)重的破壞，同時也表明了低溫誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳菌絲成熟時，不止生理指標(biāo)變化，也需要多種機(jī)制的共同調(diào)控。栽培袋出菇試驗，充分驗證低溫誘導(dǎo)刺激是糙皮側(cè)耳形成子實體的必要條件，這與孔令淼等、孔維威等的研究結(jié)果[32-33]一致。本研究為更加深入理解糙皮側(cè)耳菌絲的成熟機(jī)制及低溫誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳在實際栽培生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

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