高漸飛，周 瑋，文錫梅，楊 艷

（1.貴州科學(xué)院，貴州省山地資源研究所，貴州貴陽 550001；2.貴州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽 550008；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014）

黑老虎（Kadsura coccineaLem.）又名冷飯團(tuán)、布福娜、大葉五味子等，南五味子屬五味子科植物；分布于貴州、廣西、云南等地。其根為常用中藥[1-2]，現(xiàn)代科學(xué)研究顯示，其還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗HIV、保肝等活性作用[3-6]。黑老虎果實(shí)為聚合果，外形奇特、被譽(yù)為“神奇之果”[7]；果肉似荔枝、口味獨(dú)特，單果重100～580 g。近10年來，被作為一種新型水果種植，但果實(shí)可食率較低、果皮較厚（占果重的32%～50%）、種子多（100～210粒，占果重的7%～10%），果肉-種子不易分離[8-9]，不耐貯運(yùn)等嚴(yán)重制約著更進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)果實(shí)和果實(shí)副產(chǎn)物（果皮和種子）進(jìn)行精深加工利用已成為解決其瓶頸的途徑之一[8-10]。果實(shí)中的次生代謝物是主要活性物質(zhì)，決定著品質(zhì)及其加工產(chǎn)品的功能活性[11]，了解其多樣性與富集格局對(duì)下一步的研究與開發(fā)利用非常重要。

當(dāng)前研究顯示，果實(shí)中含蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等近20種氨基酸[9,12-13]，含8種飽和脂肪酸和4種不飽和脂肪酸[14]；維生素C、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖等常規(guī)營養(yǎng)成分及其鈣、鐵、鋅、鎂等微量元素優(yōu)于龍眼、草莓、荔枝等水果[8,12]，證實(shí)果實(shí)有較高的營養(yǎng)和保健價(jià)值。而關(guān)于活性物質(zhì)的鑒定，研究者主要關(guān)注該植物的根莖部位，已鑒定出木脂素和萜類202種[7]。廣泛靶向代謝組學(xué)能通過高通量化學(xué)分析技術(shù)對(duì)生物樣品中代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，已得到廣泛認(rèn)可[14-16]。然而，目前關(guān)于黑老虎果實(shí)不同部位次生代謝物鑒定及其富集差異的研究報(bào)道較少。

本研究以黑老虎果實(shí)為材料，利用廣泛靶向代謝組學(xué)方法，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)，高通量、高靈敏、廣覆蓋檢測果肉、果皮和種子的代謝物，解析其中的次生代謝成分，分析其在不同部位多樣性與富集差異，探究特有和高度富集成分，為在藥食領(lǐng)域開發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑老虎果實(shí) 人工培育的6年植株所結(jié)，栽植于覆蓋80%遮陽網(wǎng)的塑料大棚，定期管理、長勢良好，于2020年10月11日隨機(jī)采摘數(shù)十株成熟果實(shí)，并選果型端正，果大（單果重＞250 g）的作為樣品，采樣地位于貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)普渡村。

SHIMADZU Nexera X2超高效液相色譜儀日本島津公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；SBC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國安捷倫公司；MM 400研磨儀 Retsch。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 果實(shí)經(jīng)自來水洗凈后純凈水沖洗3次，將其分離成小漿果，置于小板上、用手術(shù)刀剖開剝離出果肉、果皮，用砂布包裹揉搓種子使其干凈，分別裝入10 mL離心管中。編號(hào)為果肉KF1-3，果皮KP1-3和種子KD1-3；然后迅速置于液氮中，隨后干冰保存轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將3組供試樣品放置于凍干機(jī)（Scientz-100F）中真空冷凍干燥，用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；準(zhǔn)確稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min渦旋一次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；離心（轉(zhuǎn)速12000 r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中用于分析。

1.2.2 色譜質(zhì)譜采集條件 液相條件：色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：A相為超純水（加入0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)（配備了ESI Turbo離子噴霧接口）檢測電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），由Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex）控制運(yùn)行[17]。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60和25.0 Psi，參數(shù)設(shè)置為高。

1.3 樣本質(zhì)控

質(zhì)控樣本（Quality Control Samples，QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每3個(gè)檢測分析樣本中插入一個(gè)質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于邁維（武漢）生物技術(shù)有限公司MVDB V2.0數(shù)據(jù)庫和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，采用三重四極質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multi Reaction Monitor，MRM）對(duì)代謝物進(jìn)行定量。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，利用軟件Analyst 1.6.3對(duì)物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

根據(jù)正交偏最小二乘法判別模型（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）分析代謝組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步展示各組分之間的差異[18]。評(píng)價(jià)模型的預(yù)測參數(shù)有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測能力，這3個(gè)指標(biāo)越接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2＞0.5時(shí)可認(rèn)為是有效的模型，Q2＞0.9時(shí)為出色的模型?；贠PLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP），選取VIP≥1，fold change≥2 和fold change≤0.5 的代謝物為差異代謝物（Differentially Accumulating Metabolites，DAMs）。

2 結(jié)果與分析

2.1 次生代謝物的多樣性與豐度

在黑老虎果實(shí)中檢測出次生代謝成分共307個(gè)，其中果皮含272個(gè)、果肉286個(gè)、種子201個(gè)，3個(gè)部位相同180個(gè)。基于結(jié)構(gòu)配置對(duì)其進(jìn)行歸類，數(shù)量上以酚酸類化合物最多，占38.8%；其余依次是黃酮（27.7%）、木脂素和香豆素（13.4%）、萜類（10.4%）、生物堿（5.2%）、單寧（4.6%）。種子中酚酸、黃酮和萜類化合物數(shù)量明顯低于果肉和果皮，導(dǎo)致其次生代謝物多樣性不如二者（圖1）。

圖 1 黑老虎果實(shí)不同部位（果肉、果皮、種子）次生代謝物分布Fig.1 Distribution of secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

通過值峰積累分析（圖2），次生代謝物豐度在3個(gè)部位呈現(xiàn)出明顯差異，果皮中豐度高達(dá)81.62×107，分別是果肉（25.61×107）和種子（24.38×107）的3倍多。這得益于果皮中類黃酮的高度富集，生物堿顯著上調(diào)，同時(shí)酚酸、單寧和萜類也都向上表達(dá)。黃酮類的顯著積累及酚酸的上調(diào)可能是果皮的一些活性，如抗氧化、抑菌和抑酶優(yōu)于果肉和種子的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。而果皮中積累了不少單寧，可能是口感苦澀的原因之一。

2.2 差異代謝組分

2.2.1 主成分分析 通過對(duì)樣本進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），判別黑老虎果肉（KF1-3）、果皮（KP1-3）、種子（KD1-3）各樣本組之間及組內(nèi)次生代謝物變異度大小。樣本PCA得分圖（圖3）顯示LC-MS分析所得原始數(shù)據(jù)在 PC1、PC2 兩種主成分中得到良好地呈現(xiàn)。在圖中，第1主成分的貢獻(xiàn)率為68.5%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為24.3%，代表2個(gè)主成分能夠基本反映檢測樣的主要特征信息；樣本表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明對(duì)各樣本數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，各樣本間存在明顯差異。

圖 2 黑老虎果實(shí)不同部位（果肉、果皮、種子）次生代謝物豐度Fig.2 Abundance of the secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

圖 3 樣本 PCA 得分圖Fig.3 PCA score chart of total samples

2.2.2 OPLS-DA結(jié)果 為了鑒別出具體有哪些組分造成了分離現(xiàn)象，建立黑老虎果皮與果肉（KF vs KP）、果肉與種子（KF vs KD）之間的2組OPLS-DA 模型。2組比較OPLS-DA驗(yàn)證結(jié)果顯示，模型具有很好的預(yù)測能力和可靠性，能夠很好地表現(xiàn)各組間代謝物的變化趨勢；對(duì)OPLS-DA 模型進(jìn)行 200 次排列驗(yàn)證，模型有意義（表1），可根據(jù) VIP 值分析篩選其DAMs。

表1 2組比較的OPLS-DA 模型驗(yàn)證值Table 1 The calculated OPLS-DA model values of the two pairwise groups

2.2.3 差異組分 根據(jù)DAMs選擇標(biāo)準(zhǔn)，KF vs KP篩選到175個(gè)DAMs， KF vs KD 有236個(gè)DAMs，2對(duì)照組中的DAMs都主要為酚酸和類黃酮。由于來自酚酸、木脂素和香豆素、萜類的DAMs數(shù)量遠(yuǎn)多于KF vs KP，這使得KF vs KD有更多數(shù)量的DAMs。KF vs KP 中的DAMs以上調(diào)模式占主導(dǎo)，而KF vs KD中則以下調(diào)為主。2對(duì)照組中都為DAMs 的有129個(gè)，其中類黃酮數(shù)量最多（47個(gè)）、酚酸次之（37個(gè)）（表2）。由此可知，黑老虎果皮、果肉和種子之間顯著差異的代謝組分主要為類黃酮和酚酸成分。

表2 差異代謝物組成Table 2 Number of differentially accumulated metabolites and classes

2.3 特征和高度富集成分

2.3.1 木脂素 木脂素類成分認(rèn)為是五味子屬植物的主要藥效成分，是五味子屬植物的重要化學(xué)標(biāo)志物[20]。在黑老虎果實(shí)中共鑒定出木脂素類化合物36個(gè)，其中種子中最多（31個(gè)），果肉居中（26個(gè)），果皮最少（19個(gè)），3個(gè)部位共有14個(gè)（表3）。木脂素在3個(gè)部位的富集量差異較大，在果皮中豐度為2.09×107，果肉下降至0.70×107，在種子顯著上調(diào)達(dá)19.08×107。積累量較高的代謝物多來自種子（有的屬種子特有），且多個(gè)被證實(shí)具有重要活性作用。如狹葉南五味子素 E、狹葉南五味子素 G對(duì)HIV-1有抑制活性[21]，日本南五味子木脂素G具有抗NO生成活性[22]，Kadusurain C對(duì)4種人腫瘤細(xì)胞（A549、HCT116、HL-60和HepG2）具有抗增殖作用[23]，日本南五味子木脂素 C對(duì)HepG-2人肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50值為9.92 μmol/L[24]。

表3 黑老虎果實(shí)不同部位（果肉、果皮、種子）木脂素成分及豐度Table 3 Abundance of lignans detected in in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

2.3.2 類黃酮 黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，是藥用植物的主要活性成分之一，具有多種生物活性和藥理作用，在藥物開發(fā)和食品保健領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。在黑老虎果實(shí)中鑒定出類黃酮85個(gè)，果肉、果皮和種子分別含71個(gè)、85個(gè)和52個(gè)，3個(gè)部位共有51個(gè)。類黃酮在果皮中高度富集，豐度高達(dá)46.88×107，分別是果肉（6.29×107）和種子（0.29×107）的7倍和159倍。進(jìn)一步將類黃酮分為查耳酮、二氫黃酮、黃酮醇、黃烷醇類、花青素、黃酮、黃酮醇、黃酮碳糖苷8個(gè)亞類（表4），其中，黃酮和黃酮醇數(shù)量超過其他6類之和。果肉和果皮中黃酮醇和花青素?cái)?shù)量大幅度多于種子，這使得其類黃酮多樣性更豐富。而花青素、黃酮醇、黃酮、黃烷醇類在果皮中顯著向上積累，從而使果皮富含類黃酮；同時(shí)，由于它們在3個(gè)部位中富集不均衡，導(dǎo)致其黃酮類成分豐度呈現(xiàn)顯著差異。

表4 黑老虎果實(shí)不同部位（果肉、果皮、種子）類黃酮成分及豐度Table 4 Abundance of flavonoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

續(xù)表3

續(xù)表4

進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，類黃酮在3個(gè)部位中豐度差異主要是受槲皮素、兒茶素和矢車菊素類成分的向上或向下積累影響。這些成分在果皮中高度富集，尤其槲皮素及衍生物積累量分別是果肉和種子的100和1000余倍。槲皮素、兒茶素雖然造成口感苦澀，但其有重要活性作用。據(jù)報(bào)道，槲皮素及衍生物具有優(yōu)異的抗氧化特性，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥、肝臟疾病、心血管疾病、細(xì)菌和真菌感染、抗癌等疾病中具有重要藥理作用[25-27]，對(duì)維持人體健康至關(guān)重要。兒茶素具有抗炎癥、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，還可預(yù)防心腦血管疾病，以及保護(hù)腎臟、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等[28-31]。表明，黑老虎果皮作為生物類黃酮原料，具有較高潛在利用價(jià)值。

2.3.3 萜類 黑老虎因含有結(jié)構(gòu)多樣和新穎的三萜，從而廣受關(guān)注[7]。在果實(shí)中鑒定出的32個(gè)萜類化合物，含倍半萜、二萜、萜類、倍萜、三萜和三萜皂苷6個(gè)亞類，其中三萜數(shù)量最多（24個(gè)）。果皮（30個(gè)）和果肉（28個(gè)）中的數(shù)量遠(yuǎn)高于種子（14個(gè)），主要因含有更多數(shù)量的三萜（表5）。同時(shí)，受三萜表達(dá)量下調(diào)的影響，萜類化合物在果皮（2.94×107）、果肉（1.80×107）、種子（1.31×107）中的豐度逐漸下降。鑒定出的萜類化合物中Kadcoccilactone A積累量最高，但僅種子中含有；其余富集較高的還有南五味子酸 D、Kadcoccitone C、Kadcotrione A等。此外，三個(gè)部位中都鑒定出Kadcoccilactone Q和Kadcoccilactone U，據(jù)報(bào)道這類結(jié)構(gòu)新穎的三萜化合物只在黑老虎植物中發(fā)現(xiàn)過[32]。Liang等[33]報(bào)道kadcotrione A和具有抗HIV-1活性，EC50值為47.91 μg/mL；kadcoccitone B顯示出抗HIV活性，EC50值為30.29 μg/mL[34]；kadcoccinone C對(duì)6種人類癌癥細(xì)胞系（HL-60、SMMC7721、A-549、MCF-7、SW-480和Hela）具有細(xì)胞毒活性[35]。同樣表明黑老虎果實(shí)中萜類化合物具有明顯的研究和利用價(jià)值。

表5 黑老虎果實(shí)不同部位（果肉、果皮、種子）萜類成分及豐度Table 5 Abundance of terpenoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

3 結(jié)論

利用超高效色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在黑老虎果實(shí)中共檢測出307個(gè)次生代謝物，數(shù)量上以酚酸和黃酮類占主導(dǎo)。果皮、果肉和種子次生代謝物多樣性和豐度呈現(xiàn)出明顯差異，果肉和果皮中酚酸、類黃酮（黃酮醇和花青素）、三萜化合物（三萜）數(shù)量高于種子，從而使其多樣性優(yōu)于種子。類黃酮（花青素、黃酮醇、黃酮、黃烷醇）在果皮中高度富集，生物堿上調(diào)，使其次生代謝物豐度遠(yuǎn)高于果肉和種子。3個(gè)部位顯著差異代謝組分主要為酚酸和黃酮類化合物。

果皮中根皮素及衍生物、兒茶素及衍生物和花青素等類黃酮化合物高度富集，種子中則積累了較高的木脂素，這兩個(gè)部位都分別含有多個(gè)獨(dú)特成分；此外，果皮、果肉和種子中都鑒定出一些結(jié)構(gòu)新穎的三萜化合物。這些高度富集和特有成分具有較高利用價(jià)值。由于次生代謝物受植物生長微環(huán)境及外界復(fù)雜環(huán)境等綜合影響，今后還需擴(kuò)大測試樣本，如增加不同產(chǎn)地、不同種植模式和方式、不同樹齡等的比較分析，為黑老虎果實(shí)的開發(fā)和利用提供參考。