郭香，吳碩，鄭明揚，陳德奎，鄒璇，陳曉陽，周瑋，張慶

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510642）

甘蔗（Saccharum officinarum）是熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種經(jīng)濟作物，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，在中國南方地區(qū)廣泛種植［1?2］。甘蔗梢是一種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，經(jīng)常被焚燒，除了資源浪費外，還會造成環(huán)境污染。青貯是保存潮濕作物、延長儲存時間和改善飼料適口性的常用方法，這種方法是厭氧條件下的乳酸（lactic acid，LA）發(fā)酵［3］。然而，青貯過程中甘蔗梢大量的可溶性碳水化合物和酵母菌的存在會促進以酒精發(fā)酵為主導(dǎo)，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)和干物質(zhì)的損失，從而降低青貯飼料的有氧穩(wěn)定性［4?8］。因此，甘蔗梢青貯普遍表現(xiàn)出發(fā)酵品質(zhì)差、營養(yǎng)價值低、有氧穩(wěn)定性差的特點?；旌锨噘A是提高甘蔗梢青貯發(fā)酵性能和營養(yǎng)價值的有效方法。

黃梁木（Neolamarckia cadamba）原產(chǎn)于南亞和東南亞，是一種著名的多功能植物，廣泛分布于我國廣東、廣西、云南等省份。由于其產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高和抗菌強的特性，最近已開始作為木本飼料被廣泛栽培［9?10］。在黃梁木葉（N. cadambaleaves，NCL）青貯期間很少發(fā)生蛋白質(zhì)水解，并且飼喂青貯NCL 可以有效改善動物的生長性能和質(zhì)量［10］。在苜蓿（Medicago sativa）和柱花草（Stylosanthes guianensis）青貯過程中添加NCL 顯著提高了其粗蛋白（crude protein，CP）和真蛋白（true protein，TP）含量，顯著降低了非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）和氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量［11］。因為NCL 在青貯過程中具有抗菌和抗真菌特性，可能會直接影響青貯飼料中酵母菌和霉菌等不良微生物的活性［12?13］。到目前為止，還沒有在青貯中添加NCL 是如何影響其有氧穩(wěn)定性的研究。

殼寡糖（chitosan oligosaccharides，CO）是殼聚糖或甲殼素脫乙酰基水解而成的功能性低聚糖和天然堿性氨基葡萄糖聚合物［14］。它們與其他功能性糖一樣，對腸道細菌有積極的調(diào)節(jié)作用，被認為是動物生產(chǎn)中抗生素的替代品［15］。在動物日糧中添加CO 可以改善其生長性能、抗氧化能力、腸道形態(tài)和屏障功能以及免疫力［16?18］。Yang等［19］的研究結(jié)果表明，日糧中添加CO 能促進斷奶仔豬的生長性能和腸道屏障功能，增加雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量。CO 的突出生物活性包括抗菌、抗真菌和抗腫瘤活性［17］。楊煥蝶等［20］研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能抑制大腸桿菌的活性，且較低的乙酰度和pH 值使殼聚糖的抑菌活性更強。Jaime 等［21］報道CO 可以破壞真菌細胞，因為它們增加了細胞膜的通透性。此外，一些研究表明，當(dāng)聚合度為31～54 時，CO 對酵母菌的抑制活性最強［22］。因此，CO 可能改善青貯過程中的有氧穩(wěn)定性。

使用具有抗菌活性的添加劑可以抑制酵母菌和霉菌的生長，從而減少發(fā)酵損失，提高有氧穩(wěn)定性。本試驗旨在研究NCL 和CO 對甘蔗梢青貯發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響，以此改進甘蔗梢青貯的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 原料及青貯制劑

甘蔗和黃梁木在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（廣州市，北緯23.24°，東經(jīng)113.64°）試驗田種植，2019年12月22日收獲。立即用切割機將植株材料切成2 cm 左右，然后混合均勻，甘蔗梢與NCL 按鮮重比為100∶0、85∶15 和70∶30 的比例添加，添加或不添加CO（1%鮮料，fresh matter，F(xiàn)M），分別得到以下添加處理：無添加（control，CK）、15%NCL、30%NCL、CO、15%NCL+CO 和30%NCL+CO，共6 個處理組?；旌暇鶆蚝?，分裝到塑料袋中，每袋約210 g，立即用真空封口機封口。共6 組，每組包括7 個重復(fù)，在室內(nèi)溫度（15～30 ℃）下保存。210 d 后，對青貯飼料進行發(fā)酵特性、化學(xué)成分、微生物種群和有氧穩(wěn)定性分析。

1.2 有氧穩(wěn)定性測定

隨機抽取甘蔗梢發(fā)酵210 d 后的2 個塑料袋，共取400 g 原料混合均勻，松散放入18 個16 cm×15 cm、2 L 容積的實驗塑料桶中。用一層聚乙烯塑料薄膜覆蓋桶，扎出氣孔，不僅可以讓空氣自由滲透青貯，還有助于防止干燥和污染［23?24］。將所有桶放入90 cm×50 cm×60 cm 的紙箱中。使用溫度記錄儀（SMOWO MDL-1048A，上海天河自動化儀表有限公司）連續(xù)7 d 每10 min 測量1 次室溫和每個桶的溫度。之后，從每個桶中抽取樣品進行化學(xué)、微生物和有氧穩(wěn)定性分析。在本研究中，有氧穩(wěn)定性是指青貯在高于環(huán)境溫度超過2 °C 之前保持穩(wěn)定的小時數(shù)［24］。

1.3 微生物種群和化學(xué)成分分析

將青貯前、青貯第210 天和有氧暴露之后的20 g 樣品分別與180 mL 無菌生理鹽水溶液混合并逐層稀釋，進行微生物數(shù)量的測定。采用Wang 等［25］的方法測定乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、大腸桿菌、酵母菌和霉菌數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony forming unit，cfu）表示，即每克鮮料中活微生物的數(shù)量。從塑料袋中隨機抽取20 g 青貯樣品，加入180 mL 蒸餾水，在4 ℃條件下貯藏18 h 后取出，進行青貯飼料的pH 值、NH3-N 和有機酸含量的測定。按照萬學(xué)瑞等［26］的方法，用4 層紗布及定性濾紙過濾之后立即使用玻璃電極pH 計（PHS-3C，INESA 科學(xué)儀器有限公司，中國上海）測定pH 值。采用Broderick 等［27］的方法測定NH3-N 的含量。根據(jù)Wang等［25］的方法，采用島津GC-14 型高效液相色譜儀（Shodex Rspak KC-811s-DVB gel column 色譜柱，SPD-M10AVP檢測器，日本）測定乳酸（LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）等有機酸含量。將青貯料在65 °C 烘干48 h 測定干物質(zhì)（dry matter，DM）含量，樣品用研磨機粉碎，密封袋保存。使用凱氏氮分析儀（K-9860，中國北京）測定粉碎原料和青貯樣品的CP 含量［28］。采用Licitra 等［29］的方法分析NPN 和TP 含量。采用袁纓［30］的方法分析中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和可溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0 軟件進行雙因素方差分析，有統(tǒng)計學(xué)意義的閾值為P＜0.05。所有微生物計數(shù)數(shù)據(jù)均經(jīng)log10變換。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前甘蔗梢的化學(xué)特性和微生物種群組成

鮮甘蔗梢的干物質(zhì)含量為33.0%，粗蛋白含量為6.1%DM（表1）。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和可溶性碳水化合物含量分別為71.72%DM、37.25%DM 和5.69%DM。乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)分別為3.98、3.77、3.59 log10cfu·g?1FM，大腸桿菌數(shù)量低于最低檢測值3.00 log10cfu·g?1FM。

表1 青貯前鮮甘蔗梢化學(xué)成分及微生物數(shù)量Table 1 Chemical composition and microbial populations of fresh sugarcane top prior to ensiling（mean±SD，n=3）

2.2 甘蔗梢青貯的青貯品質(zhì)和微生物數(shù)量

表2 顯示了青貯后甘蔗梢的發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量。添加CO 后，乳酸和乙酸含量極顯著降低（P＜0.01），LAB 數(shù)量極顯著增加（P＜0.01）。無論是否添加CO，添加NCL 處理的pH 均顯著降低（P＜0.05），這與其較高的乳酸含量和較低的LAB 數(shù)量相一致。所有處理組均未檢出丙酸和丁酸。NCL 處理顯著降低了中性洗滌纖維（P＜0.01）和酸性洗滌纖維含量（P＜0.05）。霉菌、酵母菌和大腸桿菌的數(shù)量均低于2.00 log10cfu·g?1FM。表3 顯示了青貯后甘蔗梢的蛋白組分。NCL 處理極顯著提高了粗蛋白和真蛋白含量（P＜0.01），極顯著降低了非蛋白氮和氨態(tài)氮含量（P＜0.01）。30%NCL+CO 處理的粗蛋白和真蛋白含量顯著高于CO 和15%NCL+CO 處理（P＜0.05）。

表2 混合黃梁木葉添加和不添加殼寡糖對甘蔗梢青貯210 d 發(fā)酵參數(shù)和微生物數(shù)量的影響Table 2 Effect of mixing N. cadamba leaves on fermentation parameters and microbial populations of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides for 210 days

表3 混合黃梁木葉添加和不添加殼寡糖對甘蔗梢青貯210 d 蛋白組分的影響Table 3 Effect of mixing N. cadamba leaves on the protein fractions of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides for 210 days

2.3 有氧暴露后甘蔗梢青貯的發(fā)酵特性和蛋白質(zhì)組成

有氧暴露7 d 后，甘蔗梢青貯的發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量如表4 所示。添加CO 后，甘蔗梢青貯的干物質(zhì)含量極顯著增加（P＜0.01）。加入NCL 后，pH 值顯著降低（P＜0.05），乳酸含量極顯著升高（P＜0.01）。所有處理組均未檢出丙酸和丁酸。單獨添加CO 和NCL 或組合添加后，甘蔗梢青貯中LAB 的數(shù)量極顯著增加（P＜0.01）。30%NCL 處理的酵母菌數(shù)量最多，添加CO 后酵母菌數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。僅在對照組中檢出霉菌，大腸桿菌數(shù)量均低于2.00 log10cfu·g?1FM。表5 顯示了NCL 和CO 對有氧暴露7 d 后甘蔗梢青貯蛋白質(zhì)組分的影響。添加NCL 后，甘蔗梢青貯的粗蛋白和真蛋白含量極顯著增加（P＜0.01），NPN 和NH3-N 含量極顯著降低（P＜0.01）。30%NCL 和30%NCL+CO 處理的NH3-N 含量均顯著低于其他處理（P＜0.05），其中30%NCL 處理的NH3-N 含量最低。

表4 混合黃梁木葉添加殼寡糖和不添加殼寡糖對甘蔗梢青貯有氧暴露7 d 后發(fā)酵參數(shù)和微生物種群的影響Table 4 Effect of mixing N. cadamba leaves on fermentation parameters and microbial populations of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides after aerobic exposure for 7 days

表5 混合黃梁木葉添加殼寡糖和不添加殼寡糖對甘蔗梢青貯有氧暴露7 d 后蛋白組分的影響Table 5 Effect of mixing N. cadamba leaves on the protein fractions of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides after aerobic exposure for 7 days

2.4 青貯甘蔗梢添加NCL 和CO 的有氧穩(wěn)定性

表6 顯示了NCL 和CO 對甘蔗梢青貯有氧穩(wěn)定性的影響。15%NCL+CO 處理的有氧穩(wěn)定性最高，其次是30%NCL+CO 和30%NCL 處理。在有氧暴露7 d 內(nèi)，15%NCL+CO 處理在青貯過程中沒有發(fā)生有氧腐爛。最高溫度以15%NCL 和15%NCL+CO 處理同時達最低（31.0 ℃）。30%NCL+CO 處理達到最高溫度所需時間（172 h）最長。添加NCL（P＜0.05）和CO 可提高甘蔗梢青貯的有氧穩(wěn)定性。

表6 混合黃梁木葉和殼寡糖對甘蔗梢青貯有氧暴露期間有氧穩(wěn)定性、最高溫度和達到最高溫度時間的影響Table 6 Effects of mixing N. cadamba leaves and chitosan oligosaccharides on the aerobic stability，maximum temperature and time to the maximum temperature of sugarcane top silage during aerobic exposure

3 討論

3.1 青貯前甘蔗梢鮮料的化學(xué)特性和微生物種群組成

甘蔗梢作為飼用牧草，具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。本研究中甘蔗梢的粗蛋白和干物質(zhì)含量低于高雨飛等［31］的結(jié)果，因甘蔗梢纖維含量較高，降低了其適口性。NCL 是一種新興的蛋白質(zhì)飼料（10.7%DM），且中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別為23.7%DM 和15.6%DM［11］。因此，推測添加NCL 可以提高甘蔗梢青貯的蛋白質(zhì)含量和飼料消化率。可溶性碳水化合物是衡量青貯飼料品質(zhì)的重要參數(shù)，甘蔗梢的可溶性碳水化合物含量（5.69%DM）低于保存良好青貯的理論要求（6%～7%DM）［32］，可能的原因包括甘蔗品種、地理位置和氣候的差異。微生物種群的初始豐度是青貯發(fā)酵的另一個決定因素，甘蔗梢的初始乳酸菌計數(shù)低于5.00 log10cfu·g?1FM，這不利于大規(guī)模的乳酸發(fā)酵［3］。酵母菌和霉菌的豐度與乳酸菌的豐度相近，可能會阻礙乳酸菌的快速繁殖，從而降低青貯品質(zhì)。因此，可以添加NCL、CO 等添加劑來提高甘蔗梢青貯的發(fā)酵質(zhì)量。

3.2 不同處理對甘蔗梢青貯發(fā)酵質(zhì)量的影響

青貯是一種長期保存飼料的儲存方法，可以減少其養(yǎng)分損失，同時促進動物體內(nèi)養(yǎng)分的消化吸收［7］。pH 值可用來評價青貯過程中的發(fā)酵程度和青貯品質(zhì)。在本研究中，NCL 處理降低了pH 值，增加了乳酸含量。pH 值降低可以抑制不良微生物的繁殖，減少蛋白質(zhì)降解，改善牧草保存［33］。Wang 等［11］報道稱，NCL 能抑制梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌等有害微生物的生長，能有效改善高水分苜蓿和柱花草的青貯品質(zhì)。本研究表明NCL 還能增加乙酸含量（P＞0.05），但Wang 等［13］發(fā)現(xiàn)，在NCL 處理下，乙酸含量顯著降低。然而研究表明在缺糖情況下，產(chǎn)乙酸的細菌在長時間的青貯中能將乳酸代謝成乙酸［34］。在本研究中，青貯飼料的pH 值的降低和乳酸菌的快速繁殖，抑制了青貯中梭狀芽孢桿菌等不良微生物的生長。與He 等［35］的觀點一致，NCL 青貯中未檢測到丁酸，有效抑制了梭狀芽孢桿菌的繁殖。NCL 和CO 處理中纖維含量的降低可以改善甘蔗梢的適口性和消化率，未檢出酵母菌、霉菌和大腸桿菌，可能是由于pH 值低（＜4.44）所致，同時，所有處理組均有LAB。Hutkins 等［36］報道LAB可以在pH 4.5～7.5 的范圍內(nèi)生長旺盛，這些腐敗微生物通常在pH＜4.5 時受到抑制。此外，與NCL 含有豐富的活性植物營養(yǎng)素也有聯(lián)系，如單寧，具有很強的抗菌能力。添加CO 導(dǎo)致不良微生物數(shù)量的減少可能是因為它們具有很強的抗菌活性。青貯過程中，由于植物蛋白酶和微生物的活動，蛋白質(zhì)部分轉(zhuǎn)化為NPN。過高的NPN含量不利于動物飼喂，因為與真蛋白相比，NPN 的利用率較低，并增加了畜牧業(yè)的氮排放。青貯中NH3-N 含量過高可能會降低青貯飼料的適口性和干物質(zhì)采食量。NCL 的添加降低了NPN 和NH3-N 的含量，這是因為NCL 中的單寧可以與各種蛋白酶結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的降解。與Wang 等［11］的研究結(jié)果相同，在高水分苜蓿和柱花草青貯中添加NCL 有效地抑制了蛋白質(zhì)的降解，因為NCL 的蛋白水解活性較低。以上結(jié)果證實了NCL 處理對青貯中蛋白質(zhì)的降解起到了保護作用。此外，CO 還可能通過抑制不良微生物的生長來減少蛋白質(zhì)降解。研究表明，飼糧中添加CO 降低了仔豬盲腸中大腸桿菌的比例，增加了有益細菌的數(shù)量［37］。在本研究中，CO 增加了LAB數(shù)量和粗蛋白含量，降低了NH3-N 含量。綜上所述，NCL 和CO 可以改善青貯品質(zhì)，降低青貯過程中蛋白質(zhì)的降解。

3.3 有氧暴露對甘蔗梢青貯料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

在青貯過程中，pH 值和乳酸含量可作為評價有氧變質(zhì)的指標(biāo)。pH 也被認為是抑制微生物活性的重要因素之一。NCL 處理的pH 降低，主要是因為這些處理的乳酸含量高于CK 和CO 處理。此外，隨著乳酸含量的增加，青貯質(zhì)量也得到了改善。有氧暴露后，對照處理的霉菌數(shù)量增加，而NCL 和CO 處理的霉菌均未檢出。這表明添加了NCL 和CO 抑制了霉菌的生長。類似地，Wang 等［11］在NCL 處理中未檢測到霉菌。NPN 是蛋白質(zhì)水解的直接指標(biāo)，大致反映了粗蛋白的營養(yǎng)價值［28］。在本研究中，NCL 處理提高了粗蛋白和真蛋白含量，降低了NPN和NH3-N 含量。這表明添加NCL 處理在有氧暴露過程中甘蔗梢青貯料的蛋白質(zhì)得到了較好的保存。CO 處理增加了粗蛋白的含量，可能是CO 抑制了有害微生物的生長，從而減少了有氧暴露后蛋白質(zhì)的降解。NCL 和CO處理下甘蔗梢青貯在有氧暴露后蛋白質(zhì)保存效果顯著的機理值得進一步研究。

有氧穩(wěn)定性在生產(chǎn)應(yīng)用中是評估青貯質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。有氧惡化會對青貯飼料的營養(yǎng)保存和動物的飼料攝入量產(chǎn)生不利影響。青貯飼料的有氧變質(zhì)是指酵母菌在有氧暴露期間將碳水化合物和乳酸轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水的一系列反應(yīng)［23］。有氧條件下的青貯飼料很大程度上受酵母菌數(shù)量的影響。15%NCL+CO 處理組酵母菌數(shù)量低于3.00 log10cfu·g?1FM，其他添加NCL 的處理組的酵母菌數(shù)量更高，說明15%NCL+CO 組的有氧穩(wěn)定性最好。低pH 有助于維持有氧穩(wěn)定性，抑制牧草發(fā)酵。在本研究中，15%NCL+CO 處理的甘蔗梢pH 值低于其他處理組。因此，15%NCL+CO 處理可能有利于提高有氧穩(wěn)定性。乙酸可以抑制腐敗微生物的生長，并提高有氧暴露后的有氧穩(wěn)定性［38］。15%NCL+CO 處理下乙酸含量高于30%NCL+CO 處理。這表明15%NCL+CO處理比30%NCL+CO 處理具有更好的有氧穩(wěn)定性。溫度和儲存時間的增加會導(dǎo)致酵母菌和絲狀真菌數(shù)量增加，它們被認為是好氧惡化的關(guān)鍵指標(biāo)［39］。其中青貯溫度的升高不僅由于好氧微生物的增殖，也由于養(yǎng)分流失的增加。綜合考慮，15%NCL 和15%NCL+CO 處理組的最高溫度和達到最高溫度的時間效果最好。CO 提高了NCL 與甘蔗梢混合的有氧穩(wěn)定性，這可能是由于CO 降低了酵母菌的數(shù)量。綜上所述，同時添加15%NCL 和CO可以提高甘蔗梢青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，NCL 和CO 對甘蔗梢青貯的發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性有積極的影響。甘蔗梢添加NCL 青貯210 d 后可降低pH 值、非蛋白氮和氨態(tài)氮含量，提高乳酸、乙酸、粗蛋白和真蛋白含量，從而改善青貯品質(zhì)。有氧暴露7 d 后，NCL 處理的pH 值、非蛋白氮和氨態(tài)氮含量降低，而乳酸、乙酸、粗蛋白和真蛋白含量增加。15%NCL+CO 處理的有氧穩(wěn)定性最高，在有氧暴露過程中幾乎沒有發(fā)生有氧腐敗。CO 的抑菌作用有助于改善甘蔗梢青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，15%NCL+CO 處理是提高甘蔗梢青貯發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的最佳添加劑組合。