魏倩 劉小寧 趙潔

（1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，石河子 832003）

叉頭框蛋白（forkhead box protein，F(xiàn)ox）家族是一類含有保守的fork head（FH）結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，該結(jié)構(gòu)域中的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”基序與下游基因啟動子區(qū)的順式作用元件結(jié)合［1-2］。Fox轉(zhuǎn)錄因子的分布十分廣泛，從酵母、線蟲、昆蟲、海鞘、爪蟾、小鼠到人類中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種Fox蛋白［3-5］。根據(jù)Fox蛋白在N端和C端的變異程度，將Fox家族分為24個亞家族和1個孤兒類別［6］。已發(fā)表的昆蟲基因組或轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，昆蟲體內(nèi)并不包含所有的Fox亞家族，例如家蠶體內(nèi)主要缺失FoxAB、FoxE、FoxH、FoxI、FoxK、FoxL1、FoxM、FoxQ1、FoxR和FoxS［7］。目前，昆蟲Fox蛋白的研究主要集中于FoxO和FoxA亞家族，它們在昆蟲的氧化應(yīng)激、生長發(fā)育、細(xì)胞凋亡、解毒代謝、糖脂代謝和先天免疫等方面發(fā)揮著重要的作用［8-12］。

棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲是一種多食性的農(nóng)業(yè)重要防治害蟲。目前，關(guān)于棉鈴蟲Fox蛋白的研究報道極少。Bao等［13］從棉鈴蟲的蛹內(nèi)克隆獲得第一個Fox基因，即HaFoxA，并發(fā)現(xiàn)FoxA蛋白可以與滯育激素和信息素生物合成激活神經(jīng)肽（diapause hormone-pheromone biosynthesis-activating neuropeptide，DH-PBAN）基因的啟動子結(jié)合，從而參與蛹的激素合成并影響滯育過程。Cai等［14］首次克隆獲得棉鈴蟲的FoxO基因，并發(fā)現(xiàn)在20-羥基蛻皮激素的影響下，F(xiàn)oxO蛋白與Broad轉(zhuǎn)錄因子亞型7（broad isoform 7，BrZ7）基因的啟動子結(jié)合，提高BrZ7以及下游羧肽酶A（carboxypeptidase A，CPA）基因的表達(dá)量，從而在棉鈴蟲的蛻皮過程中促進(jìn)蛋白質(zhì)水解。Li等［15］將棉鈴蟲3齡幼蟲體內(nèi)的FoxA進(jìn)行RNA干擾（RNA interference，RNAi）后發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis的兩個Cry毒素蛋白受體，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter proteins，ABCC2和ABCC3）基因的表達(dá)都顯著降低，并且幼蟲對Cry毒素的耐受性明顯增強。

2-十三烷酮（2-tridecanone，2-TD）是一種天然存在于茄科植物中的重要次生物質(zhì)，它能夠誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450解毒酶（cytochrome P450 enzymes）基因的過量表達(dá)，例如低濃度的2-TD能顯著提高棉鈴蟲CYP3、CYP6亞家族基因的表達(dá)，激活棉鈴蟲的解毒代謝通路［16-17］。CYP6B6是棉鈴蟲中腸內(nèi)一個重要的解毒酶基因，它在棉鈴蟲的有毒物質(zhì)代謝和生長發(fā)育過程中都發(fā)揮重要作用［18］。然而，2-TD長期脅迫卻會降低CYP6B6表達(dá)量，導(dǎo)致棉鈴蟲化蛹時間延長、并顯著降低化蛹率和羽化率［19-20］。同時，在低濃度2-TD短期脅迫后，對CYP6B6基因的啟動子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，-373/+21 bp處（即HE1片段）是最重要的活性序列［21］。本課題組前期利用酵母單雜交技術(shù)，篩選2-TD短期脅迫后能與HE1片段結(jié)合的調(diào)控因子，發(fā)現(xiàn)一個陽性酵母的測序片段中含有FH結(jié)構(gòu)域的部分序列；同時在2-TD短期處理6齡幼蟲的中腸轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)一個新的Fox基因，它和CYP6B6一樣都能響應(yīng)低濃度2-TD脅迫。將克隆得到的新Fox基因與已發(fā)表的昆蟲FoxA進(jìn)行多序列比對后發(fā)現(xiàn)，該基因包含F(xiàn)ox家族保守的FH結(jié)構(gòu)域，以及一個疑似FoxA亞家族轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Domain Ⅱ）的相關(guān)區(qū)域，并把該基因命名為FoxA類似基因（forkhead box protein A-like，F(xiàn)oxAl）［22］。隨后，對CYP6B6啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HE1片段上含有多個Fox轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點?；谝陨系难芯炕A(chǔ)，我們推測FoxAl有可能是CYP6B6的轉(zhuǎn)錄因子，從而參與棉鈴蟲的解毒代謝和生長發(fā)育過程。

因此，本研究先利用酵母自激活試驗，驗證FoxAl蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能；隨后通過凝膠阻滯試驗，驗證FoxAl蛋白能否與CYP6B6啟動子HE1片段結(jié)合。在確定FoxAl是CYP6B6的轉(zhuǎn)錄因子后，一方面用不同濃度的2-TD脅迫處理棉鈴蟲6齡幼蟲，另一方面注射FoxAl dsRNA于棉鈴蟲5齡幼蟲體內(nèi)，通過實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)測定不同時間后幼蟲中腸內(nèi)FoxAl和CYP6B6的表達(dá)情況，確定FoxAl與CYP6B6啟動子的調(diào)控關(guān)系，為FoxAl蛋白參與棉鈴蟲的生長發(fā)育和解毒代謝過程提供依據(jù)，為進(jìn)一步探索棉鈴蟲對次生物質(zhì)的適應(yīng)機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：棉鈴蟲采集于烏魯木齊市安寧渠鎮(zhèn)，并在本實驗室用人工飼料長期飼養(yǎng)，試蟲種群為第5代。人工飼料配方：玉米粉120 g，大豆粉40 g，瓊脂20 g，山梨酸1 g，酵母粉12 g，青霉素0.1 g，抗壞血酸2 g，維生素C 4 g，肌醇0.2 g，復(fù)合維生素B 0.9 g，蒸餾水620 mL。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期16L∶8D。

菌株和質(zhì)粒：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2HGold菌株購自Clontech公司，最適生長溫度30℃；大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，最適生長溫度37℃；大腸桿菌Transetta（pET32a-FoxAl）菌株由課題組前期構(gòu)建，最適生長溫度37℃，蛋白表達(dá)最適溫度25℃。pMD18-T-FoxAl質(zhì)粒由課題組前期構(gòu)建，pGBKT7質(zhì)粒購自Clontech公司。

試 劑：DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II購自Roche公司；Matchmaker Insert Check PCR Mix 2、2×YPDA Broth、SD/-Trp with Agar和X-α-Gal均購自Clontech公司；EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5×）、EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色，10×）和EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍(lán)色，10×）均購自上海碧云天生物技術(shù)；2-十三烷酮購自上海麥克林生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、BamH I、EcoR I和T4 DNA Ligase均購自寶生物工程（大連）有限公 司；Proteinlso Ni-NTA Resin、EasyPure RNA Kit、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和PerfectStart Green qPCR SurperMix（+Dye I）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T7 RiboMAX Express RNAi System購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 FoxAl蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性測定 以前期測序正確的pMD18-T-FoxAl質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得FoxAl的開放閱讀框（ORF）序列，其中上、下游引物分別為（5'-GGAATTCATGGCGGCTAGAACA GGT-3'，EcoR I酶切位點）和（5'-CGGGATCCCTAGT CCACCGTGATGA-3'，BamH I酶切位點）。隨后，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I將FoxAl的ORF和pGBKT7質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA Ligase過夜連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，再通過菌液PCR和酶切鑒定獲得重組后的pGBKT7-FoxAl質(zhì)粒。按照Y2HGold菌株使用說明，將pGBKT7-FoxAl質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold菌株內(nèi)，并在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上30℃倒置培養(yǎng)3-4 d，挑取生長良好、直徑約2-3 mm的酵母菌落進(jìn)行PCR鑒定。取適量鑒定正確的Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）重組菌株，以1∶100的比例稀釋于0.9% NaCl溶液中，取100 μL重懸菌液分別涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2-3 d，觀察菌落生長狀況和顯色情況。陰性對照為Y2HGold和Y2HGold（pGBKT7）菌株按同等比例稀釋后，生長于SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上。

1.2.2 FoxAl蛋白和CYP6B6啟動子的結(jié)合反應(yīng) 按照趙潔等［22］的文獻(xiàn)，經(jīng)表達(dá)、純化和超濾獲得融合蛋白His-FoxAl。按照DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit II的說明書制備CYP6B6啟動子HE1片段的核酸探針，并檢測探針的標(biāo)記效率。按照EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液的步驟進(jìn)行HE1探針（1 ng）和FoxAl蛋白（1 μg或1.5 μg）的結(jié)合反應(yīng)，參考Michael R. Green的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第二章方案3制備5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，并進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的核酸電泳。利用浸沒式轉(zhuǎn)印電泳儀將HE1探針轉(zhuǎn)移至帶有正電荷的尼龍膜上，并進(jìn)行紫外線交聯(lián)固定。按 照DIG-High Primer DNA Labeling and Detection Starter kit II的步驟進(jìn)行HE1探針的免疫印跡和化學(xué)發(fā)光成像。此外，為了避免假陽性的阻滯結(jié)果，進(jìn)行未標(biāo)記探針和無關(guān)基因片段的冷競爭反應(yīng)，分別在結(jié)合反應(yīng)體系中再加入標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記HE1片段或棉鈴蟲肽聚糖識別蛋白（Peptidoglycan recognition proteins，PGRP-B）基因片段。

1.2.3 FoxAl-dsRNA處理棉鈴蟲5齡幼蟲 以棉鈴蟲FoxAl的ORF為模板，經(jīng)PCR擴增和產(chǎn)物回收獲得含有T7啟動子的目的片段，按照T7 RiboMAX Express RNAi System試劑盒的操作步驟合成和純化獲得FoxAl的dsRNA。取當(dāng)天蛻皮的5齡幼蟲饑餓2 h后冰上麻醉20 min，在幼蟲腹部第6節(jié)和第7節(jié)的節(jié)間膜處，用微量注射器將FoxAl 的dsRNA注入幼蟲體腔內(nèi)，dsRNA為5 μg/頭，對照組注射等量的Nuclease-free water。注射結(jié)束后，將棉鈴蟲幼蟲置于35 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，在幼蟲恢復(fù)正常活動后放置于含有人工飼料的玻璃管內(nèi)，使其在正常環(huán)境條件下生長。

1.2.4 2-TD脅迫處理棉鈴蟲6齡幼蟲 將所需2-TD溶于60℃預(yù)熱的10%乙醇溶液中，充分融化后添加于等質(zhì)量的棉鈴蟲人工飼料中，分別配制成不同劑量（0，5，10和20 mg/g）的處理飼料。取當(dāng)天蛻皮的6齡幼蟲饑餓2 h后，放置于含有不同2-TD劑量飼料的玻璃管內(nèi)，使其在正常環(huán)境條件下生長。

1.2.5 qPCR檢測FoxAl和CYP6B6的表達(dá)譜 在dsRNA注射后的不同時間（24，48，72和 96 h）和2-TD處理后的不同時間（6，12，20，30和48 h），取3頭仍然存活的幼蟲的中腸組織作為一個生物學(xué)樣本，按照EasyPure RNA Kit和EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix的操作步驟提取中腸的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為相對應(yīng)的cDNA，每個處理包含3個生物學(xué)樣本。按照PerfectStart Green qPCR SurperMix（+Dye I）的說明書，以棉鈴蟲Tubulin作為內(nèi)參基因，經(jīng)qPCR技術(shù)分別檢測FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)情況，每個生物學(xué)樣本包含3個技術(shù)重復(fù)。qPCR反應(yīng)體系為10.0 μL的2×SYBR Green PCR master mix、8.0 μL的RNase-free H2O、0.5 μL的上游引物、0.5 μL的下游引物、1.0 μL的cDNA。反應(yīng) 程 序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30s，40個循環(huán)。FoxAl引物F：5'-TGATGCCGTTGAGAAGACTA-3'；R：5'-CACTTTCCCTGACCACTTG-3'。Tubulin引 物F：5'-TCCAACTCACACACTCGCT-3'；R：5'-GGAAGCAGATGTCGTATAATG-3'。CYP6B6引物F：5'-TTCAAACTTATACCATGTCCACAA-3'；R：5'-CCAATTGACGGAGCTCTAGAATCA-3'。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 在每個處理時間點，RNAi試驗中以Nuclease-free water組為對照，2-TD脅迫試驗中以0 mg/g組為對照，用2-ΔΔCt法計算FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)量。運用Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析：RNAi試驗，在每個時間點進(jìn)行t檢驗（Student’s t test）；2-TD脅迫試驗，在每個時間點和每個濃度下都進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比較（Tukey法）。運用SPSS 20.0軟件，將2-TD脅迫試驗中FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)量，按照不同脅迫濃度和不同脅迫時間進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 棉鈴蟲FoxAl的轉(zhuǎn)錄激活功能驗證

將棉鈴蟲FoxAl的ORF連接至酵母表達(dá)載體pGBKT7質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGBKT7-FoxAl經(jīng)EcoR I和BamH I酶切，圖1-A電泳結(jié)果顯示酶切片段小于1 000 bp、大于500 bp，其位置與FoxAl ORF（669 bp）的大小一致，表明重組質(zhì)粒pGBKT7-FoxAl構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold菌株感受態(tài)后，進(jìn)行酵母菌落PCR，圖1-B結(jié)果顯示擴增條帶略小于750 bp，其位置與FoxAl ORF的大小一致，表明酵母菌株Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）構(gòu)建成功。隨后，將構(gòu)建好的Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）菌液涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-ga1培養(yǎng)基上，通過顏色變化檢測FoxAl蛋白對酵母MEL1報告基因是否有激活作用。圖1-C結(jié)果顯示，將兩個對照Y2HGold和Y2HGold（pGBKT7）的菌液直接涂布于SD/-Trp/X-α-ga1培養(yǎng)基上，前者不能生長、后者正常生長但無顏色變化，對照組的結(jié)果符合預(yù)期，表明整個轉(zhuǎn)化過程正常且無污染；將Y2HGold（pGBKT7-HaFoxAl）菌液涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-ga1培養(yǎng)基上，酵母菌落正常生長且大小合適，表明插入基因能正常表達(dá)，同時該菌液在X-αga1誘導(dǎo)下呈現(xiàn)藍(lán)色，表明FoxAl蛋白本身含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，能激活酵母體內(nèi)下游基因的正常表達(dá)。

圖1 酵母Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）菌株的轉(zhuǎn)錄激活功能檢測Fig.1 Transcriptional activation test of transformed yeast Y2HGold（pGBKT7-FoxAl）strain

2.2 棉鈴蟲FoxAl與CYP6B6啟動子HE1片段結(jié)合

首先，用地高辛標(biāo)記的HE1探針與有活性的His-FoxAl蛋白進(jìn)行凝膠遷移率檢測，圖2-A的結(jié)果顯示，1 μg和1.5 μg的His-FoxAl蛋白都能與1 ng HE1探針結(jié)合并形成阻滯條帶。隨后，通過無關(guān)基因片段和未標(biāo)記探針的冷競爭反應(yīng)，進(jìn)一步驗證1 ng HE1探針與1 μg His-FoxAl蛋白結(jié)合形成阻滯條帶的真實性。圖2-B的結(jié)果顯示，泳道3在反應(yīng)體系中再加入標(biāo)記探針100倍量的棉鈴蟲PGRP-B片段時，HE1探針與FoxAl蛋白形成的阻滯條帶仍然存在；而泳道4中再加入100倍量的未標(biāo)記HE1片段時，原有的HE1-FoxAl阻滯條帶消失不見；這兩個競爭反應(yīng)結(jié)果表明，F(xiàn)oxAl蛋白與CYP6B6啟動子HE1片段的結(jié)合是特異性的，是通過FoxAl蛋白的識別螺旋與HE1片段的特定堿基以氫鍵形式結(jié)合。

圖2 棉鈴蟲FoxAl蛋白與CYP6B6啟動子HE1片段的結(jié)合驗證Fig. 2 Verification of FoxAl in H. armigera binding to the HE1 fragment of CYP6B6 promotor

2.3 棉鈴蟲FoxAl沉默對CYP6B6表達(dá)水平的影響

將5 μg的FoxAl dsRNA注射到棉鈴蟲5齡幼蟲體內(nèi)，在注射后的24、48、72和96 h，檢測中腸內(nèi)FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量變化情況。圖3-A的FoxAl相對表達(dá)量結(jié)果顯示：與對照組相比，注射FoxAl dsRNA后中腸內(nèi)的FoxAl表達(dá)量從48 h開始顯著降低（P=0.001 8），并在96 h降至最小值（P=0.000 6）；圖3-B的CYP6B6相對表達(dá)量結(jié)果顯示：與對照相比，F(xiàn)oxAl dsRNA處理后CYP6B6的表達(dá)從24 h開始顯著降低（P=0.001 9），在48 h降至最小值（P＜0.000 1），并在96 h內(nèi)一直被顯著降低（P=0.008 2）。

圖3 FoxAl dsRNA 注射后棉鈴蟲5齡幼蟲中腸內(nèi)FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression of FoxAl and CYP6B6 in the midgut of 5th instar larvae after FoxAl dsRNA injected

2.4 2-TD處理對棉鈴蟲中腸FoxAl和CYP6B6表達(dá)水平的影響

用3種濃度的2-十三烷酮（2-TD）處理棉鈴蟲六齡幼蟲，檢測中腸內(nèi)FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量變化情況。圖4-A的FoxAl相對表達(dá)量結(jié)果顯示：在5 mg/g的2-TD處理組內(nèi)（F=5.180，P=0.001 9），12 h的表達(dá)量最高、30 h的表達(dá)量最低，且30 h時顯著低于空白組（P=0.003 5）；在10 mg/g的2-TD濃度下（F=12.86，P＜0.000 1），12 h的表達(dá)量最高、48 h的表達(dá)量最低，6 h時極明顯高于對照（P＜0.000 1）， 20，30和48 h時 顯 著 低 于 對 照（P=0.027 5，P=0.001 4，P=0.042 7）；在20 mg/g處理中（F=11.27，P＜0.000 1），12 h的表達(dá)量最高、48 h的表達(dá)量最低，12 h時顯著高于空白對照（P=0.013 1）、而20和48 h時明顯低于空白對照（P=0.006 3，P=0.027 3）。在3個2-TD濃度處理組內(nèi)，棉鈴蟲FoxAl表達(dá)量隨時間變化基本一致，都是短時間內(nèi)表達(dá)量上升、至12 h達(dá)到最高值，然后在20 h表達(dá)量快速下降。

CYP6B6的相對表達(dá)量結(jié)果顯示：在5 mg/g的2-TD處理后（F=5.016，P=0.002 3），20 h的表達(dá)量最高、30 h的表達(dá)量最低，且20 h時明顯高于對照（P=0.023 6）；在10 mg/g 2-TD處理組（F=33.63，P＜0.000 1），12 h的表達(dá)量最高、48 h的表達(dá)量最低，12 h時顯著高于對照（P=0.037 3），30和48 h時顯著低于對照（P=0.043 1，P=0.023 4）；在20 mg/g的處理中（F=12.95，P＜0.000 1），12 h的表達(dá)量最高、48 h的表達(dá)量最低，12 h時極顯著高于空白對照（P=0.000 8）。在3個2-TD濃度處理后，CYP6B6表達(dá)量隨時間變化基本相似，都是在12 h內(nèi)急劇升高、在20 h內(nèi)基本維持高水平表達(dá)，然后在30 h迅速下降（圖4-B）。

圖4 2-TD脅迫后棉鈴蟲6齡幼蟲中腸內(nèi)FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of FoxAl and CYP6B6 in the midgut of the 6th instar larvae after 2-TD treated

將不同2-TD濃度處理后的FoxAl和CYP6B6的相對表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。表1結(jié)果顯示，3個脅迫濃度下FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量都是正相關(guān)的，兩者的相關(guān)系數(shù)隨著2-TD濃度增加逐漸增大，并且在20 mg/g濃度處理時兩者呈顯著地高度正相關(guān)（r=0.819，P=0.045）；除了20 h以外，其他脅迫時間點下FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量都是正相關(guān)的，12 h、30 h和48 h時兩者的表達(dá)量是高度正相關(guān)（r=0.987，r=0.863，r=0.978），其中12 h和48 h時都是顯著相關(guān)（P=0.007，P=0.011）。

表1 FoxAl和CYP6B6表達(dá)量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of FoxAl and CYP6B6 expression

3 討論

課題組前期分析棉鈴蟲FoxAl蛋白的氨基酸序列時，發(fā)現(xiàn)該蛋白只含有一個完整的FH結(jié)構(gòu)域，不包括FoxA亞家族的兩個轉(zhuǎn)錄激活域［22］。為了明確FoxAl蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，本研究通過酵母自激活試驗證明了該蛋白能夠激活MEL1報告基因的轉(zhuǎn)錄，從而使酵母菌株在缺陷培養(yǎng)基上正常生長并顯藍(lán)色。作為棉鈴蟲體內(nèi)一個新的Fox家族基因，F(xiàn)oxAl的具體功能與蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此后期還將進(jìn)一步明確FoxAl蛋白中主要的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域以及相關(guān)位點。

已有研究表明，在外界物質(zhì)的刺激下，昆蟲Fox蛋白的表達(dá)量會迅速上升并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄［14］。例如用一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑—雷帕霉素飼喂果蠅Drosophila成蟲，其腸道內(nèi)FoxA的表達(dá)量升高并大量入核，F(xiàn)oxA激活Diptericin和Metchnikowin基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)兩種腸道抗菌肽，從而參與果蠅免疫系統(tǒng)［10］。本研究在植物次生物質(zhì)的脅迫下，棉鈴蟲體內(nèi)FoxAl的表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示3種低濃度（5，10和20 mg/g）的2-TD脅迫6齡幼蟲后，中腸內(nèi)FoxAl的表達(dá)量在12 h內(nèi)迅速升高，并在20 h迅速降低，隨著脅迫時間的延長，該基因mRNA含量基本維持穩(wěn)定。目前棉鈴蟲FoxAl的抗體正在制備中，后期將從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實FoxAl的表達(dá)情況。

細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒酶系。大量研究表明，P450基因過量表達(dá)是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的機制之一，其中CYP6亞家族與植物次生物質(zhì)和殺蟲劑的耐受性密切相關(guān)［23-24］。例如2-TD能誘導(dǎo)棉鈴蟲體內(nèi)CYP6B7基因的過量表達(dá)，并使棉鈴蟲對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性［25-26］。根據(jù)已發(fā)表的文章，多次證實低濃度（＜50 mg/g）的2-TD短期脅迫棉鈴蟲幼蟲后，中腸組織內(nèi)CYP6B6的蛋白含量能迅速增加，并參與解毒代謝過程［19-21］。本研究利用低濃度的2-TD處理棉鈴蟲6齡幼蟲不同時間后，檢測中腸內(nèi)CYP6B6的表達(dá)量，本試驗結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似，3個2-TD濃度都能快速提高CYP6B6的mRNA含量，而隨著脅迫時間延長，CYP6B6的表達(dá)量都會逐漸降低。在處理30 h-48 h的時間段內(nèi)，與空白對照組相比，5和10 mg/g處理組的幼蟲取食量減少，而20 mg/g處理組的幼蟲大量提前預(yù)蛹，其中部分幼蟲的中腸組織縮短、顏色加深，甚至呈現(xiàn)粉紅色。這些現(xiàn)象表明，即使是低濃度的2-TD，長時間脅迫也會降低幼蟲的解毒能力，甚至影響棉鈴蟲的生長發(fā)育。

在預(yù)蛹的果蠅轉(zhuǎn)化品系P［hs-Fkh111］中，37℃熱處理增加唾腺中FoxA的含量后，發(fā)現(xiàn)下游P450基因的表達(dá)發(fā)生改變，其中CYP9B2，CYP6A20和CYP28D1的表達(dá)量分別提高3.88，24.39和100.87倍，而CYP4E2和CYP6V1的表達(dá)量變化倍數(shù)都為-2.15［27］。同時在前期進(jìn)行CYP6B6啟動子分析時，預(yù)測出大量的Fox蛋白結(jié)合位點。因此，我們推測新的棉鈴蟲FoxAl蛋白也許能與CYP6B6啟動子結(jié)合，從而響應(yīng)植物次生物質(zhì)脅迫。本研究通過凝膠阻滯試驗證實了該假設(shè)，棉鈴蟲FoxAl蛋白能與CYP6B6啟動子的核心序列HE1片段結(jié)合。通過多種軟件的進(jìn)一步篩選，HE1片段中可能與FoxAl蛋白結(jié)合的位點有3個，后期將通過截斷HE1片段，進(jìn)一步縮小FoxAl蛋白的結(jié)合范圍，同時合成相應(yīng)的突變探針，明確FoxAl蛋白的具體結(jié)合位點。

本研究通過腹腔注射法沉默幼蟲中腸內(nèi)FoxAl的表達(dá)后，CYP6B6的表達(dá)量也發(fā)生顯著降低，這說明FoxAl蛋白對CYP6B6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是正向的。此外，2-TD脅迫后FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量變化趨勢基本相似，對兩者的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者總體是正相關(guān)的，甚至在20 mg/g處理濃度、以及12，30和48 h處理時間都是高度正相關(guān)，該結(jié)果表明FoxAl可能是CYP6B6的轉(zhuǎn)錄激活因子，正向調(diào)控CYP6B6的表達(dá)。值得注意的是，在處理20 h后FoxAl的表達(dá)量顯著降低，而CYP6B6依然高水平地表達(dá)，兩者的表達(dá)量呈低度負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子FoxAl表達(dá)量出現(xiàn)拐點的時間（12 h）早于下游基因CYP6B6出現(xiàn)的時間（20 h），在此時間段內(nèi)可能還有其它轉(zhuǎn)錄激活因子或輔因子，使CYP6B6持續(xù)過量表達(dá)。同時，因為檢測點相隔時間較長，后期將進(jìn)一步縮短間隔時間，細(xì)化FoxAl和CYP6B6的表達(dá)量變化情況。

4 結(jié)論

棉鈴蟲FoxAl蛋白能與CYP6B6啟動子結(jié)合，并且在有毒物質(zhì)脅迫下，F(xiàn)oxAl蛋白可能是CYP6B6的轉(zhuǎn)錄激活因子。