徐麗媛 竇 露 靳 燁 蘇 琳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018)

細(xì)胞凋亡也稱細(xì)胞程序性死亡，是由多種基因決定的，細(xì)胞主動的、有秩序的死亡過程[1]。宰后成熟是提升畜禽肉品質(zhì)的關(guān)鍵，并且細(xì)胞凋亡在此過程中有著不可忽視的作用。肌纖維是構(gòu)成肌肉組織的基本單位，其特性在動物宰前就已基本確定，然而它是如何在宰后成熟過程中影響細(xì)胞凋亡進程進而影響肉品質(zhì)，目前尚未有系統(tǒng)報道。此外，研究宰后成熟過程中不同肌肉部位的品質(zhì)差異及其機制至關(guān)重要。因此，本文總結(jié)了細(xì)胞凋亡概念、細(xì)胞凋亡路徑、細(xì)胞凋亡對宰后肌肉成熟過程的影響、控制宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡的方法等，最后將細(xì)胞凋亡與肌纖維特性聯(lián)系起來，為肌肉的分部位成熟提供參考依據(jù)。

1 細(xì)胞凋亡

1.1 細(xì)胞凋亡概念及形態(tài)學(xué)特征

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞停止生長和分裂的過程，是一種細(xì)胞自殺方式，最終導(dǎo)致細(xì)胞受控死亡，而細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)不會泄露到外界環(huán)境中。機體去除不必要細(xì)胞的有效途徑是使其主動凋亡，通過活化細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因使細(xì)胞死亡；生物生長和保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定均需要細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。

細(xì)胞如果有凋亡的預(yù)兆，首先有變化的就是形狀，細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化如圖1所示[4]。凋亡的細(xì)胞其形態(tài)特征主要表現(xiàn)在細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞核破碎，線粒體和核糖體集合在一起，細(xì)胞器發(fā)生輕微變化，染色質(zhì)逐步凝結(jié)為月牙形，圍繞在細(xì)胞核膜附近；隨后細(xì)胞質(zhì)膜和核膜出泡，出泡的部分塌陷形成凋亡小體(apoptotic bodies)，且凋亡小體中有部分染色質(zhì)[5-6]。

圖1 細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化

1.2 細(xì)胞凋亡路徑

細(xì)胞凋亡路徑主要包括3種：內(nèi)源性線粒體途徑、外源性死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[7]，如圖2所示。其中，線粒體途徑是最主要的細(xì)胞凋亡路徑[8]。相關(guān)研究表明這3條細(xì)胞凋亡途徑是相互關(guān)聯(lián)的，且都由同一種蛋白酶——半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族連接。

內(nèi)源性線粒體途徑開始于線粒體，當(dāng)機體內(nèi)細(xì)胞接收到凋亡刺激時將信號傳遞至線粒體，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)打開，釋放細(xì)胞色素C(cytochrome-C，Cyt-C)，接著Cyt-C與凋亡酶因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)相互作用，并與輔因子ATP組成凋亡復(fù)合物[9]，該復(fù)合物啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)并激活細(xì)胞凋亡啟動酶Caspase-9。經(jīng)活化的Caspase-9自我剪切，進而活化細(xì)胞凋亡效應(yīng)酶Caspase-3[10-11]。值得一提的是整個細(xì)胞凋亡過程受到基因家族B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族蛋白的調(diào)控。Bcl-2家庭分為2種功能性蛋白：抗凋亡蛋白[Bcl-2、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xl(Bcl-xl)]和促凋亡蛋白[B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(BH3 interacting domain death agonist，Bid)、B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2拮抗/殺傷因子(Bcl-2 homologous antago-nist/killer，Bak)][12]。研究表明，Bcl-2可通過抑制mPTP的形成，維持線粒體跨膜電位，進而抑制Cyt-C的釋放，也防止其他促凋亡因子從孔道釋放，并且已釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-C也能夠被Bcl-2抑制激活細(xì)胞凋亡酶系統(tǒng)。Bcl-xl可與Apaf-1結(jié)合，使之不能與Cyt-C形成凋亡復(fù)合體，從而阻止下游Caspase活化[13-14]。而過表達的Bax可直接插入到線粒體膜上增加線粒體的通透性，增加Cyt-C的釋放，激活Caspase家族，促進細(xì)胞凋亡發(fā)生。Bid可被Caspase-8水解，其水解產(chǎn)物可以觸發(fā)線粒體釋放Cyt-C；此外Bax可與Bcl-2和Bcl-xl結(jié)合形成同源二聚體以加速細(xì)胞凋亡，由此可知，細(xì)胞凋亡的發(fā)生及發(fā)展程度主要由Bcl-2家族蛋白調(diào)控[15-16]。

Fas-L：Fas配體 Fas ligand；FADD：與Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域 Fas associated via death domain；Caspase-8：半胱氨酸蛋白酶-8 cysteinyl aspartate specific proteinase-8；Caspase-3/7：半胱氨酸蛋白酶-3/7 cysteinyl aspartate specific proteinase-8；Bid：BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白 BH3 interacting domain death agonist；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2 B-cell lymphoma/leukemia-2；Cyt-C：細(xì)胞色素C cytochrome-C；Apaf-1：凋亡酶因子-1 apoptosis protease-activating factor-1；Caspase-9：半胱氨酸蛋白酶-9 cysteinyl aspartate specific proteinase-9；Procaspase-12：半胱氨酸蛋白酶前體-12 cysteinyl aspartate specific proteinase precursor-12；Caspase-12：半胱氨酸蛋白酶-12 cysteinyl aspartate specific proteinaser-12。

外源性死亡受體途徑是由細(xì)胞表層的死亡受體(death receptors，DR)接收凋亡訊號，與死亡配體(death ligands)聯(lián)合傳遞到細(xì)胞內(nèi)，又與Caspase-2、Caspase-8和Caspase-10結(jié)合，形成凋亡復(fù)合體，進而產(chǎn)生下游一系列的生物學(xué)效應(yīng)使細(xì)胞凋亡。目前研究最多的是Fas、Fas與Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)as-L)結(jié)合形成凋亡復(fù)合物并啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[17-18]。機體內(nèi)大多數(shù)組織細(xì)胞中都有Fas和其配體的存在，通過調(diào)控細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用[19]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、蛋白質(zhì)多余積累和鈣離子(Ca2+)失衡觸發(fā)的細(xì)胞凋亡過程[20-21]。凋亡因子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上堆集并釋放Ca2+，激活前體Caspase-12，進而激活Caspase-9和Caspase-3，最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。

1.3 細(xì)胞凋亡對宰后成熟過程的影響及其調(diào)控手段

1.3.1 細(xì)胞凋亡對宰后成熟過程及肉嫩度的影響

動物屠宰后，機體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)供給缺失，血液循環(huán)的中斷使肌細(xì)胞處于無氧環(huán)境，當(dāng)機體內(nèi)細(xì)胞處于這樣惡劣的環(huán)境中，細(xì)胞會發(fā)出凋亡信號，促使肌細(xì)胞強制性死亡，即細(xì)胞凋亡。宰后成熟是提升畜禽肉品質(zhì)的重要手段，其中鈣蛋白酶系統(tǒng)、由Caspase轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞凋亡酶系統(tǒng)和熱休克蛋白家族(HSP)等對肉品質(zhì)的形成至關(guān)重要。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在宰后成熟過程的作用尤為顯著[23-25]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，隨著成熟時間的延長，牛肉的pH逐漸降低，線粒體膜通透性增加，Cyt-C大量釋放，促凋亡蛋白Bax含量增加，抗凋亡蛋白HSP27含量降低，且細(xì)胞凋亡啟動酶和效應(yīng)酶的活性均發(fā)生變化，證明了宰后成熟過程發(fā)生了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[26]。Huang等[27]和孫志昶[28]分別試驗證明，用DEVD-CHO(一種Caspase-3的特異性抑制劑)處理雞胸和耗牛肉可顯著抑制宰后成熟過程中肌肉蛋白質(zhì)的降解，這一結(jié)果說明畜禽宰后成熟過程中，細(xì)胞凋亡是重要參與過程。王琳琳等[29]以耗牛背最長肌為研究對象，通過向肌肉中注射環(huán)孢菌素A(cyclosporin A，CsA，mPTP的專一性抑制劑)后發(fā)現(xiàn)，CsA顯著抑制了mPTP的開放程度和Cyt-C的釋放，降低了Caspase-3活性，成熟過程有所減緩，并且隨著成熟時間不斷增長，CsA活性降低，成熟過程隨之增加。Chen等[30]利用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑處理雞肉，結(jié)果表明，肌原纖維蛋白降解產(chǎn)物顯著增加，Caspase-3活性顯著增強；進一步通過試驗發(fā)現(xiàn)，在肌原纖維蛋白的降解過程中，鈣蛋白酶和Caspase-3起協(xié)同作用[31]。綜上所述，細(xì)胞凋亡參與了畜禽宰后成熟過程并直接影響了肉品的嫩化程度。

1.3.2 控制宰后成熟過程細(xì)胞凋亡的方法

細(xì)胞凋亡對宰后成熟過程有著重要的調(diào)控作用，宰后成熟又與肉品質(zhì)密切相關(guān)，因此深入研究控制宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡的措施，對控制整個成熟過程及改善肉品質(zhì)至關(guān)重要。

國內(nèi)外學(xué)者的研究表明，當(dāng)前有不少方法均可以控制細(xì)胞凋亡。如李文東等[32]以不同冷卻方式處理耗牛背最長肌，發(fā)現(xiàn)快速冷卻處理較常規(guī)冷卻處理減緩了pH的下降速率，抑制了Caspase-9、Caspase-3活性，進而影響了細(xì)胞凋亡進程。王琳琳等[33]通過在耗牛背最長肌中注射茶多酚探究其對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)肌肉中注射茶多酚抑制了Cyt-C釋放和Caspase-3活性，進而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。張爽[34]使用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑氯化鈣(CaCl2)和茶多酚研究其對宰后山羊肌肉細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)CaCl2和茶多酚顯著增加了肌肉Caspase-3活性和肌原纖維蛋白的降解程度，可有效改善山羊肌肉的嫩度。Chen等[35]在研究氧化應(yīng)激對牛肉嫩度的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著活性氧(ROS)含量的增加，線粒體膜通透性也隨之增加，細(xì)胞凋亡程度增強，牛肉的成熟過程加快，嫩度得以改善。陳琳[36]研究表明，Ca2+處理可顯著提高宰后成熟過程雞胸肉中Caspase-3活性。Zhang等[23]研究表明，溶酶體鐵增加了宰后肌肉ROS含量和線粒體膜通透性，降低了線粒體膜電位，增強了Cyt-C釋放，加快了宰后成熟過程的細(xì)胞凋亡進程。

2 細(xì)胞凋亡與畜禽肌纖維的關(guān)聯(lián)機制

肌纖維是一種肌細(xì)胞，是構(gòu)成骨骼肌的基本單位，占骨骼肌總體積的75%～90%，由細(xì)胞器、外膜、肌紅蛋白、肌球蛋白和肌動蛋白等部分組成[37]。肌纖維根據(jù)顏色、收縮速度、代謝特性可分為以下幾類：紅肌纖維(Ⅰ型肌纖維，為慢收縮氧化型肌纖維)、白肌纖維(Ⅱ型肌纖維，為快收縮酵解型肌纖維)和中間型肌纖維(Ⅱx型肌纖維)[38]。目前關(guān)于哪種肌纖維更易發(fā)生凋亡的問題，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)表了不同觀點。Libera等[39]對大鼠進行試驗研究結(jié)果顯示，與大鼠Ⅱ型肌纖維相比，Ⅰ型肌纖維的凋亡速度更慢。Yamada等[40]的試驗結(jié)果與上述試驗結(jié)果一致，表明Ⅱ型肌纖維中存在Fas(促凋亡蛋白)且含量豐富，而沒有Bcl-2(抗凋亡蛋白)。而周婕等[41]試驗結(jié)果卻表明，中等強度和高強度運動時，與大鼠的脛骨前肌(Ⅱ型肌纖維)相比，比目魚肌(Ⅰ型肌纖維)的凋亡率顯著升高。從以上研究可以發(fā)現(xiàn)，肌纖維的構(gòu)成差異確實可影響細(xì)胞凋亡。因此，研究肌纖維如何影響細(xì)胞凋亡的機制十分必要。而據(jù)相關(guān)文獻報道，其關(guān)聯(lián)機制可能與凋亡蛋白含量、線粒體含量、一氧化氮合成酶(NOS)含量及活性、蛋白質(zhì)亞硝基化和pH等有關(guān)。

2.1 凋亡蛋白

凋亡蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，不同類型肌纖維其凋亡蛋白含量存在差異。Riva等[42]試驗結(jié)果顯示，大鼠腓腸肌(Ⅱ型肌纖維為主)的凋亡速率要顯著低于比目魚肌(Ⅰ型肌纖維為主)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bax(促凋亡蛋白)在大鼠比目魚肌中含量高于腓腸肌，而Bcl-2(抗凋亡蛋白)在大鼠腓腸肌中含量較高，因此凋亡蛋白和抗凋亡蛋白含量很可能是引起肌纖維凋亡出現(xiàn)差異的重要原因。曹錦軒[43]研究證明，牛肉氧化型肌肉(Ⅰ型肌纖維)中Bax和Bcl-2含量高于酵解型肌肉(Ⅱ型肌纖維)，而Bid蛋白表達量表現(xiàn)為氧化型肌肉(Ⅰ型肌纖維)低于酵解型肌肉(Ⅱ型肌纖維)，因此2個部位的凋亡速率不一致。HSP家族能夠抑制細(xì)胞凋亡，其中HSP27是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，它能夠影響Cyt-C釋放，減少凋亡小體形成，進而抑制凋亡發(fā)生；此外，HSP27可使Bax失活，達到抑制細(xì)胞凋亡的作用[44-45]。與快肌(Ⅱ型肌纖維)相比，慢肌(Ⅰ型肌纖維)中HSP27和HSP40的蛋白表量較高[46]，因此快肌的凋亡速率要高于慢肌。上述出現(xiàn)的2種不同結(jié)論，究其原因可能是物種差異導(dǎo)致。但無論是哪種肌纖維表現(xiàn)出更快速率的凋亡，凋亡蛋白含量在其中的作用至關(guān)重要。

2.2 線粒體

線粒體是細(xì)胞的能量制造廠，控制著細(xì)胞的能量代謝，也是線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵部位[47]。此外，該細(xì)胞器還控制著凋亡因子的釋放，Cyt-C就是由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中并參與線粒體凋亡路徑[48]。大量試驗結(jié)論已證明，線粒體含量可能是連接肌纖維和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵樞紐。Cramer等[49]研究結(jié)果顯示，氧化型肌纖維的線粒體和Cyt-C含量更多，與之對應(yīng)的是細(xì)胞凋亡更易發(fā)生在氧化型肌纖維中。Ke等[50]和張佳瑩[51]研究認(rèn)為，酵解型肌纖維比氧化型肌纖維中的線粒體含量低，不易發(fā)生線粒體功能障礙，即線粒體膜通透性的改變和Cyt-C釋放。

2.3 NOS

NOS是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，研究表明，NOS通過影響一氧化氮(NO)濃度進而調(diào)控細(xì)胞凋亡。NO可調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種生物代謝活動，具有抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重功能，是多種線粒體途徑的重要信號分子。低濃度NO具有抗凋亡作用，而高濃度NO則具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[52-53]。NOS是產(chǎn)生NO的主要酶，研究表明，不同類型肌纖維中NOS的含量和活性存在較大差異，因此有學(xué)者認(rèn)為，NOS是連接肌纖維和細(xì)胞凋亡的又一重要“橋梁”，該信號分子很可能通過影響NO濃度進而影響細(xì)胞凋亡[54]。Planitzer等[55]在小鼠的Ⅱ型肌纖維中發(fā)現(xiàn)NOS大量富集，并且Ⅱa型肌纖維比Ⅱb型肌纖維的NOS含量更高。Liu等[56]研究表明，神經(jīng)源性一氧化氮合酶(nNOS)的表達與Ⅱa/Ⅱx型肌纖維含量呈正相關(guān)，與Ⅱb型肌纖維含量呈負(fù)相關(guān)。

2.4 蛋白質(zhì)亞硝基化

蛋白質(zhì)亞硝基化即NO與蛋白質(zhì)的半胱氨酸巰基結(jié)合生成S-亞硝基硫醇(SNO)，是作為信號分子的主要NO通路。由NO誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)亞硝基化可使細(xì)胞凋亡酶失活，進而影響細(xì)胞凋亡進程[57-59]。Mannick等[60]和Hou等[61]以牛的半膜肌為試驗對象，通過比較蛋白質(zhì)亞硝基化的肌肉與無蛋白質(zhì)亞硝基化的肌肉細(xì)胞凋亡程度，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)亞硝基化的肌肉Caspase-3和Caspase-9活性大大降低，進而影響了Cyt-C釋放。Zhang等[62]研究報道，牛肉中Ⅱa/Ⅱx型肌纖維的蛋白質(zhì)亞硝基化強度更高，所以抑制了Ⅱ型肌纖維的細(xì)胞凋亡。但截止到目前，關(guān)于比較不同類型肌纖維蛋白質(zhì)亞硝基化程度的相關(guān)研究較少，因此，以蛋白質(zhì)亞硝基化為基點探究細(xì)胞凋亡和肌纖維的關(guān)系還有待進一步摸索。

2.5 pH

pH反映了宰后動物肌肉內(nèi)環(huán)境的酸堿程度，也是肌肉能量代謝的基本特征。有研究顯示，pH的變化和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，即細(xì)胞內(nèi)pH降低，使得肌肉內(nèi)環(huán)境酸化，更容易激活細(xì)胞凋亡酶[63]。賈青[64]研究指出，肌纖維中糖原無氧酵解產(chǎn)生的乳酸越多，pH越低，且低pH環(huán)境更有利于細(xì)胞凋亡的發(fā)生以及Caspase的活化。這說明肌肉pH的改變可極大程度地影響細(xì)胞凋亡。不同類型肌纖維的糖原含量、代謝方式等均存在差異，王勇峰[65]和Ryu等[66]試驗結(jié)果表明，酵解型肌纖維的代謝方式主要是無氧酵解，因此pH下降速度更快，pH更低。因此，pH的變化可能是解釋酵解型肌纖維凋亡較快的又一重要原因。綜合以上研究可以發(fā)現(xiàn)，不同類型肌纖維由于其代謝方式的差異進而影響了pH的高低，而pH作為活化Caspase的重要因子，可直接影響細(xì)胞凋亡進程。

3 小 結(jié)

肉品質(zhì)是影響消費者是否購買肉品的重要因素，主要包括色澤、風(fēng)味和嫩度等指標(biāo)。肌纖維是構(gòu)成骨骼肌的重要組成部分，與肉品質(zhì)密切相關(guān)。大量研究表明氧化型肌纖維比例越高，肉品色澤、嫩度越好，對風(fēng)味也有積極作用。宰后成熟是改善肉品質(zhì)的重要途徑，而成熟過程其實就是肌細(xì)胞的凋亡過程，因此通過控制細(xì)胞凋亡進程可以調(diào)控和改善肉品的各項參數(shù)，提升肉品質(zhì)。大量文獻已經(jīng)證實不同類型肌纖維由于其凋亡蛋白含量、線粒體含量、NOS含量及活性、蛋白質(zhì)亞硝基化和pH的不同而直接影響凋亡進程，進而對肉品特性產(chǎn)生較大影響，但具體作用機制以及哪種類型肌纖維更易發(fā)生凋亡還有待更深入的研究。此外，不同類型的肌肉其凋亡信號傳導(dǎo)途徑也可能存在較大差異，因此有必要對其進行更深入的探討。但不可否認(rèn)的是掌握細(xì)胞凋亡與肌纖維之間的關(guān)聯(lián)機制，將為控制宰后不同部位肌肉的成熟過程和提升肉品質(zhì)提供理論依據(jù)和行之有效的調(diào)控手段。