劉馨語，杜成勛，資 晶，肖藝琳，嚴(yán) 晶，李春宏，陳東東，王松標(biāo)，梁清志

(1 四川省攀枝花市仁和區(qū)氣象局，四川攀枝花，617000；2 四川省農(nóng)業(yè)氣象中心/南方丘區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，610072；3 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江，524091)

杧果MangiferaindicaL.屬于漆樹科杧果屬植物，是重要的熱帶果樹之一[1]。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2015年世界杧果產(chǎn)量超過了4 500萬t，是世界上繼香蕉、葡萄、柑桔和蘋果之后的第5大水果，被譽(yù)為“熱帶果王”[2]。中國(guó)作為世界第二大杧果生產(chǎn)國(guó)，在四川、云南、廣西、海南等熱區(qū)廣泛栽培[3]。目前，金沙江干熱河谷流域晚熟杧果種植面積已超過6.67萬hm2，杧果種植區(qū)主要集中在海拔937～1 500 m之間，氣候干熱，光照充足，晝夜溫差大，獨(dú)特的環(huán)境氣候和產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系的創(chuàng)新共同造就了該地區(qū)優(yōu)異的果品品質(zhì)。然而，由于缺乏對(duì)該區(qū)域杧果晚熟及品質(zhì)形成機(jī)制的研究，尚未能很好地解釋該區(qū)域杧果“晚熟”和“品質(zhì)一流”的成因，不能更有效地突出地區(qū)品牌和價(jià)格優(yōu)勢(shì)，影響了金沙江干熱河谷流域晚熟杧果產(chǎn)業(yè)整體效益的充分發(fā)揮。

杧果多為異花授粉亦能自花結(jié)實(shí)，少數(shù)品種表現(xiàn)自交不親和[4]。其花粉數(shù)量是影響著果率和產(chǎn)量的因素之一[5]。杧果的花柱和柱頭都較小，萌發(fā)花粉數(shù)量較少，通常只有1～3個(gè)花粉管萌發(fā)進(jìn)入花柱，并且只有1個(gè)花粉管能生長(zhǎng)到達(dá)子房?jī)?nèi)部完成受精[6]。許多研究表明[7-8]，開花期對(duì)溫度的要求最為嚴(yán)格，溫度脅迫常常會(huì)引起花粉敗育及花粉與柱頭發(fā)育不同步等現(xiàn)象[9]。將花粉作為表征植物物種或基因型耐受性的有利標(biāo)記可知[10]，低溫和高溫脅迫大多對(duì)花粉的表現(xiàn)有不利影響[11]。低溫和高溫脅迫以不同速率降低了不同杏仁基因型的花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度[12]。同樣，高溫脅迫導(dǎo)致不同基因型花生和椰子花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)以不同速度下降[13]。低溫誘導(dǎo)不同基因型杏仁和甜櫻桃花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的反應(yīng)也不同[14]。由此可以看出，不同基因型對(duì)溫度脅迫的花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)差異性可以用來評(píng)估物種或基因型的耐受性[15]。為此，累積應(yīng)激反應(yīng)指數(shù)(Cumulative Stress Response Index)通常用來表示不同基因型在應(yīng)激條件下的相對(duì)敏感性[16-17]。因此，溫度脅迫對(duì)花粉萌發(fā)、花粉管長(zhǎng)度的影響可作為評(píng)價(jià)不同基因型花粉抗性和耐受性的指標(biāo)。近年來，由于全球氣候變化，導(dǎo)致極端天氣越來越頻繁，杧果花期倒春寒和干熱風(fēng)已經(jīng)成為制約金沙江干熱河谷晚熟杧果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問題，嚴(yán)重影響植物花期花粉的萌發(fā)及著果。由于這些影響都將直接造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此溫度對(duì)花粉萌發(fā)階段的影響研究越來越受到重視。此外，為了確保農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性，識(shí)別、分辨花粉對(duì)極端天氣的響應(yīng)和耐受度變得越來越重要。為此，關(guān)注溫度對(duì)花粉的響應(yīng)是非常重要的。

本研究以西南山地杧果主栽品種“熱農(nóng)1號(hào)”為供試品種，通過離體萌發(fā)的方法，對(duì)其進(jìn)行不同程度的溫度脅迫，結(jié)合累積應(yīng)激反應(yīng)指數(shù)(CSRI)，明確“熱農(nóng)1號(hào)”杧果花期最適溫度以及花粉活力高溫及低溫臨界值，以期為更好地闡明花粉響應(yīng)高低溫脅迫的分子機(jī)理、及制訂相應(yīng)的抵御溫度脅迫生產(chǎn)技術(shù)措施等提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

“熱農(nóng)1號(hào)”杧果花粉于2021年3月取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)資源圃，在盛花期(開花數(shù)占總花量的15%～75%)隨機(jī)選取當(dāng)天開放的新鮮花藥放入培養(yǎng)液中，充分震蕩后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室用于溫度脅迫的觀察及研究分析。

1.2 方法

配置杧果花粉培養(yǎng)液：將蔗糖150 g、硼酸150 mg、硫酸鈣6.0 mg、硫酸鎂100 mg、硝酸鉀100 mg、聚乙二醇250 g混合，定溶至1 L。將培養(yǎng)液加熱煮沸待其充分溶解，冷卻后裝瓶常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

采集花粉與預(yù)處理：將配置好的培養(yǎng)液分裝在500 μL離心管中，每個(gè)離心管里隨機(jī)取花藥12～15粒，充分震蕩使花藥上的花粉附著于培養(yǎng)液中。

不同溫度條件下花粉離體培養(yǎng)：將離心管分別存放于14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 ℃的培養(yǎng)箱中分別進(jìn)行1、3、5 h培養(yǎng)。

不同溫度條件下花粉萌發(fā)率的測(cè)定：取干凈凹面載玻片，向凹穴滴入1～2滴混合均勻的培養(yǎng)液進(jìn)行觀察，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)視野，共觀察花粉粒200～500粒。以花粉管長(zhǎng)度超過花粉粒直徑為花粉萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，分別觀察1、3、5 h持續(xù)培養(yǎng)下不同溫度處理的萌發(fā)花粉數(shù)、花粉總數(shù)并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。花粉萌發(fā)率(%)=萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100。

花粉管長(zhǎng)度測(cè)定：制備3張載玻片，使用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX-51)測(cè)量每張載玻片大約50個(gè)萌發(fā)花粉粒的長(zhǎng)度，取平均值。

1.3 累積應(yīng)激反應(yīng)指數(shù)(CSRI)測(cè)定

以對(duì)照(c)組和處理(t)組的花粉萌發(fā)率(GR)和花粉管長(zhǎng)度(TL)為指標(biāo)，測(cè)定花粉管對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)，計(jì)算CSRI[16]。CSRI=(GRt-GRc)/GRc+(TLt-TLc)/TLc×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(ANOVA)，p值小于0.05。

2 結(jié)果與分析

花粉不同萌發(fā)狀態(tài)見圖1。從圖2可以看出，花粉萌發(fā)率隨溫度的變化呈類似正態(tài)分布。22 ℃，“熱農(nóng)1號(hào)”的花粉平均萌發(fā)率為9.3%；隨后隨溫度上升，花粉萌發(fā)率呈明顯增加的趨勢(shì)；28 ℃時(shí)達(dá)最大值，為37.2%；當(dāng)花粉萌發(fā)溫度在最適溫度(28 ℃)以上時(shí)，花粉萌發(fā)率又隨溫度升高迅速下降。說明低溫和高溫均對(duì)杧果花粉離體萌發(fā)具有明顯的抑制作用。當(dāng)溫度低于20 ℃，“熱農(nóng)1號(hào)”花粉不萌發(fā)；高于32 ℃，溫度開始抑制花粉萌發(fā)，不僅影響花粉粒萌發(fā)，而且抑制花粉管伸長(zhǎng)；34 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)率全部降至2.0%以下。在22～32 ℃溫度范圍內(nèi)，花粉管生長(zhǎng)良好，平均長(zhǎng)度可達(dá)花粉直徑的3～4倍，說明“熱農(nóng)1號(hào)”花粉萌發(fā)溫度為22～32 ℃，其中最適溫度為28 ℃，高于32 ℃或低于22 ℃都會(huì)抑制花粉萌發(fā)，最終可能影響“熱農(nóng)1號(hào)”授粉和著果。杧果花粉一般培養(yǎng)1 h開始萌發(fā)，培養(yǎng)5 h后已基本萌發(fā)，隨后萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不再有明顯變化[6]。由于培養(yǎng)時(shí)間超過20 h，培養(yǎng)基受污染開始大量生長(zhǎng)菌絲，不利于萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)[13]。因此，本研究分別對(duì)花粉進(jìn)行持續(xù)1、3、5 h培養(yǎng)觀察。

圖1 “熱農(nóng)1號(hào)”杧果離體花粉不同萌發(fā)狀態(tài)

圖2 不同溫度與時(shí)間處理對(duì)“熱農(nóng)1號(hào)”杧果離體花粉萌發(fā)和花粉管長(zhǎng)度的影響

隨著溫度脅迫時(shí)間的持續(xù)增加，當(dāng)溫度低于20 ℃，花粉均無萌發(fā)，且不同時(shí)間處理的花粉萌發(fā)率無明顯差異；當(dāng)溫度介于22～32 ℃之間，花粉萌發(fā)率受處理時(shí)間的影響差異明顯，隨處理時(shí)間的增加，花粉萌發(fā)率顯著降低；當(dāng)溫度高于34 ℃，花粉無萌發(fā)，且花粉管形態(tài)異常。其中，處理時(shí)間越長(zhǎng)，高溫的影響更明顯。

32 ℃持續(xù)處理5 h后，花粉萌發(fā)率降低至10%以下；而34 ℃持續(xù)處理1 h和3 h，花粉萌發(fā)率降至2.0%以下。對(duì)于低溫而言，22 ℃持續(xù)處理5 h后，花粉萌發(fā)率降至5.1%；1 h處理的花粉萌發(fā)率為13.1%。說明隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，花粉萌發(fā)適宜溫度范圍縮小，即長(zhǎng)時(shí)間的極端溫度脅迫會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間處理的花粉萌發(fā)率均以28 ℃時(shí)最高，其中1 h處理的花粉萌發(fā)率最高，為37.2%。低溫或高溫脅迫下，花粉萌發(fā)率下降，即極端低溫(22 ℃)處理1、3、5 h后花粉萌發(fā)率分別下降64.7%、73.2%、86.0%；極端高溫(32 ℃)處理1、3、5 h后花粉萌發(fā)率分別下降51.8%、60.6%、74.2%。由此可知，花粉萌發(fā)受到極端低溫或高溫脅迫失活后，在脅迫時(shí)間上無顯著性差異。不同溫度相同處理時(shí)間的花粉管長(zhǎng)度以28℃時(shí)最長(zhǎng)，相同溫度不同處理時(shí)間以5 h處理的花粉管長(zhǎng)度最長(zhǎng)。然而，極端低溫或高溫脅迫下花粉管的生長(zhǎng)卻出現(xiàn)了退化。低溫(22 ℃)脅迫下1 h的花粉管長(zhǎng)度減少了55.0%，3 h減少了43.5%，5 h減少了40.0%。高溫(32 ℃)脅迫1、3、5 h下花粉管長(zhǎng)度分別減少約27.5%，32.6%，30.0%。說明與高溫脅迫相比，低溫脅迫對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制作用更大。試驗(yàn)中，22 ℃處理1、3、5 h的CSRI分別為-102.94、-93.24、-90.95，32 ℃處理1、3、5 h的CSRI分別為-71.10、-56.84、-69.52。低溫(22 ℃)脅迫下CSRI均小于高溫(32 ℃)脅迫，說明“熱農(nóng)1號(hào)”對(duì)低溫更敏感。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，杧果花粉萌發(fā)對(duì)低溫或高溫脅迫及脅迫時(shí)間都具有敏感性。在不同溫度和時(shí)間處理下，杧果花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度均有變化。對(duì)龍眼[18]、扁桃[12]和椰子[19]等作物的研究發(fā)現(xiàn)，低溫對(duì)作物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)有抑制作用；對(duì)菜豆[20]、大豆[21]、水蜜桃[22]等作物的高溫脅迫研究表明，高溫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用也很明顯，本研究結(jié)果類似。關(guān)于溫度變化對(duì)花粉萌發(fā)的不利影響，一些研究人員將不同物種甚至不同基因型的響應(yīng)程度聯(lián)系起來[23]，在溫度脅迫下對(duì)花粉進(jìn)行性能測(cè)試[24]。

我國(guó)杧果主要在南方熱區(qū)廣泛栽培，生產(chǎn)中，杧果花期常遭遇低溫陰雨天氣導(dǎo)致花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，進(jìn)而授粉受精不良而出現(xiàn)落果[24]。對(duì)“熱農(nóng)1號(hào)”不同溫度條件下花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)的累積應(yīng)激反應(yīng)指數(shù)(CSRI)分析發(fā)現(xiàn)，低溫對(duì)花粉管的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，與前人研究一致。對(duì)“熱農(nóng)1號(hào)”不同溫度脅迫下花粉萌發(fā)率變化分析發(fā)現(xiàn)，高溫比低溫對(duì)杧果花粉萌發(fā)造成的破壞性影響更大[25]。

范眸天等[5]研究發(fā)現(xiàn)，杧果花粉20 ℃以下無萌發(fā)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，22 ℃以下和32 ℃以上溫度，花粉活力隨溫度脅迫時(shí)間延長(zhǎng)變化較緩慢；而24～30 ℃時(shí)花粉活力隨時(shí)間變化比較迅速；20 ℃以下和34 ℃以上溫度花粉無萌發(fā)，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，花粉萌發(fā)率無明顯變化。說明“熱農(nóng)1號(hào)”杧果花粉萌發(fā)溫度介于22～32 ℃之間，其中花粉萌發(fā)最適溫度范圍為24～30 ℃。

采用離體萌發(fā)法，于盛花期對(duì)“熱農(nóng)1號(hào)”杧果花粉進(jìn)行不同溫度和持續(xù)時(shí)間的處理發(fā)現(xiàn)，溫度和持續(xù)時(shí)間均對(duì)花粉活力有明顯影響，花粉萌發(fā)率隨溫度變化呈類似正態(tài)分布；24～30 ℃溫度范圍內(nèi)花粉活力較好，當(dāng)溫度高于32 ℃或高溫處理時(shí)間5 h對(duì)花粉活力傷害均較大，低于20 ℃或高于34 ℃花粉不萌發(fā)。結(jié)合累積應(yīng)激反應(yīng)指數(shù)(CSRI)分析發(fā)現(xiàn)，低溫對(duì)花粉管長(zhǎng)度影響更明顯，高溫對(duì)花粉萌發(fā)影響更大?？偟膩碚f，“熱農(nóng)1號(hào)”杧果生殖期對(duì)低溫脅迫更敏感。