肖澤恒,甘 甜,秦 鐘,2**,章家恩,2**,石兆基,張春霞

(1.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院 廣州 510642;2.廣東省生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點實驗室/廣東省現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)與循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室 廣州 510642)

在生物的生長過程中,由于季節(jié)和環(huán)境的變化,生物經(jīng)常面臨食物缺乏的情況。在饑餓條件下,生物會減緩生長發(fā)育,并消耗儲能物質(zhì)為機體提供能量以維持生命活動。與此同時,生物在饑餓情況下,消化腺會產(chǎn)生大量活性氧,當活性氧的生成速率超過其清除速率時,多余的活性氧會破壞細胞從而導致消化腺組織損傷,威脅生命,這種氧化應(yīng)激也被認為是饑餓對生物造成負面影響的主要原因。因此,可通過測定生物的生長指標、抗氧化酶活性和生化物質(zhì)含量來評價其健康狀況及對環(huán)境的適應(yīng)狀況。

目前,有關(guān)福壽螺在饑餓脅迫下的生長和生化物質(zhì)變化方面的研究已有部分報道: 韓微研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)的饑餓脅迫致使福壽螺中螺(4.5 ± 0.5) g 體內(nèi)粗蛋白、粗脂肪、粗糖含量顯著低于對照;董勝張等研究發(fā)現(xiàn),間歇性饑餓脅迫下福壽螺的螺重和特定生長率顯著低于持續(xù)喂食的福壽螺(＜0.05)。對于福壽螺在饑餓條件下的抗氧化指標的變化研究則少見報道。本研究在已有工作的基礎(chǔ)上,研究了持續(xù)饑餓脅迫下福壽螺的形態(tài)生長指標及總蛋白、糖原等生化物質(zhì)的含量變化,同時測定了過氧化物酶活性、總超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性等抗氧化指標,以期揭示福壽螺應(yīng)對饑餓脅迫的生理生態(tài)對策,同時為研究其入侵機制及防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用福壽螺于2020年8月底采集自華南農(nóng)業(yè)大學增城基地同一稻田(113°4′E,23°1′N),為保證試驗用螺饑餓程度一致,于華南農(nóng)業(yè)大學土壤生態(tài)實驗室進行8 d 的雌雄混合暫養(yǎng),即采用塑料水族箱(45 cm × 35 cm × 35 cm)飼養(yǎng),并將其放置在有空調(diào)的室內(nèi)陽臺,暫養(yǎng)期間溫度控制在25 ℃,水深控制在15 cm,每天更換2/3 曝氣除氯自來水和投喂足量生菜(L.var.Hort.)。選取表觀正常、活力較強、體型較為一致的福壽螺個體用于試驗,試驗用螺的個體質(zhì)量為(3.69 ± 0.22) g,殼高為(24.25 ± 0.33) mm。

1.2 試驗處理

設(shè)置6 個試驗組,其中3 個饑餓處理組(STA):饑餓10 d (STA10)、饑 餓20 d (STA20)、饑 餓30 d(STA30),同時設(shè)置3 個對照組(CON): 飽食10 d(CON10)、飽食20 d (CON20)、飽食30 d (CON30),每個試驗組均設(shè)置5 個重復。試驗開始前,通過輕微打開福壽螺厴甲檢查陰莖鞘的存在與否或根據(jù)厴甲的形狀來區(qū)分雄螺和雌螺,并隨機選擇5 只雌螺和5 只雄螺放入直徑20 cm、高30 cm、容積為9.42 L 的柱狀玻璃缸中,作為一個重復,共300 只福壽螺被用于試驗。為避免福壽螺死亡帶來的密度差異,每個處理組另設(shè)2 個重復用于替代試驗中死亡的福壽螺,替代用螺120 只。試驗開始時,將裝有福壽螺的柱狀玻璃缸置于25 ℃、14 L∶10 D 下的人工氣候箱中,分別在10 d、20 d 和30 d 取出福壽螺進行指標測定。

1.3 日常管理

試驗過程中保持水深為15 cm,每天上午用含有飽和碳酸鈣的曝氣除氯自來水進行換水,換水量為原水量的2/3。饑餓處理組不投喂任何食物,對照組每天早上9:00 投喂足量新鮮生菜并取出前一天未被吃完的生菜。

1.4 測定方法

在第10 d、第20 d、第30 d 隨機選取饑餓組和對照組中的福壽螺各10 只(每個重復中取2 只),用毛巾擦干表面水分后,用精確到0.01 g 的天平稱量體質(zhì)量()。用精確到0.01 mm 的游標卡尺測量福壽螺的殼高、殼寬、殼口長和殼口寬。測量后的福壽螺被放回試驗玻璃缸中。

兩組治療前FBG、2hPG、HbA1c間無顯著差異，治療后兩組血糖相關(guān)指標均較治療前顯著降低（P＜0.05），且觀察組顯著低于對照組（P＜0.05），見表2。

在第10 d、第20 d、第30 d 隨機選取饑餓組和對照組中的福壽螺各5 只(每個重復中隨機取1 只,不分雌雄),解剖分離出消化腺組織,用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。測時按1∶9 的質(zhì)量體積比加入預冷的生理鹽水,冰水浴中用電動高速勻漿器制成10%的組織勻漿液,勻漿液在4 ℃下3000 r·min離心10 min,取上清液用于過氧化物酶(POD)活性、總超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的測定。

各類酶的活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行測定,其中POD 活性采用催化過氧化氫法,定義為37 ℃條件下,每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg 底物的酶量為一個酶活力單位。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定,其定義為37 ℃條件下,每毫克組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD 量為1 個活力單位(U)。CAT活性采用鉬酸銨顯色法測定,其定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol HO的量為1 個活力單位。GSH 含量測定采用DTNB 法,單位為mg·g(以prot計)。MDA 含量用TBA(硫代巴比妥酸)法測定,單位為nmol·mg(以prot 計)。

在第10 d、第20 d、第30 d 隨機選取饑餓組和對照組中的福壽螺各5 只(每個重復中隨機取1 只,不分雌雄)測定其自由水、結(jié)合水、甘油、脂肪、糖原和總蛋白的含量。自由水和結(jié)合水含量采用質(zhì)量法測定,甘油含量采用徐淑等的方法測定,脂肪含量采用Folch 法測定;糖原含量采用蒽酮比色法測定;總蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法,單位為g·L。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 軟件整理數(shù)據(jù),采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行獨立樣本檢驗,分析比較相同處理時間下的CON 組與STA 組的差異,＜0.05代表有顯著性差異。文中的數(shù)據(jù)均表示為平均值±SE。用R 語言的“ggplot2”程序包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓脅迫對福壽螺生長發(fā)育的影響

如圖1所示,在饑餓脅迫下,處理組福壽螺的體質(zhì)量、殼高、殼寬、殼口長和殼口寬在10 d 時均未與對照組形成顯著差異。但隨時間延長至20 d,殼高和殼口長的生長受到抑制且顯著低于對照(＜0.05)。饑餓處理30 d 后,福壽螺各形體指標均顯著低于對照組(＜0.05)。

圖1 饑餓脅迫對福壽螺生長的影響Fig.1 Effects of starvation stress on the growth of Pomacea canaliculata

2.2 饑餓脅迫對福壽螺消化腺抗氧化系統(tǒng)的影響

如圖2所示,在饑餓脅迫10 d、20 d、30 d 時,處理組福壽螺POD 活性和GSH 含量與對照組均未形成顯著差異。在10 d 時,饑餓處理下的福壽螺SOD活性與對照組無顯著差異;20 d 和30 d 時,處理組SOD活性(10.97 U·mg和10.77 U·mg)顯著高于對照組(10.11 U·mg和9.97 U·mg) (＜0.05)。處理組福壽螺CAT 活性在10 d、20 d 時與對照組無顯著差異;30 d 時處理組(38.13 U·mg)顯著高于對照組(28.60 U·mg) (＜0.05)。饑餓組MDA 含量在10 d、20 d時與對照組無顯著差異,到30 d 時處理組(1.19 nmol·mg)顯著高于對照組(0.93 nmol·mg) (＜0.05)。

圖2 饑餓脅迫對福壽螺抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.2 Efects of starvation stress on antioxidant system of Pomacea canaliculata

2.3 饑餓脅迫對福壽螺生化物質(zhì)含量的影響

饑餓脅迫對福壽螺生化指標的影響如圖3所示。在前20 d,饑餓處理下的福壽螺總蛋白含量與對照組無顯著差異,但在30 d 時饑餓處理組福壽螺總蛋白含量(85.91 g·L)顯著低于對照組(93.64 g·L) (＜0.05)。饑餓處理組福壽螺糖原含量在10 d 時與對照組無顯著差異,在20 d 和30 d 時顯著低于對照組(＜0.05)。饑餓處理組福壽螺甘油含量在第10 d 顯著高于對照組(＜0.05),而在20 d 和30 d 時顯著低于對照組(＜0.05)。福壽螺脂肪含量在10 d、20 d 和30 d均顯著低于對照組(＜0.05),且隨著饑餓脅迫時間的增加,與對照組的差異越來越顯著,30 d 時處理組脂肪含量只有對照組的60.14%。饑餓處理下福壽螺自由水含量在10 d 時與對照組無顯著差異,在20 d 和30 d 時處理組福壽螺自由水含量顯著高于對照組(＜0.05)。饑餓處理組福壽螺結(jié)合水含量在整個饑餓期間與對照無顯著差異。

圖3 饑餓脅迫對福壽螺生化物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of starvation stress on the contents of biochemical substances in Pomacea canaliculata

3 討論

3.1 饑餓脅迫對福壽螺生長和含水量的影響

在饑餓條件下,水生生物無法有效從外界獲取能量物質(zhì),只能通過消耗自身儲能物質(zhì)和減緩生長發(fā)育來維持生命活動,形體指標可以直觀地反映生物自身的生長狀況。福壽螺在饑餓脅迫30 d 后,體質(zhì)量顯著低于對照組(圖1a),這與薛明等對方斑東風螺(Link)的研究結(jié)果一致。值得一提的是,試驗過程中并沒有觀察到處理組福壽螺體質(zhì)量的下降,原因可能是含水量的升高導致,如圖3e 所示,處理組福壽螺自由水含量在10 d 時未與對照形成顯著差異,但在20 d 和30 d,自由水含量顯著高于對照,表明福壽螺主要通過增加自由水含量的方法阻止了體質(zhì)量的下降。事實上,無脊椎動物普遍存在用水替代組織中損失的有機物的行為。但福壽螺用水替代有機物損失的原因仍不明確,因此需進一步研究福壽螺在饑餓狀態(tài)下增加自由水含量的原因和潛在作用。動物殼的增長主要來源于鈣化過程,軟體動物利用外套膜上皮細胞分泌出碳酸鈣和殼基質(zhì)用以構(gòu)建動物殼。本試驗中,福壽螺殼高、殼寬、殼口長和殼口寬在30 d 時均顯著低于對照,表明饑餓脅迫下鈣化過程受到了抑制。在馬氏珠母貝(Dunker)中就觀察到饑餓抑制殼生長的現(xiàn)象,但具體抑制機理目前尚不明確,有待進一步研究。

3.2 饑餓脅迫對福壽螺消化腺抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD 能加速自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,POD 和CAT 能將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水,從而清除了自由基,還原型GSH 既可抵抗活性氧的氧化損傷,同時還是其他抗氧化酶作用的底物。在本研究中,30 d 的饑餓脅迫并未對福壽螺的POD 活性和GSH 含量造成顯著影響(圖2a,d)。隨著饑餓時間的延長,SOD、CAT 活性逐漸上升,第10 d 時SOD、CAT 活性與對照無明顯差異(圖2b,c),SOD 活性在20 d 和30 d 時顯著高于對照。這可能是自由基在SOD 的作用下被還原為HO,隨著SOD 活性逐漸升高,HO含量增加,誘導了CAT 的表達增加,致使30 d 時CAT 活性顯著高于對照。前期的饑餓脅迫不足以誘導福壽螺消化腺活性氧的大量產(chǎn)生,但隨著饑餓時間的延長,機體中產(chǎn)生了大量的自由基,福壽螺受到氧化脅迫,進而調(diào)動了福壽螺抗氧化系統(tǒng)的運作。

MDA 是不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物之一,被認為是自由基介導損傷的良好標志物。MDA產(chǎn)生的數(shù)量代表了脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映組織細胞受自由基攻擊的程度。MDA 含量在10 d和20 d 時與對照無顯著差異,隨著時間延長至30 d,MDA 顯著高于對照(圖2e),這一結(jié)果再次證明了前期的饑餓脅迫不能對福壽螺消化腺組織產(chǎn)生氧化損傷,但隨著時間延長,脂質(zhì)過氧化程度加劇,消化腺細胞受到自由基的破壞。MDA 與SOD、CAT 的變化共同說明了福壽螺在饑餓脅迫下的氧化損傷程度和抗氧化系統(tǒng)的運行狀態(tài)。在管角螺(Gmelin)中也觀察到相似的結(jié)果。

3.3 饑餓脅迫下福壽螺生化物質(zhì)含量的變化

饑餓脅迫下,動物會消耗內(nèi)源性物質(zhì)以供給機體能量,這些物質(zhì)的消耗順序和重要性因物種而異,如無脊椎生物紫貽貝(Linnaeus)和虎紋對蝦(Haswell)在食物缺乏的情況下優(yōu)先消耗蛋白質(zhì)作為能量來源。方斑東風螺(Link)在饑餓下優(yōu)先消耗脂肪和糖原,饑餓90 d 后開始消耗蛋白質(zhì)。高背紅螺(Say)在饑餓時首先消耗葡萄糖或糖原,然后利用脂質(zhì),最后利用蛋白質(zhì)。在本研究中,福壽螺在沒有食物供應(yīng)的情況下,脂肪含量于10 d 開始顯著低于對照并持續(xù)到30 d (圖3d),說明10 d 的禁食對福壽螺能量消耗造成影響,隨著饑餓時間的延長,糖原含量于20 d 開始顯著低于對照(圖3b),當饑餓時間延長至30 d 時,福壽螺總蛋白含量顯著低于對照(圖3a),表明饑餓脅迫下福壽螺可能最優(yōu)先利用體內(nèi)存儲的脂質(zhì)為機體提供能量,隨后調(diào)用糖原和總蛋白。福壽螺的營養(yǎng)消耗策略與腹足綱的方斑東風螺(Link)營養(yǎng)消耗策略類似。

甘油是甘油三酯(脂質(zhì)的組成成分)水解代謝的最終產(chǎn)物,因此測量甘油含量更能清楚地表明甘油三酯分解的速率。同時,甘油是重要的糖異生前體,生物在長期饑餓狀態(tài)下會將甘油轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃糜跔I養(yǎng)消耗。福壽螺在饑餓10 d 時,甘油含量顯著高于對照,表明甘油三酯作為脂質(zhì)在饑餓前期被大量消耗,甘油三酯的分解速率提高。隨著時間延長,福壽螺甘油含量在20 d 和30 d 時顯著低于對照,表明福壽螺體內(nèi)甘油三酯的分解速率下降,可利用的甘油三脂含量降低,福壽螺難以通過甘油三酯的代謝為機體提供充足的能量。

4 結(jié)論

本試驗探討了福壽螺面對饑餓脅迫時的生存策略,結(jié)果表明,隨著饑餓時間的延長,福壽螺自由水含量持續(xù)上升,體質(zhì)量、殼高、殼寬、殼口長和殼口寬的生長受到抑制;總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性及丙二醛含量隨饑餓時間的延長逐漸高于對照;甘油、脂肪、糖原和總蛋白的含量在饑餓30 d后均顯著低于對照。福壽螺通過減緩生長、提高抗氧化能力、消耗內(nèi)源性生化物質(zhì)等生理機制來緩解脅迫帶來的影響。結(jié)果將有助于加深我們對福壽螺的環(huán)境響應(yīng)的理解,并為研究其防控策略提供參考。另外,本試驗發(fā)現(xiàn)福壽螺在饑餓脅迫下會提高螺體內(nèi)自由水含量,但該行為的具體原因和潛在作用尚未明確,有待進一步研究。