葉盛嘉,鄭晨萌,張 影,劉 星

(河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院/河南省生物藥肥研發(fā)與協(xié)同應(yīng)用工程研究中心 新鄉(xiāng) 453003)

施肥是提高作物生產(chǎn)力的基本手段。作物最佳養(yǎng)分管理要求實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出、養(yǎng)分資源利用效率和生態(tài)環(huán)境保護(hù)相協(xié)調(diào)。然而,目前我國糧食作物生產(chǎn)中化學(xué)肥料特別是氮肥的過量施用已成為普遍現(xiàn)象。氮肥過量投入不僅降低養(yǎng)分利用效率,破壞土壤(肥力)質(zhì)量,也導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重破壞。在確保穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的同時(shí),減少糧食生產(chǎn)系統(tǒng)化學(xué)氮肥投入,建立高效的作物養(yǎng)分管理策略是農(nóng)學(xué)工作者面臨的重要課題,也是農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的必然要求。

大量研究業(yè)已證明,化肥或有機(jī)肥的單一施用并非集約化條件下維持作物長期可持續(xù)性生產(chǎn)的最佳措施。綜合作物養(yǎng)分管理要求有機(jī)無機(jī)肥料配合施用,這不僅能夠增加作物生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可持續(xù)性,同時(shí)也能夠顯著改善土壤質(zhì)量。更重要的是,有機(jī)(類)肥料含有豐富的有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分資源,增加有機(jī)肥投入能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)化學(xué)肥料的部分替代,降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)化肥的依賴性,這對(duì)于減少農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)化學(xué)肥料投入具有重要意義。近來對(duì)多個(gè)作物生產(chǎn)體系的研究也表明,在滿足作物養(yǎng)分需求的前提下,減少一定比例的化肥投入并配施有機(jī)肥依然能夠維持作物高產(chǎn)甚至顯著增產(chǎn),同時(shí)提高土壤肥力,改善養(yǎng)分利用效率,減少施肥的環(huán)境代價(jià)。然而,受限于不同地域間在氣候條件、種植結(jié)構(gòu)、施肥方法和土壤性質(zhì)上的巨大差異,進(jìn)行區(qū)域化的、有針對(duì)性的作物養(yǎng)分管理推薦對(duì)于改善糧食生產(chǎn)、確保國家糧食安全更具現(xiàn)實(shí)意義。

微生物(組)是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,其具有高度的遺傳和功能多樣性,并在土壤培肥、養(yǎng)分循環(huán)、污染物降解、作物抗病(防病)和植物促生等方面發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。同時(shí),土壤微生物在增強(qiáng)作物逆境脅迫抗性方面也扮演著重要角色。作為土壤質(zhì)量的生物指征和土壤培肥的重要參與者,土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成受施肥量和肥料類型強(qiáng)烈調(diào)控,闡明化肥減量配施有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落的影響有助于從土壤生態(tài)學(xué)角度探索最佳的作物養(yǎng)分管理策略。然而,目前有關(guān)化肥減量及其配施有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落影響的報(bào)道依然較少。

豫中地區(qū)地處黃淮海平原,是我國糧食主產(chǎn)區(qū)之一,冬小麥(L.)-夏玉米(L.)輪作是區(qū)內(nèi)主要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式,但常年存在著氮肥過量投入和忽視有機(jī)肥施用等嚴(yán)重問題。本文以豫中地區(qū)冬小麥-夏玉米輪作系統(tǒng)為研究對(duì)象,基于田間試驗(yàn),探討了化學(xué)氮肥不同比例減量并配施有機(jī)肥對(duì)作物生產(chǎn)力、土壤理化和生化性質(zhì)的影響。同時(shí),采用高通量擴(kuò)增子測序的方法,進(jìn)一步研究了化學(xué)氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的影響。本研究旨在為區(qū)內(nèi)冬小麥-夏玉米輪作生產(chǎn)系統(tǒng)的合理施肥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況

田間定位試驗(yàn)于2016年10月至2019年10年在河南省漯河市臨潁縣臺(tái)陳鎮(zhèn)裴墩村(33.78°N,113.96°E,海拔約60 m)進(jìn)行,冬小麥和夏玉米各種植3 季。該區(qū)屬溫帶季風(fēng)氣候,四季分明;降水受季風(fēng)影響較明顯,夏季炎熱多雨,冬季寒冷干燥。年平均氣溫約14.5 ℃,全年無霜期226 d 左右,光照時(shí)長2600 h 左右。年平均降水量約720 mm,受季風(fēng)影響,全年降水極不均勻,雨量多集中在6月、7月和8月。供試土壤為壤質(zhì)潮土,土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)為: 有機(jī)質(zhì)26.63 g·kg,全氮1.68 g·kg,pH 為7.97 (水土比5∶1),堿解氮36.52 mg·kg,速效磷18.20 mg·kg,速效鉀175.40 mg·kg。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇地勢(shì)平坦、整齊且肥力均勻的地塊進(jìn)行田間定位試驗(yàn),播前采集混合土樣測定耕層土壤基本理化性質(zhì)。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)10 個(gè)處理,如表1所示。CK 為完全不施肥對(duì)照。100%CNF 為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶常規(guī)施肥對(duì)照,呈典型的高氮投入且無有機(jī)肥施用。在100%CNF 的基礎(chǔ)上,逐漸減少20%的化學(xué)氮肥投入,同時(shí)減量的化學(xué)氮肥分別與6000 kg·hm有機(jī)肥配施,有機(jī)肥在小麥和玉米季各施用一半(3000 kg·hm)。每個(gè)處理3 次重復(fù),完全隨機(jī)區(qū)組排列,小區(qū)面積54 m(6.0 m×9.0 m),小區(qū)間保留1 m 過道,試驗(yàn)地四周留保護(hù)行?；视煤琋 46%的尿素、含PO12%的過磷酸鈣和含KO 51%的硫酸鉀。鑒于當(dāng)?shù)赜袡C(jī)肥源缺乏,施用商品有機(jī)肥,購自河南省鶴壁市人元生物技術(shù)發(fā)展有限公司。商品有機(jī)肥生產(chǎn)以牛糞為主料、秸稈和蘑菇菌包為輔料進(jìn)行好氧堆肥,而后肥堆添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等有益菌液進(jìn)行二次固體發(fā)酵,肥料成品含有機(jī)質(zhì)40%、N 2.0%、PO1.5%、KO 1.5%,有效活菌數(shù)≥0.5×10cfu·g。有機(jī)肥在播種前通過旋耕機(jī)翻入0～15 cm 深度土壤,化肥隨種子進(jìn)行種肥同播。有機(jī)肥、磷肥、鉀肥和50%氮肥在播種時(shí)作基肥施用,剩余50%氮肥作追肥(小麥返青期追施,玉米拔節(jié)期追施)。供試小麥品種為‘泛麥8 號(hào)’,玉米品種為‘吉祥1 號(hào)’。小麥播種量為225 kg·hm,玉米種植密度為6.75×10株·hm。小麥和玉米行距分別為23 cm 和70 cm。根據(jù)需要定期進(jìn)行除草和灌溉等管理措施,其余田間管理措施同常規(guī)大田。小麥和玉米收獲后,地上部秸稈通過機(jī)械全量還田。

表1 田間試驗(yàn)各處理施肥量Table 1 Fertilization rates in different treatments employed in the present study kg·hm-2

1.3 樣品采集與分析

每年6月和10月作物收獲時(shí)測產(chǎn)。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi),小麥隨機(jī)采集3 個(gè)1 m 雙行樣方、玉米隨機(jī)采集1 個(gè)5 m 雙行樣方,將地上部植株樣品全部收獲,掛牌區(qū)分,帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干、脫粒、稱重,按采樣面積折算籽粒產(chǎn)量和地上部生物量。土壤樣品在2019年10月玉米收獲時(shí)采集,每個(gè)小區(qū)按5 點(diǎn)取樣法用土鉆采集耕層(0～20 cm)土樣,剔除石礫和植物殘根等雜物,混合均勻后裝入自封袋,密封帶回實(shí)驗(yàn)室。新鮮土樣分成3 部分: 一部分置于室外風(fēng)干,而后研磨過1 mm 和0.25 mm 篩,分別裝瓶保存用于土壤理化指標(biāo)測定;一部分過1 mm 篩,立即進(jìn)行土壤礦質(zhì)氮含量和酶活性測定;另一部分過1 mm 篩后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi),用于土壤微生物分析。

土壤pH 采用pH 電位計(jì)測定(水土比5∶1),全氮含量采用濃硫酸混合加速劑-半微量凱氏定氮法測定,有效磷含量采用0.5 mol·LNaHCO浸提-鉬銻抗比色法測定,速效鉀含量采用1.0 mol·L醋酸銨浸提-火焰光度法測定,有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定,銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量采用2 mol·LKCl 浸提-流動(dòng)注射分析儀測定。土壤易氧化有機(jī)碳含量測定參照Zhang 等的方法。土壤酶包括脲酶、蔗糖酶、脫氫酶、堿性磷酸酶、芳基硫酸酯酶和β-葡萄糖苷酶活性測定方法參考實(shí)驗(yàn)工具書。

稱取約0.5 g 新鮮土壤樣品,根據(jù)產(chǎn)品說明書上的步驟,使用PowerSoil DNA 試劑盒提取土壤微生物總DNA。DNA 的提取質(zhì)量和純度采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的微生物總DNA 溶解在50 μL洗脫緩沖液中并保存于-20 ℃冰箱備用。采用高通量擴(kuò)增子測序評(píng)估不同施肥處理間土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成差異(Illumina NovaSeq PE250 平臺(tái))。以土壤微生物總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)片段,擴(kuò)增引物對(duì)為338F/806R。PCR 擴(kuò)增條件為: 98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸5 min,10 ℃保溫。PCR 擴(kuò)增體系(25 μL):5 μL reaction buffer (5×),5 μL GC buffer (5×),2 μL dNTPs (2.5 mmol·L),引物各1 μL (10 μmol·L),2 μL DNA模 板,8.75 μL ddHO,0.25 μL Q5 DNA Polymerase。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用Agarose Gel DNA 純化試劑盒進(jìn)行純化,分光光度計(jì)測定濃度,最后將PCR 產(chǎn)物等量混合,送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。對(duì)高通量測序下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾(Trimmomatic 軟件)和雙端拼接(FLASH 軟件),參照官方教程,菌群多樣性采用QIIME 2.0 軟件分析(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)。采用RDP classifier 貝葉斯算法以99%相似性閾值進(jìn)行ASV(amplicon sequence variants)聚類,各ASV 物種分類信息比對(duì)以Greengenes 13_8 為參考數(shù)據(jù)庫,分類置信度閾值70%。對(duì)所得到的高質(zhì)量序列,按最小樣本序列數(shù)抽平(每個(gè)土壤樣本68 071 條序列),進(jìn)行α 和β 多樣性分析。應(yīng)用MOTHUR 軟件計(jì)算菌群α 多樣性指數(shù)。采用基于Bray-Curtis 距離算法的主坐標(biāo)分析(PCoA)比較不同處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異(即β 多樣性),利用相似度分析(ANOSIM)檢驗(yàn)處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異顯著性。通過CANOCO 5.0 軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行冗余分析(RDA),各土壤理化因子的顯著性采用Monte Carlo 檢驗(yàn)。采用共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析評(píng)估細(xì)菌群落成員之間互作強(qiáng)度及復(fù)雜性,共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)通過Gephi 軟件計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和圖表繪制在Microsoft Excel 2007 和SigmaPlot 12.0 軟件上 進(jìn)行,使 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理間差異的顯著性檢驗(yàn)(one-way Duncan’s test,＜0.05)。圖表中試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示(=3)。不同數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析采用常見的一元回歸模型進(jìn)行。土壤理化性質(zhì)和酶活性結(jié)果均采用土壤干基表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)籽粒產(chǎn)量和地上部生物量的影響

各試驗(yàn)?zāi)攴菹滦←満陀衩鬃蚜．a(chǎn)量及地上部生物量均以CK 和OF 處理最低(表2),表明不施肥或者單施有機(jī)肥極大地削弱了作物生產(chǎn)力。在不施用有機(jī)肥情況下,80%CNF 處理獲得了最高的小麥產(chǎn)量,且在2017年該處理較100%CNF 顯著增產(chǎn)約9.67% (＜0.05)。80%CNF 和60%CNF 處理間小麥產(chǎn)量無顯著差異,表明即使單獨(dú)減少40%的化學(xué)氮肥施用依然能夠維持相對(duì)較高的小麥產(chǎn)量。然而,在配施有機(jī)肥條件下,80%CNF+OF、60%CNF+OF和 40%CNF+OF 處理小麥產(chǎn)量與80%CNF 均無顯著差異,說明配施有機(jī)肥能夠進(jìn)一步減少化學(xué)氮肥用量。小麥地上部生物量在各年份下均以80%CNF+OF 處理最高,80%CNF 次之,二者都顯著高于100%CNF 處理(＜0.05),但二者之間無顯著差異。除2017年外,60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理小麥地上部生物量較80%CNF 均無顯著差異。

表2 2017—2019年各施肥處理下小麥、玉米的籽粒產(chǎn)量和地上部生物量Table 2 Grain yields and aboveground biomasses of wheat and maize under different fertilization treatments from 2017 to 2019 t·hm-2

在不施用有機(jī)肥情況下,80%CNF 處理獲得了最高的玉米籽粒產(chǎn)量。連續(xù)3 個(gè)試驗(yàn)?zāi)攴菹?0%CNF處理玉米產(chǎn)量較100%CNF 分別顯著增加32.39%、28.06%和51.42% (＜0.05),且在2017年60%CNF 處理玉米產(chǎn)量較100%CNF 顯著增加20.00% (＜0.05),說明當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶玉米種植過程中存在嚴(yán)重的氮肥過量施用,減施化學(xué)氮肥能夠顯著改善玉米生產(chǎn)力。2017年和2018年80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理玉米產(chǎn)量與80%CNF 均無顯著差異;2019年80%CNF+OF 和60%CNF+OF 處理玉米產(chǎn)量較80%CNF 無顯著差異,但40%CNF+OF 處理產(chǎn)量顯著降低15.52% (＜0.05)。玉米地上部生物量在3 個(gè)試驗(yàn)?zāi)攴菥?0%CNF 處理最高,顯著高于100%CNF 處理(＜0.05),但與80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理無顯著差異。

2.2 氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

不同處理間有機(jī)質(zhì)、易氧化有機(jī)碳和全氮含量及pH 均無顯著差異(表3)。40%CNF+OF 處理銨態(tài)氮含量較CK 和100%CNF 分別顯著增加56.25%和54.32% (＜0.05),其余處理無顯著變化。與100%CNF 相比,減施氮肥能夠顯著降低土壤硝態(tài)氮含量(＜0.05),且隨著減氮比例增加,硝態(tài)氮含量整體呈遞減趨勢(shì)。與100%CNF 相比,減施氮肥及其與有機(jī)肥配施并不能顯著改變土壤速效磷含量。80%CNF處理土壤速效鉀含量較100%CNF 顯著增加37.36%(＜0.05),但其余處理無顯著變化。

表3 2019年玉米收獲時(shí)各施肥處理下土壤理化性質(zhì)Table 3 Soil physicochemical properties under different fertilization treatments at maize harvest in 2019

2.3 氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)土壤酶活性的影響

脲酶活性以40%CNF+OF 處理最高,較100%CNF、80%CNF、60%CNF 和40%CNF 處理分別顯著增加36.08%、38.71%、35.96%和36.78% (＜0.05),但與100%CNF+OF、80%CNF+OF 和60%CNF+OF處理無顯著變化(表4)。與100%CNF 相比,僅100%CNF+OF 處理蔗糖酶活性顯著增加28.09% (＜0.05)。減施氮肥及其與有機(jī)肥配施較100%CNF 并不能顯著改變堿性磷酸酶和脫氫酶活性。60%CNF+OF 處理芳基硫酸酯酶活性最高,較100%CNF、80%CNF、60%CNF、40%CNF 和40%CNF+OF 處理分別顯著增加72.73%、88.98%、76.96%、89.70%和67.42%(＜0.05),但與100%CNF+OF 和80%CNF+OF 處理無顯著變化。除60%CNF+OF 處理外,其余減氮處理β-葡萄糖苷酶活性與100%CNF 無顯著變化。

表4 2019年玉米收獲時(shí)各施肥處理下土壤酶活性的比較Table 4 Soil enzymes activities under different fertilization treatments at maize harvest in 2019

2.4 氮肥減量配施有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

不同處理間土壤細(xì)菌群落物種數(shù)、豐富度和譜系多樣性指數(shù)均無顯著差異(表5)。香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和均勻度指數(shù)均以CK 最高,且顯著高于100%CNF 處理(＜0.05),表明農(nóng)戶常規(guī)施肥降低了細(xì)菌群落α 多樣性。與100%CNF 相比,減施氮肥及其與有機(jī)肥配施處理香農(nóng)指數(shù)無顯著改變,但辛普森和均勻度指數(shù)改變明顯。60%CNF、60%CNF+OF和40%CNF+OF 處理辛普森指數(shù)較100%CNF 顯著增加;60%CNF、80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理均勻度指數(shù)較100%CNF 也有顯著增加(＜0.05)。這些結(jié)果表明,減施適量氮肥或其與有機(jī)肥配施能夠改善土壤細(xì)菌群落α 多樣性。農(nóng)戶常規(guī)施肥對(duì)土壤細(xì)菌群落α 多樣性的不利影響能夠通過減氮施肥或其與有機(jī)肥配施得到一定程度的修復(fù)。

表5 2019年玉米收獲時(shí)各施肥處理下土壤細(xì)菌群落α 多樣性的比較Table 5 The α diversity of soil bacterial community under different fertilization treatments at maize harvest in 2019

PCoA 分析和ANOSIM 檢驗(yàn)證明不同處理間土壤細(xì)菌群落β 多樣性存在顯著差異(＜0.05) (圖1A)。有機(jī)肥施用并不能對(duì)細(xì)菌群落β 多樣性產(chǎn)生顯著影響(圖1B),但化肥施用強(qiáng)烈改變了細(xì)菌群落β 多樣性(＜0.05) (圖1C 和1D)?？紤]到CK 和OF 處理完全不施用任何化肥,在排除CK 和OF 土壤樣本后發(fā)現(xiàn),不施用有機(jī)肥條件下減施化學(xué)氮肥依然顯著改變了細(xì)菌群落β 多樣性(＜0.05) (圖1E),但這種改變會(huì)因配施有機(jī)肥而抵消(圖1F)?？偟膩砜?減施氮肥而非有機(jī)肥施用顯著影響了土壤細(xì)菌群落β 多樣性。

圖1 2019年玉米收獲時(shí)各施肥處理下土壤細(xì)菌群落β 多樣性的比較Fig.1 The β diversity of soil bacterial community under different fertilization treatments at maize harvest in 2019

土壤細(xì)菌群落中有8 個(gè)門的平均相對(duì)豐度超過1%,這些細(xì)菌門共占約94%的總回收序列(表6)。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)成員,其平均相對(duì)豐度均超過10%。與100%CNF 相比,減施氮肥及其與有機(jī)肥配施并不能顯著影響變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、髕骨細(xì)菌門和芽單胞菌門平均相對(duì)豐度。疣微菌門平均相對(duì)豐度在不同處理間無顯著差異。60%CNF、80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理放線菌門平均相對(duì)豐度較100%CNF 分別顯著降低10.92%、13.04%、14.39%和13.68% (＜0.05),但其余減氮處理無顯著變化。

表6 2019年玉米收獲時(shí)各施肥處理下土壤主要細(xì)菌門平均相對(duì)豐度的比較Table 6 Average relative abundances of soil major bacterial phyla under different fertilization treatments at maize harvest in 2019 %

細(xì)菌群落中最豐富的50 個(gè)屬共占總回收序列50%左右(圖2)。與100%CNF 相比,9 個(gè)細(xì)菌屬平均相對(duì)豐度在減氮配施有機(jī)肥處理下發(fā)生了顯著改變(＜0.05),分別是unclassified Gp6 (未分類酸桿菌Gp6)、(鞘氨醇單胞菌屬)、(類諾卡氏菌屬)、(韓國生工屬)、(列契瓦尼而氏菌屬)、(原小單孢菌屬)、(馬賽菌屬)、(羅布泊糖霉菌屬)和(東菌屬)。其中,除、和外,其余6 個(gè)細(xì)菌屬平均相對(duì)豐度均≥1%,顯示減氮配施有機(jī)肥顯著改變了細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)屬豐度。減氮配施有機(jī)肥處理增加了unclassified Gp6 和的平均相對(duì)豐度,60%CNF+OF 處理這2 個(gè)屬的平均相對(duì)豐度較100%CNF 分別顯著增加31.23%和40.74% (＜0.05)。相反,剩余7個(gè)細(xì)菌屬平均相對(duì)豐度因減氮配施有機(jī)肥而出現(xiàn)下降(＜0.05)。具體來看,與100%CNF 相比,80%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度降低20.00%;80%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度分別降低32.44%和36.51%;80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度分別降低33.88%、32.35%和31.19%;40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度降低45.88%;80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度分別降低28.60%、46.30%和42.77%;80%CNF+OF、60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度分別降低47.24%、44.13%和55.81%;40%CNF+OF 處理平均相對(duì)豐度降低23.78%。

圖2 2019年玉米收獲時(shí)土壤細(xì)菌群落中最豐富的50 個(gè)屬在不同施肥處理下的平均相對(duì)豐度變化Fig.2 Average relative abundances of top 50 abundant genera in soil bacterial community under different fertilization treatments at maize harvest in 2019

RDA 分析表明,速效鉀和硝態(tài)氮含量是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最重要的2 個(gè)土壤理化因子(圖3A),二者分別解釋了15.60%和9.40%的處理間群落結(jié)構(gòu)差異,且解釋程度均達(dá)到顯著水平(＜0.05) (圖3B)。

圖3 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系Fig.3 Relationship of soil physicochemical properties and bacterial community structure

將相同減氮量的施肥處理歸為一類(=6),繪制共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)探討了細(xì)菌群落成員之間的互作強(qiáng)度及復(fù)雜性。不同減氮條件下(即100%CNF、80%CNF、60%CNF 和40%CNF)細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)如表7所示。減施化學(xué)氮肥增加了土壤細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。首先,減施氮肥增強(qiáng)了群落成員間的互作強(qiáng)度,與100%CNF 相比,60%CNF 和40%CNF處理網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)分別增加42.06%和46.11%,圖形密度也分別增加42.86%和48.98%;其次,盡管各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)相似,但60%CNF 和40%CNF 處理細(xì)菌群落較100%CNF 和80%CNF 相比具有更模塊化的組織結(jié)構(gòu),各節(jié)點(diǎn)更加聚集成簇(模塊),即更少的模塊數(shù)和更高的平均聚類系數(shù);第三,減施氮肥增強(qiáng)了細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的連通性,60%CNF 和40%CNF 處理網(wǎng)絡(luò)平均路徑長度較100%CNF 分別降低8.78%和8.81%,平均度較100%CNF 分別增加42.04%和47.36%。

表7 2019年玉米收獲時(shí)土壤不同減氮處理下細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)比較Table 7 Topological properties of bacterial co-occurrence networks under reduced N fertilization conditions at maize harvest in 2019

3 討論

3.1 氮肥減量配施有機(jī)肥的產(chǎn)量效應(yīng)

通過3年的田間定位試驗(yàn),本研究證明試驗(yàn)區(qū)內(nèi)冬小麥-夏玉米輪作系統(tǒng)存在著嚴(yán)重的氮肥過度投入現(xiàn)象,糧食生產(chǎn)減氮潛力較大,特別是在玉米季,減少氮肥用量,籽粒產(chǎn)量出現(xiàn)大幅度增加,這表明在長期過度施氮地塊上降低后續(xù)氮肥投入能夠形成積極的產(chǎn)量反饋(表2)。不施用有機(jī)肥條件下,80%CNF處理小麥和玉米產(chǎn)量均達(dá)最高,說明該處理下施氮量(小麥季180 kg·hm、玉米季216 kg·hm)為一個(gè)相對(duì)合適的水平(求解施氮量和籽粒產(chǎn)量的一元二次擬合方程顯示小麥最佳施氮量約165 kg·hm,相當(dāng)于73.33%CNF;玉米最佳施氮量約193 kg·hm,相當(dāng)于71.48%CNF),因此在80%CNF 基礎(chǔ)上繼續(xù)探索減氮潛力更具重要意義。本研究表明,施用有機(jī)肥能夠進(jìn)一步擴(kuò)展氮肥減量空間,具體來看,3年田間試驗(yàn)過程中80%CNF 處理所獲得的小麥產(chǎn)量與60%CNF+OF 和40%CNF+OF 處理無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,玉米產(chǎn)量與60%CNF+OF 處理無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這意味著單從減氮角度而言,小麥和玉米季各減少60%和40%的化學(xué)氮肥投入同時(shí)配施有機(jī)肥能夠維持相對(duì)較高的產(chǎn)量水平。有機(jī)肥本身含有一部分氮素能夠供作物所需是其可以降低氮肥用量的直接原因。同時(shí),有機(jī)肥中氮素緩效釋放,使土壤具有更為持久的供氮能力,且有機(jī)肥施用能夠提高土壤微生物數(shù)量和活性,使得更多的無機(jī)氮被微生物快速固定,減少作物生育前期土壤氮素?fù)p失,這些都有助于擴(kuò)展減氮空間。不僅如此,有機(jī)肥還含有磷、鉀及其他中微量元素養(yǎng)分,這些養(yǎng)分在有機(jī)替代試驗(yàn)中常常未加考慮,而它們對(duì)促進(jìn)作物生長和養(yǎng)分吸收也非常重要。需要強(qiáng)調(diào)的是,不同于此前一些有機(jī)肥替代部分化學(xué)氮肥田間研究,本試驗(yàn)中減氮配施有機(jī)肥處理與常規(guī)施肥對(duì)照之間并非等氮量設(shè)計(jì),而是在逐級(jí)減少化學(xué)氮肥用量基礎(chǔ)上配施固定量的商品有機(jī)肥(表1),這種田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)更多的是考慮農(nóng)戶在農(nóng)事操作上的簡便性。試驗(yàn)區(qū)域周邊缺乏有機(jī)肥肥源,商品有機(jī)肥價(jià)格遠(yuǎn)高于化肥,盡可能少施用有機(jī)肥也有助于最大限度地降低農(nóng)戶施肥成本。

3.2 氮肥減量配施有機(jī)肥的土壤效應(yīng)

過量氮肥施用不僅影響作物生理生態(tài)特性,減少產(chǎn)量,帶來面源污染,同時(shí)也大幅降低土壤肥力。大量研究已證實(shí),集約化生產(chǎn)條件下長期過度施氮消極調(diào)節(jié)了土壤生化和微生物性質(zhì),如降低酶活性,抑制微生物活性和生物量,減少微生物群落多樣性和豐富度,這些都會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生不利影響。降低糧食生產(chǎn)系統(tǒng)化學(xué)氮肥用量,維護(hù)糧食生產(chǎn)用地土壤質(zhì)量迫在眉睫。本試驗(yàn)中減氮配施有機(jī)肥處理并未顯著改變土壤有機(jī)質(zhì)含量,這是因?yàn)橥寥揽傆袡C(jī)碳庫的改善需要一個(gè)長期積累的過程。盡管易氧化有機(jī)碳常常被認(rèn)為是土壤有機(jī)碳庫中的活性組分,但處理間并無顯著差異,這可能與試驗(yàn)區(qū)域長期秸稈還田和供試土壤本底值較高有關(guān)。減氮處理大幅降低了耕層土壤硝態(tài)氮含量(表3),意味著更少的氮肥盈余,潛在硝態(tài)氮淋洗損失也將隨之降低。土壤酶活性分析表明(表4),減少化學(xué)氮肥用量或其與有機(jī)肥配施能夠顯著改變土壤碳、氮、磷、硫循環(huán)相關(guān)酶的活性,但這些變化就處理來看并無一致規(guī)律,顯示土壤酶活性并不適宜作為在本研究區(qū)域內(nèi)評(píng)價(jià)減氮施肥土壤效應(yīng)的先鋒指標(biāo)。相較于土壤理化性質(zhì)和酶活性,土壤微生物群落對(duì)減氮配施有機(jī)肥處理快速響應(yīng)(表5和圖1)。減氮配施有機(jī)肥顯著增加了細(xì)菌群落α 多樣性,這與早前

研究一致。但CK 和OF 處理間細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)無顯著差別,說明減氮施肥的影響占據(jù)主導(dǎo)。不施用有機(jī)肥情況下,土壤細(xì)菌群落辛普森和均勻度指數(shù)隨減氮量的增加呈先增后降的趨勢(shì)(表5),且峰值均出現(xiàn)在60%CNF 處理,表明細(xì)菌群落α 多樣性受施氮量強(qiáng)烈驅(qū)動(dòng),優(yōu)化氮肥用量可以改善細(xì)菌群落α 多樣性,相似的研究結(jié)果也被Xu 等報(bào)道。然而,需要指出的 是,40%CNF+OF 處理細(xì)菌群落辛普森和均勻度指數(shù)較40%CNF 處理均有顯著增加,說明供氮不足對(duì)細(xì)菌群落α 多樣性的消極影響能夠通過施用有機(jī)肥進(jìn)行彌補(bǔ)。

細(xì)菌群落β 多樣性同樣受施肥顯著影響(圖1)。不同分組土壤樣品PCoA 分析和ANOSIM 檢驗(yàn)證明細(xì)菌群落β 多樣性的改變更多是由氮肥減量而非有機(jī)肥施用所導(dǎo)致。Zhang 等進(jìn)行為期3年的有機(jī)替代田間試驗(yàn)結(jié)果顯示,無論小麥-玉米輪作還是雙季稻生產(chǎn),氮肥施用比有機(jī)肥都更強(qiáng)烈地改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),這也支持了本研究的發(fā)現(xiàn)。然而,許多長期田間定位試驗(yàn)結(jié)果均顯示有機(jī)肥施用深刻改變了土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成。這些研究結(jié)果差異表明有機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落的影響是一個(gè)長期性的過程。有機(jī)肥的施用可能更多通過改善土壤有機(jī)碳庫來調(diào)節(jié)微生物相關(guān)性狀。就具體的群落成員而言,在門水平上,減氮配施有機(jī)肥處理較常規(guī)施肥相比均顯著降低了放線菌門平均相對(duì)豐度(表6)。早前研究表明,許多來自放線菌門的細(xì)菌都屬于富營養(yǎng)生理型,偏好高氮環(huán)境,減施氮肥可能會(huì)抑制放線菌門相關(guān)成員生長。而在屬水平上,減氮配施有機(jī)肥處理同樣顯著改變了一些優(yōu)勢(shì)屬的豐度(圖2),特別是unclassified Gp6 和平均相對(duì)豐度在60%CNF+OF 處理下出現(xiàn)顯著增加。Acidobacteria Gp6 和均屬于土壤有益菌,已被報(bào)道與作物土傳病害抑制積極相關(guān),同時(shí)也被發(fā)現(xiàn)在植物促生、固氮和多環(huán)芳烴類污染物降解方面發(fā)揮積極作用。這些結(jié)果顯示減氮配施有機(jī)肥能夠增加土壤中一些特定的有益細(xì)菌的豐度。

土壤環(huán)境變化是土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成改變的重要驅(qū)動(dòng)力。不同群落成員偏好不同的生態(tài)位,會(huì)對(duì)土壤理化因子變化快速響應(yīng)。施肥常常通過影響土壤理化環(huán)境來改變微生物生物量、活性和數(shù)量,塑造特異的微生物群落結(jié)構(gòu)。本研究表明,在所有測試的土壤理化因子中,速效鉀和硝態(tài)氮含量是驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子(圖3),這也與早前報(bào)道一致。施肥制度強(qiáng)烈影響著土壤微生物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),減氮施肥導(dǎo)致土壤細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)明顯改變(表7),說明施氮量是調(diào)控土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的重要因子,這與Liu 等的報(bào)道一致。與100%CNF 相比,60%CNF 和40%CNF 處理細(xì)菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)具有更高的復(fù)雜性和連通性。Yao 等指出,高氮負(fù)載(氮富集)常常導(dǎo)致微生物多樣性降低和群落結(jié)構(gòu)改變,這是微生物互作網(wǎng)絡(luò)弱化的重要原因。本研究確實(shí)發(fā)現(xiàn)減氮條件下細(xì)菌群落α 多樣性要高于農(nóng)戶常規(guī)施肥對(duì)照,特別是60%CNF 處理(表5)。此外,在長期過量施氮地塊,減施氮肥緩解了微生物氮抑制,調(diào)節(jié)碳氮比,增加土壤碳的有效性,使得生態(tài)位的數(shù)量和寬度增加,這也有利于更多的微生物群落成員之間發(fā)生互作關(guān)系。高連通性的互作網(wǎng)絡(luò)意味著群落成員間存在更多的功能聯(lián)系(互補(bǔ)),資源利用效率和能量轉(zhuǎn)換也更為高效。同時(shí),高復(fù)雜性和連通性網(wǎng)絡(luò)具有更多功能冗余,能夠帶來更高的群落穩(wěn)定性,即對(duì)外界生物或非生物脅迫的抗性更強(qiáng)。

4 結(jié)論

豫中地區(qū)冬小麥-夏玉米輪作系統(tǒng)存在嚴(yán)重的氮肥過量投入問題,糧食生產(chǎn)減氮潛力較大。施用有機(jī)肥是區(qū)內(nèi)糧食生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)氮肥減量最大化的重要手段。減氮配施有機(jī)肥能夠改善土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu),化學(xué)氮肥減量施用對(duì)微生物群落的影響更大。減少化學(xué)氮肥過度投入能夠增加土壤細(xì)菌群落成員間的互作強(qiáng)度,形成更具復(fù)雜性和連通性的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)。需要指出的是,減氮效果常常受土壤肥力、作物品種、有機(jī)肥種類等因素影響,因此在更大范圍內(nèi)探索豫中地區(qū)麥-玉輪作系統(tǒng)的減氮潛力及其土壤效應(yīng)十分必要,這將能夠?yàn)樾纬蓞^(qū)域化的減氮施肥推薦和作物營養(yǎng)管理方案優(yōu)化提供依據(jù)。