黎智康 劉晨雪璇 譚楚敏 熊盛，2 謝秋玲

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632；2.基因工程藥物國家工程研究中心，廣州 510632）

外泌體（exosomes）是一種直徑在30-100 nm左右，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性囊泡，包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等內(nèi)容物。外泌體能被幾乎所有的細胞分泌，并存在于血液、尿液、乳汁和羊膜液等體液中［1］，在細胞通訊和疾病的診斷方面發(fā)揮著重要作用。此外，由于外泌體的生物相容性好，能夠穿透血腦屏障以及在機體循環(huán)中具有較長的半衰期［2］，因此近年來，外泌體作為藥物載體成為了外泌體領(lǐng)域的一個研究熱點。

外泌體可以裝載包括核酸、小分子和蛋白類藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)［3-4］，其中，對于外泌體裝載蛋白質(zhì)的方法有直接和間接兩種。直接裝載通過物理、化學(xué)方法將外源蛋白質(zhì)載入外泌體中，該方法操作簡單，但存在裝載率低、影響蛋白質(zhì)活性等缺點［5］。間接裝載將目的蛋白基因轉(zhuǎn)染供體細胞，使其在細胞內(nèi)進行重組表達，蛋白在外泌體分泌過程中被包裹進去［6］。關(guān)于胞內(nèi)蛋白分選進入外泌體的機制主要有兩種，即內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體（ESCRT）依賴機制和ESCRT非依賴機制［7］。ESCRT依賴機制涉及TSG101和ALIX等蛋白的分選［8］，ESCRT非依賴機制則與四跨膜蛋白（如CD81等）的分選相關(guān)［9］，但兩種分選機制的確切情況尚未被闡明，因而間接裝載的方法難以控制蛋白質(zhì)的裝載過程和裝載量［10］。所以目前在使用間接方法時，往往把目的蛋白與外泌體膜蛋白融合表達，如CD63、CD9等［11-12］，利用這些膜蛋白將目的蛋白定向帶入外泌體中。

乳脂肪球表皮生長因子Ⅷ（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）是最初在乳房上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的親脂性糖蛋白［13］，是乳脂球膜（milk fat globule membrane，MFGM）中最主要的蛋白質(zhì)之一。研究發(fā)現(xiàn)，人源的MFG-E8有3個結(jié)構(gòu)域，即EGF-L、C1和 C2結(jié)構(gòu)域［14］。MFG-E8能促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬作用，并在血管生成、自身免疫疾病和腫瘤中扮演著重要的角色［15］。此外，外泌體上含有MFG-E8［16］，且MFG-E8還能夠黏附在細胞膜上，具有運載目的蛋白的潛力，因此考慮將其作為載體蛋白。

本研究通過構(gòu)建人源MFG-E8不同結(jié)構(gòu)域組合的截短體質(zhì)粒，并融合表達綠色熒光蛋白，在HEK293F細胞中表達，收集其分泌的外泌體，觀察各組分將EGFP帶入外泌體的情況。用外泌體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進一步探討MFG-E8各結(jié)構(gòu)域的功能，為深入了解MFG-E8作為外泌體載體蛋白提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293F細胞由南開大學(xué)惠贈、HEK293T細胞為本實驗室保存；轉(zhuǎn)染試劑PEI購自Polysciences公司；Anti-EGFP Mouse mAb和 Anti-CD9 Rabbit mAb購自Abcam公司、Anti-mouse GAPDH購自Cell signaling technology公司；熒光染料DAPI和DIL購自Beyotime公司；質(zhì)粒大抽試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建MFG-E8及其截短體的重組質(zhì)粒 以質(zhì)粒pCMV為載體，構(gòu)建人源MFG-E8全長及其不同截短體（圖1-A），分別為C1C2、EFG-L-C1（EC1）、EFG-L-C2（EC2）、C1、C2 和 EFG-L，MFG-E8 和系列截短體的5′端保留信號肽，在3′端加入Linker連接有熒光蛋白EGFP，以便后續(xù)對MFG-E8各結(jié)構(gòu)域在細胞中的定位進行觀察。PCR擴增各截短體的基因序列，酶切，對上述MFG-E8及其截短體目的基因進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的表達與外泌體的提取鑒定 以1∶2的 DNA∶PEI比例和 1 μg/106的質(zhì)粒濃度對HEK293F細胞進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，對細胞進行傳代，細胞數(shù)量保持每皿1×106個細胞，且細胞活率在90%以上。

采用超速離心法提取外泌體，細胞培養(yǎng)液先4℃，300×g離心10 min，棄沉淀。然后分別在2 000×g、10 000×g下各離心30 min，棄去亞細胞沉淀。最后以100 000×g離心70 min獲得外泌體沉淀，用適當PBS重懸后過0.22 μm濾膜，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

取少量外泌體，用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。同時，對提取所得的外泌體進行NTA粒徑分析。

1.2.3 納米顆粒跟蹤分析（NTA） 取少量外泌體，用 PBS將其稀釋到（1×108）-（1×109）particles/mL，用NS300儀器對外泌體進行粒徑分析。

1.2.4 Western blot檢測 轉(zhuǎn)染HEK293F細胞4 d后，離心收集細胞培養(yǎng)液的上清和沉淀。以上清液、細胞沉淀和提取的外泌體為樣品，分別加入上樣緩沖溶液，在12% SDS-PAGE膠中電泳，隨后300 mA轉(zhuǎn)膜1 h，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗anti-EGFP（1∶5 000）4℃ 孵育過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗孵育1 h，同樣洗膜3次后在膜上滴加發(fā)光顯影液，用凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白表達與存在情況。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察截短體的細胞定位 將 pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGF-L-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四種重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)HEK293F細胞后48 h，離心收集以上4種細胞和未轉(zhuǎn)染載體的HEK293F細胞（作為空白對照），用4%多聚甲醛固定15 min，使用PBS清洗后加入0.25% TritonX-100通透液孵育15 min，再次用PBS清洗后用不同染料（DAPI：核染料、DIL：膜染料）分別孵育5 min。最后經(jīng)PBS清洗、重懸細胞，放入共聚焦皿，滴加少量抗熒光淬滅劑，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 電鏡觀察外泌體中的目的蛋白 為了能更直觀地觀察外泌體上目的蛋白的存在位置，將分別含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3種外泌體與偶聯(lián)EGFP抗體的膠體金顆粒4℃ 孵育過夜，之后將樣品滴在銅網(wǎng)上，風(fēng)干置于電鏡下觀察。

1.2.7 外泌體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞 將含有EGFP的外泌體等量加入HEK293T細胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過3 h孵育后，用胰酶消化，離心細胞，PBS清洗，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的位置情況。

2 結(jié)果

2.1 MFG-E8及其截短體表達載體的構(gòu)建

設(shè)計不同缺失的截短體（圖1-A），構(gòu)建包括全長MFG-E8在內(nèi)的7種重組質(zhì)粒，統(tǒng)一在5′端保留信號肽，在3′端加入Linker連接有熒光蛋白EGFP。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示與各目的基因預(yù)期大小相一致（圖1-B），測序結(jié)果也完全正確。MFG-E8及其截短體重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 MFG-E8-EGFP及截短體結(jié)構(gòu)及酶切鑒定凝膠電泳圖Fig.1 Structure of MFG-E8-EGFP and its truncated forms as well as gel electrophoresis plots for identification by enzyme digestion

2.2 MFG-E8及其截短體在HEK293細胞上的表達

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293F細胞，2 d后用流式細胞分析儀檢測蛋白表達情況。流式結(jié)果顯示，截短體C1C2和C2的瞬轉(zhuǎn)效率較低，分別為44.43%和32.66%，其他重組質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)效率均超過50%，其中EGF-L的瞬轉(zhuǎn)效率最高，為76%（圖2-A）。說明EGF-L的表達最高，而C1C2和C2的表達量較低。

圖2-B顯示了WB檢測目的蛋白在胞內(nèi)的表達情況，根據(jù)分子量大小，各截短體在細胞內(nèi)均有表達，其中EGF-L表達量最高，C2最低。從圖2-C可以看出，在上清液中只檢測到EGF-L、C1和EC1的表達，其中EGF-L表達量遠大于C1、EC1，說明只有這3種蛋白可以分泌到胞外，其他蛋白雖然帶有信號肽卻沒有分泌到培養(yǎng)上清中。

圖2 重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率和表達情況的檢測Fig.2 Detection of the transient efficiency and expression of the recombinant plasmids

2.3 MFG-E8蛋白各組分在細胞上的定位

為了進一步檢測表達的幾種重組蛋白所在的細胞定位，對轉(zhuǎn)染pCMV-MFG-E8-EGFP、pCMV-EGFL-EGFP、pCMV-EC1-EGFP、pCMV-C1C2-EGFP四種重組質(zhì)粒的HEK293F細胞進行激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果（圖3）表明，轉(zhuǎn)染MFG-E8-EGFP和C1C2-EGFP重組質(zhì)粒的細胞在膜上都有較強的綠色熒光信號，顯示目的蛋白存在于細胞膜上。轉(zhuǎn)染EC1-EGFP的細胞僅有微弱的綠色熒光，熒光呈現(xiàn)點狀圍繞細胞膜。轉(zhuǎn)染EGF-L-EGFP的細胞其綠色熒光分散地分布在細胞中，與其他組綠色熒光位置相比較，該組熒光沒有成環(huán)狀，提示EGF-L-EGFP不在細胞膜上，而是存在于細胞質(zhì)當中。這與此前WB結(jié)果相一致，EGF-L既表達分布在胞內(nèi)，也可以分泌到培養(yǎng)上清中，但帶有C1C2或C2的蛋白雖然也有信號肽，卻黏附于膜上，不能分泌到培養(yǎng)上清中。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測MFG-E8及其截短體在細胞中的定位Fig.3 Location detection of MFG-E8 and its truncated proteins in HEK293 cells by laser confocal microscopy

2.4 外泌體的提取鑒定

利用超速離心法得到轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的HEK293F細胞分泌的外泌體。電鏡觀察結(jié)果如圖4-A，可以見到杯狀或球狀的半透明囊泡樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有與細胞膜相同的雙層膜結(jié)構(gòu)。NTA粒徑分析結(jié)果表明所提取的顆粒大小在80-150 nm之間，屬于外泌體的粒徑范圍內(nèi)（圖4-B）。據(jù)此，可以推斷超速離心所得沉淀大部分為外泌體。

圖4 外泌體的電鏡結(jié)構(gòu)和粒徑分析Fig.4 Transmission electron micrograph and size distributions of exosomes

2.5 MFG-E8及其各組分在外泌體中的定位

對轉(zhuǎn)染了7種重組質(zhì)粒的細胞進行外泌體提取，以CD9為外泌體的標志物，使用EGFP抗體，WB檢測MFG-E8和各截短體在外泌體中的存在情況。如圖5-A所示，在外泌體中僅有MFG-E8-EGFP、C1C2-EGFP和EC1-EGFP被檢測到，而且MFG-E8-EGFP的表達量高于后兩者，其他截短體則沒有在外泌體中發(fā)現(xiàn)。此結(jié)果表明，MFG-E8、C1C2、EC1能將EGFP攜帶到外泌體中，但攜帶效率不盡相同，而其他幾種蛋白難以有效攜帶目的蛋白進入外泌體中。

將外泌體與偶聯(lián)了EGFP抗體的金顆粒孵育，利用電鏡進一步觀察上述3種外泌體上EGFP的存在情況（圖5-B），發(fā)現(xiàn)3種外泌體上均可以觀測到目的蛋白的存在。由于偶聯(lián)了EGFP抗體的金顆粒無法進入外泌體內(nèi)部，表明熒光蛋白EGFP位于外泌體的外層膜上。3種外泌體中，MFG-E8-EGFP結(jié)合的金顆粒較EC1-EGFP和C1C2-EGFP多，說明全長MFG-E8所攜帶的目的蛋白最多，該結(jié)果與之前WB結(jié)果相符合。

圖5 EGFP在外泌體中存在情況的鑒定Fig.5 Identification of EGFP in exosomes

2.6 外泌體轉(zhuǎn)染293T細胞

將含有MFG-E8-EGFP、EC1-EGFP和C1C2-EGFP的3種外泌體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)3種外泌體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，轉(zhuǎn)染細胞均有觀測到綠色熒光信號（圖6），說明3種外泌體都可以將目的蛋白帶入受體細胞，外泌體可以很好地起到載藥功能。其中裝載MFG-E8-EGFP外泌體轉(zhuǎn)染后的細胞的熒光強度最高，另外兩組細胞的熒光強度較弱，與此前檢測外泌體中EGFP含量結(jié)果一致。

圖6 熒光顯微鏡觀察外泌體轉(zhuǎn)染效果Fig.6 Fluorescence images showing the effect of exosomes transfection

3 討論

MFG-E8作為乳脂球膜上一種重要的親脂性糖蛋白，能夠通過增強凋亡細胞的吞噬調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫，缺乏MFG-E8的小鼠會引起自身免疫疾病的出現(xiàn)［17-19］。人源MFG-E8由3個結(jié)構(gòu)域組成，其中的EGF-L結(jié)構(gòu)域含有的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列能夠與整合素 αvβ3/αvβ5靶向結(jié)合介導(dǎo)細胞間的黏附［20-22］，因此，MFG-E8具有一定的靶向潛能。MFG-E8羧基端的盤狀結(jié)構(gòu)域C1C2則能通過磷脂酰絲氨酸（PS）與細胞建立聯(lián)系。另外，MFG-E8被發(fā)現(xiàn)存在于細胞外囊泡中，已有研究報導(dǎo)，通過MFG-E8的C1C2結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合表達，從而實現(xiàn)外泌體對外源蛋白的裝載［23］。

雖然C1C2已被用來作為導(dǎo)向外泌體的載體蛋白，但MFG-E8各結(jié)構(gòu)域?qū)ν饷隗w包載其融合表達目的蛋白效率是否有影響還有待研究，因此本研究構(gòu)建了連接有信號肽的MFG-E8全長和不同截短體與EGFP融合表達的重組質(zhì)粒，在真核細胞里表達，檢測目的蛋白在細胞及其分泌的外泌體上的表達情況和所在位置。

研究發(fā)現(xiàn)，MFG-E8及其各組分均存在細胞中，其中EGF-L的表達量最高，C2的表達量最低，而上清中僅檢測到EGF-L、C1和EC1的存在。這說明具有C1C2，尤其是C2的存在，對蛋白在膜上的黏附作用具有重要影響。同時，激光共聚焦顯微鏡觀察到MFG-E8、C1C2和EC1定位在細胞膜上，而EGF-L的熒光分散在細胞質(zhì)內(nèi)。這與之前有關(guān)C1、C2結(jié)構(gòu)域的功能的研究相一致，有文獻報道C2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能與膜連接［24］，而且單獨的C2結(jié)構(gòu)域與全長的MFG-E8對于磷脂酰絲氨酸有相近的親和力［25］，而C1結(jié)構(gòu)域能夠加強C2結(jié)構(gòu)域與磷脂酰絲氨酸的連接作用［26-27］。

而外泌體中只有MFG-E8、C1C2和EC1三種蛋白被檢測到，其表達量為MFG-E8＞EC1＞C1C2，這說明MFG-E8各結(jié)構(gòu)域作為載體將目的蛋白帶入外泌體必須有C1或者C2的存在，因為C1、C2結(jié)構(gòu)域是與膜連接的部分，這與文獻中的報導(dǎo)相符［28］，而EGF-L結(jié)構(gòu)域的存在可以促進融合蛋白表達量的增加，C1C2或C2連接的蛋白融合表達量都很低，從而也會影響到其攜帶入外泌體的量。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)MFG-E8、C1C2和EC1所攜帶的蛋白是位于外泌體膜外的，因而可以利用其作為載體蛋白，攜帶需與細胞膜上受體結(jié)合的蛋白質(zhì)，或者攜帶抗原蛋白，打造有潛力的蛋白疫苗。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建MFG-E8及其不同的截短體，對MFG-E8各結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍纵d入外泌體的作用進行探究。MFG-E8在細胞中表達后能黏附在細胞膜上，C1C2結(jié)構(gòu)域在此過程中發(fā)揮錨定細胞膜作用，可將目的蛋白帶到外泌體上，而EGF-L結(jié)構(gòu)域可提高蛋白表達，進而影響外泌體中目的蛋白的含量。