牛馨 張瑩 王茂軍 劉文龍 路福平 李玉

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山東隆科特酶制劑有限公司，沂水 276400）

蛋白酶被廣泛的應(yīng)用于食品［1］、洗滌［2］、醫(yī)藥［3］以及皮革［4］等行業(yè)，其中堿性蛋白酶所占比例達(dá)到40%［5］，并且市場(chǎng)對(duì)堿性蛋白酶的需求量還在逐年增加，但目前產(chǎn)量依然無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)上的需求［6］。在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶的過(guò)程中，存在生產(chǎn)菌株性能不穩(wěn)定、酶的表達(dá)量無(wú)法控制等現(xiàn)象，因此尋求高效穩(wěn)定的表達(dá)策略，對(duì)堿性蛋白酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義。

為了解決生產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題，可將外源基因整合到表達(dá)菌株基因組上以達(dá)到穩(wěn)定遺傳的目的，而整合基因的表達(dá)水平往往取決于它們?cè)诨蚪M上的整合位置［7］。Bryant等［8］通過(guò)將 Plac-gfp表達(dá)盒整合至大腸桿菌K-12基因組的不同位點(diǎn)，表明整合位點(diǎn)在染色體上的位置會(huì)影響基因的表達(dá)水平。DNA復(fù)制起始于基因組上的固定位置（復(fù)制起點(diǎn)Ori）［9］，基因劑量隨著與Ori的接近程度增加而增加［10］，因此選擇在Ori附近整合外源蛋白基因是提高外源蛋白表達(dá)量的有效手段。Zhou等［11］在Ori附近整合了aprE基因，提高了堿性蛋白酶的酶活。

另外，在細(xì)菌中大部分的胞外酶都通過(guò)Sec途徑分泌至胞外［12］，異源蛋白通過(guò)相同的分泌機(jī)制輸出到胞外可能會(huì)引起細(xì)胞膜的堵塞［13］，因此在細(xì)菌基因組胞外酶位點(diǎn)整合外源蛋白基因可以減少菌體自身分泌的胞外酶對(duì)資源的利用，有利于外源蛋白的表達(dá)。Ren等［14］在枯草芽胞桿菌基因組胞外蛋白酶位點(diǎn)（epr和bpr）以及淀粉酶位點(diǎn)amyE整合了外源基因Bgal1-3使整合菌株的胞外酶活比原始菌株提高了87%，并且整合菌株在150代以后依然能夠穩(wěn)定遺傳。Watzlawick等［15］將ganA基因整合到枯草芽胞桿菌基因組amyE和nprB等5個(gè)位點(diǎn)，使β-半乳糖苷酶活性達(dá)到8.36 U/mg，這些研究表明在胞外蛋白酶位點(diǎn)以及胞外淀粉酶位點(diǎn)整合外源蛋白是有效提高外源蛋白表達(dá)量的一種方法。

本研究以實(shí)驗(yàn)室已有的生產(chǎn)菌株解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens TCCC 111018為研究對(duì)象，結(jié)合其基因組測(cè)序結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，選擇在OriC附近、胞外蛋白酶以及胞外淀粉酶位點(diǎn)進(jìn)行外源堿性蛋白酶基因（aprE）的整合，以此探究基因組上不同位點(diǎn)對(duì)外源堿性蛋白酶表達(dá)的影響，為利用基因組整合方式構(gòu)建表達(dá)不同外源蛋白的生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 研究使用的菌株和質(zhì)量見(jiàn)表1。

表1 研究中使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.1.2 酶與試劑 DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；無(wú)縫克隆和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 切膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；福林酚、酪蛋白底物、三氯乙酸等購(gòu)自上海生工公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：1% 蛋白胨，1% NaCl，0.5% 酵母提取物；發(fā)酵培養(yǎng)基：6.4%玉米粉，4% 豆粕粉，0.4% 磷酸氫二鈉，0.03% 磷酸二氫鉀，0.07% 高溫淀粉酶。

1.2 方法

1.2.1 胞外蛋白酶缺失菌株以及整合菌株的構(gòu)建 通過(guò)基因組序列分析和比對(duì)，確定了TCCC 111018基因組上至少有6個(gè)胞外蛋白酶：Mpr、Vpr、NprE、Epr、Apr和Bpr，采用同源重組的方法使6個(gè)胞外蛋白酶基因缺失，缺失過(guò)程以vpr基因?yàn)槔?。使用?所示的引物擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段，采用無(wú)縫克隆方式構(gòu)建敲除質(zhì)粒pWH-T2-vpr，將pWH-T2-vpr化轉(zhuǎn)至 EC135 pM.Bam［16］；再將經(jīng)過(guò)甲基化修飾的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至解淀粉芽胞桿菌，篩選正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行單、雙交換，共構(gòu)建了6株蛋白酶缺失菌株，并將pLY-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至缺失菌株中。

表2 vpr基因缺失的引物設(shè)計(jì)Table 2 Primers for vpr gene deletion

基因整合的方法與敲除方法一樣，在nprE、yaah以及amyE位點(diǎn)整合了aprE基因，與敲除方法不同的是在左右同源臂之間加入了一段整合基因片段，構(gòu)建示意圖如圖1所示。

圖1 基因整合構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of gene integration construction

1.2.2 胞外蛋白酶缺失菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 將不同菌株在LB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵32 h，每隔2 h取樣并使用酶標(biāo)儀在600 nm的波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 堿性蛋白酶表達(dá)量以及酶活的測(cè)定 將6株帶有pLY-2質(zhì)粒的蛋白酶缺失菌株以及3株整合菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵48 h，取發(fā)酵48 h后的上清液采用福林法（GB/T23527-2009）測(cè)定其酶活，并對(duì)TCCC 111018發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 整合菌株轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定 提取3株整合菌株的RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，使用引物如表3所示。

表3 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物Table 3 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，并且每次設(shè)置3個(gè)平行，采用Origin8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 yaah整合位點(diǎn)的選擇

基因的表達(dá)受基因與復(fù)制起始點(diǎn)OriC距離的影響，越靠近復(fù)制起始點(diǎn)基因的表達(dá)水平越高，因此通過(guò)Ori-Finder（http://tubic.tju.edu.cn/doric/）預(yù)測(cè)了TCCC 111018基因組的復(fù)制起始位點(diǎn)OriC，結(jié)果表明TCCC 111018的OriC總長(zhǎng)度為1 021 bp，起始于基因組上的1 904 168 bp，終止于1 905 188 bp。比較距離OriC位點(diǎn)較近的幾個(gè)基因中，Yaah是芽胞萌發(fā)的相關(guān)蛋白［17］，芽胞可以幫助細(xì)菌度過(guò)惡劣的環(huán)境，而解淀粉芽胞桿菌不產(chǎn)生芽胞，所以該基因的缺失不會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，因此可以在該位點(diǎn)整合aprE基因。

2.2 nprE整合位點(diǎn)的選擇

2.2.1 胞外蛋白酶缺失菌株的構(gòu)建 為確定更多的整合位點(diǎn)，首先探究了原始菌株B.amyloliquefaciens TCCC 111018基因組上胞外蛋白酶對(duì)外源堿性蛋白酶aprE基因表達(dá)的影響。利用同源重組技術(shù)分別缺失了6個(gè)胞外蛋白酶基因（epr、vpr、mpr、apr、bpr和nprE），并將6株缺失菌株分別命名為：18-ΔE、18-ΔV、18-ΔM、18-ΔA、18-ΔB 和 18-ΔN，各敲除位點(diǎn)在基因組上的位置示意圖如圖2所示。

圖2 敲除位點(diǎn)在TCCC 111018基因組的位置圖Fig.2 Diagram showing the location of the knockout sites in the TCCC 111018 genome

2.2.2 胞外蛋白酶缺失菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定 為了探究胞外蛋白酶的缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)是否有影響，對(duì)6株缺失菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。18-ΔV在14 h之前生長(zhǎng)狀況與原始菌株18基本一致，但14 h之后生長(zhǎng)情況卻不如原始菌株，說(shuō)明vpr基因的缺失可能會(huì)導(dǎo)致菌體的自溶速度加快［18］；其它5株缺失菌株與原始菌株的生長(zhǎng)狀況沒(méi)有明顯的差別，說(shuō)明mpr、nprE、epr、apr和bpr基因的缺失對(duì)菌體的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

圖3 胞外蛋白酶缺失菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Fig.3 Growth curve of extracellular protease-deficient strain

2.2.3 胞外蛋白酶缺失菌株對(duì)外源堿性蛋白酶的影響 為了探究胞外蛋白酶的缺失對(duì)外源堿性蛋白酶表達(dá)的情況，將質(zhì)粒pLY-2轉(zhuǎn)化至原始菌株B.amyloliquefaciens TCCC 111018及6株蛋白酶缺失菌株，分別將其命名為：CK、ΔE、ΔV、ΔM、ΔA、ΔB和ΔN，經(jīng)發(fā)酵后測(cè)定了堿性蛋白酶的酶活，如圖4所示。原始菌株CK的酶活為11 937.08 U/mL，缺失菌株ΔN的酶活為13 231.93 U/mL，比原始菌株提高了7.5%；ΔV酶活最低，比原始菌株降低了約15%；而mpr、epr、apr和bpr基因缺失菌株酶活與原始菌株無(wú)明顯差異，表明nprE基因的缺失對(duì)外源堿性蛋白酶的表達(dá)有促進(jìn)作用，因此選擇在該位點(diǎn)整合aprE基因。

圖4 胞外蛋白酶缺失菌株酶活力Fig.4 Enzyme activity of extracellular protease-deficient strains

2.3 amyE整合位點(diǎn)的選擇

對(duì)原始菌株B.amyloliquefaciens TCCC 111018的發(fā)酵上清液進(jìn)行了SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，在分子量為45.0-66.2 kD之間的蛋白條帶更明顯，表明該蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高。

圖5 TCCC 111018發(fā)酵液上清SDS-PAGE檢測(cè)Fig.5 SDS-PAGE detection of TCCC 111018 fermentation broth supernatant

隨后將圖5中表達(dá)量最高的條帶回收并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜分析結(jié)果如表4所示，表明該蛋白為α-淀粉酶，說(shuō)明在原始菌株TCCC 111018的發(fā)酵液上清中α-淀粉酶的表達(dá)量最高。

表4 質(zhì)譜結(jié)果分析Table 4 Analysis of mass spectrometry results

由于α-淀粉酶與堿性蛋白酶均為胞外酶，分泌途徑可能相同，因此針對(duì)二者的氨基酸序列利用 SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明二者的信號(hào)肽均為Sec途徑，由此可以推斷兩個(gè)胞外酶可能均由Sec途徑分泌至胞外，Sec轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括信號(hào)肽識(shí)別顆粒、分子伴侶、信號(hào)肽酶及通道蛋白SecYEG等蛋白分子［19］，而α-淀粉酶的高表達(dá)量可能會(huì)占據(jù)這些資源，推測(cè)在該位點(diǎn)整合aprE基因有利于堿性蛋白酶的表達(dá)。

2.4 構(gòu)建表達(dá)外源堿性蛋白酶的整合菌株

為了獲得穩(wěn)定的表達(dá)外源堿性蛋白酶菌株，根據(jù)以上研究結(jié)果，選擇了在yaah、nprE以及amyE基因位點(diǎn)進(jìn)行基因aprE的整合，構(gòu)建的3株整合菌 株 分 別 命 名 為 18-ΔY∷aprE、18-ΔN∷aprE 和18-Δα∷aprE。

2.4.1 整合菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及酶活的測(cè)定 為探究不同整合位點(diǎn)的aprE對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響以及堿性蛋白酶的酶活水平，對(duì)3株整合菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及酶活的測(cè)定，結(jié)果如圖6、圖7所示。18-ΔN∷aprE在12 h前比原始菌株生長(zhǎng)速率快，但在16 h后生長(zhǎng)卻明顯慢于原始菌株，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是18-ΔN∷aprE的酶活顯著提高（圖7）。由于堿性蛋白酶可以水解培養(yǎng)基中的蛋白物質(zhì)為菌體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，該酶的高水平表達(dá)利于菌體的快速生長(zhǎng)，而外源堿性蛋白酶的高表達(dá)會(huì)給菌株造成生長(zhǎng)的負(fù)擔(dān)，因此在生長(zhǎng)后期菌體生長(zhǎng)狀況不如原始菌株。18-ΔY∷aprE在6-10 h 生長(zhǎng)速率比原始菌株快，但在10 h后與原始菌株生長(zhǎng)速率基本一致，原因可能是18-ΔY∷aprE比原始菌株的酶活提高了約15%利于菌體的前期生長(zhǎng)。18-Δα∷aprE與原始菌株的生長(zhǎng)狀況基本沒(méi)有差別，圖7也表明18-Δα∷aprE酶活水平?jīng)]有原始菌株高，因此對(duì)菌株生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

圖6 整合菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Fig.6 Growth curve of integrated strains

綜合上述分析，結(jié)合圖7的結(jié)果，18-ΔN∷aprE比原始菌株的酶活提高了近89%，說(shuō)明在nprE位點(diǎn)整合aprE基因可以顯著提高堿性蛋白酶的酶活力；而18-Δα∷aprE酶活水平卻明顯低于了原始菌株，原因可能是將外源基因整合到該位點(diǎn)的同時(shí)也破壞了該基因，說(shuō)明α-淀粉酶基因的缺失不利于外源堿性蛋白酶的表達(dá)，可能是由于α-淀粉酶基因缺失后菌體對(duì)培養(yǎng)基中碳源的利用有影響。

圖7 整合菌株的酶活力分析Fig.7 Analysis of enzyme activity of integrated strains

2.4.2 整合菌株轉(zhuǎn)錄水平及堿性蛋白酶表達(dá)情況的分析 為探究不同整合位點(diǎn)的aprE的轉(zhuǎn)錄水平以及堿性蛋白酶的表達(dá)情況，對(duì)3株整合菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定以及SDS-PAGE凝膠電泳的檢測(cè)，結(jié)果如圖8和圖9所示。由圖8可知，18-ΔN∷aprE的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高；圖9也顯示出18-ΔN∷aprE的堿性蛋白酶表達(dá)量最高，因此在nprE位點(diǎn)整合amyE能夠有效提高堿性蛋白酶的表達(dá)量可能是提高了堿性蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平，推測(cè)nprE位點(diǎn)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平較強(qiáng)；圖8顯示出18-Δα∷aprE和18-ΔY∷aprE在轉(zhuǎn)錄水平上兩株菌相差不大，且顯著低于18-ΔN∷aprE。由圖9可知這兩株菌的堿性蛋白酶表達(dá)量均與對(duì)照18無(wú)明顯差別，且均沒(méi)有18-ΔN∷aprE的堿性蛋白酶表達(dá)量高，表明yaah和amyE位點(diǎn)可能沒(méi)有nprE位點(diǎn)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平高。

圖8 整合菌株aprE的轉(zhuǎn)錄水平Fig.8 Transcription level of aprE in the integrated strains

圖9 整合菌株AmyE的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.9 SDS-PAGE detection of AmyE in the integrated strains

3 討論

本研究采用基因組整合的策略使堿性蛋白酶表達(dá)量比原始菌株提高了89%，Zhang等［20］也通過(guò)將Mglu基因整合到枯草芽胞桿菌基因組上使谷氨酰胺酶在5 L發(fā)酵罐中最大酶活達(dá)到357.6 U/mL；Mo等［21］將堿性蛋白酶apr4基因整合到嗜堿芽胞桿菌的基因組上使堿性蛋白酶的活力提高了111.3%。這些研究表明了基因組整合是有效提高外源蛋白表達(dá)的一種方法。

本研究在確定nprE基因整合位點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶nprE基因的缺失較其他蛋白酶基因能夠提高外源堿性蛋白酶的酶活力。Wang等［22］也通過(guò)缺失解淀粉芽胞桿菌基因組上的中性蛋白酶Banpr基因顯著提升了異源蛋白的產(chǎn)量，這與我們得到的結(jié)果一致。Kawamura等［23］通過(guò)敲除枯草芽胞桿菌基因組中的中性蛋白酶基因（nprE）和堿性蛋白酶基因（aprE），發(fā)現(xiàn)敲除菌株的胞外蛋白酶酶活比原始菌株減少了96%以上，說(shuō)明枯草芽胞桿菌分泌的胞外蛋白酶主要是堿性蛋白酶和中性蛋白酶［24-25］，因此，缺失中性蛋白酶基因可能有利于宿主菌中更多的資源用于堿性蛋白酶的表達(dá)及分泌。同時(shí)，細(xì)菌自身分泌的胞外蛋白酶能水解胞外的蛋白從而為菌體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)［26］，所以胞外蛋白酶會(huì)降解外源蛋白而影響目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量。在本研究中，可能是由于中性蛋白酶缺失菌株減少了對(duì)外源堿性蛋白酶的降解量從而提高了堿性蛋白酶的表達(dá)量。雖然其它蛋白酶都有降解作用，但由于在枯草芽胞桿菌中分泌蛋白主要是中性蛋白酶和堿性蛋白酶，而解淀粉芽胞桿菌與枯草芽胞桿菌的親緣性極高［22］，所以我們?cè)诮獾矸垩堪麠U菌中缺失中性蛋白酶基因能顯著減少堿性蛋白酶的損失而使堿性蛋白酶的表達(dá)量提高。

本研究在原始菌株發(fā)酵上清液中表達(dá)量最高的α-淀粉酶位點(diǎn)整合了外源堿性蛋白酶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整合菌株的酶活力沒(méi)有原始菌株高。研究表明，淀粉酶是一類(lèi)能夠水解淀粉分子內(nèi)的糖苷鍵從而得到葡萄糖或糊精等產(chǎn)物的一類(lèi)酶［27］。由于發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的主要成分為淀粉，當(dāng)?shù)矸勖富蛉笔Ш髮?duì)培養(yǎng)基中碳源的利用率降低［28］，可能是這些因素導(dǎo)致了在淀粉酶位點(diǎn)整合堿性蛋白酶基因后，堿性蛋白酶的表達(dá)量并沒(méi)有提升反而有所下降。

為獲得表達(dá)外源蛋白的高產(chǎn)菌株，許多研究開(kāi)始傾向于精簡(jiǎn)基因組，刪除表達(dá)菌株中的冗余基因，構(gòu)建底盤(pán)微生物。Reuβ等［29］通過(guò)刪除了B.subtilis基因組36%的基因，使細(xì)胞內(nèi)的資源利用更為合理，為構(gòu)建高效表達(dá)外源蛋白的宿主菌有著重要的意義。本研究通過(guò)刪除6個(gè)胞外蛋白酶發(fā)現(xiàn)對(duì)菌體的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響，并且發(fā)現(xiàn)刪除了中性蛋白酶基因后使外源堿性蛋白酶的表達(dá)量有所提升，為構(gòu)建高效表達(dá)外源蛋白的底盤(pán)微生物提供了一定的參考。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在Bacillus amyloliquefaciens TCCC 111018基因組上不同位點(diǎn)整合了外源堿性蛋白酶基因aprE，獲得了一株高效表達(dá)堿性蛋白酶的菌株18-ΔN∷aprE，其相對(duì)酶活提高了近89%，提升了TCCC 111018作為工業(yè)菌株的價(jià)值，并為構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的工程菌提供了一種思路方法。