王 莉， 嚴 玲， 黃小蘭， 周紅斌

(華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室， 武漢 430079)

肝癌是第五大最常見的惡性腫瘤，其死亡人數(shù)超過乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌.早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵，因此，尋找有助于早期診斷的生物源性物質(zhì)具有良好的臨床價值[1].肝癌患者唾液、血漿、血清和尿液中的2-丁酮和己醛出現(xiàn)異常，是癌癥內(nèi)源性生物標志物[2-3]，測定人血中微量的2-丁酮和己醛對肝癌的早期臨床診斷具有重要意義.

高效液相色譜(HPLC)[4-6]和氣相色譜(GC)[7-8]已被廣泛應(yīng)用于醛類和酮類的測定.然而，由于它們具有高揮發(fā)性、高活性，且缺乏發(fā)色團或熒光團，因此很難用HPLC直接分析[9].為了克服上述缺點，采用2，4-二硝基苯肼[10-12]和O-(2，3，4，5，6-五氟苯基)-羥胺鹽酸鹽[7，13]在檢測前進行了醛、酮的衍生化.而2，4-二硝基苯肼是最常用的HPLC衍生化試劑.

考慮到血液樣品基質(zhì)的復(fù)雜性和血液樣品中醛類和酮類的濃度相對較低，需要進行樣品處理和富集程序來提高方法的靈敏度，如固相萃取[9，14]，液相微萃取[15]、聚合物整體柱微萃取[16-17]和固相微萃取[18-19].固相萃取作為樣品前處理技術(shù)，是利用分析物在不同介質(zhì)中被吸附的能力差將待測物提純，有效的將待測物于干擾組分分離，具有萃取容量大、分離效果好的特點，但存在樣品和溶劑消耗量大的缺點.液相萃取技術(shù)是一種根據(jù)萃取對象在萃取溶劑和樣品溶液之間的分配平衡，將萃取對象濃縮至微升級的溶液內(nèi)，實現(xiàn)萃取對象從復(fù)雜樣品基質(zhì)中分離和富集的萃取技術(shù)， 具有溶劑消耗量小的優(yōu)點，但也有分離效果不高的缺點；固相微萃取是以固相萃取技術(shù)為基礎(chǔ)的一種微萃取方法，通過將吸附劑涂層涂覆在石英纖維等的基體材料上，對目標物進行萃取和富集，以達到分離和提純的目的，可以集采樣、富集、進樣于一體，但萃取效率不高；管內(nèi)固相微萃取是固相微萃取的一種方式，管內(nèi)固相微萃取是最初通過把吸附材料涂到石英毛細管的內(nèi)壁上，具有萃取微型化、減少溶劑耗材等優(yōu)點.本課題組以聚四氟乙烯管代替了常用的管內(nèi)固相微萃取(IT-SPME)易碎的石英毛細管，實現(xiàn)了聚四氟乙烯管與高效液相色譜的結(jié)合，因為其具有豐富的現(xiàn)成接口和連接器，用聚多巴胺將天然無毒的雙醛淀粉/殼聚糖復(fù)合涂層固定在聚四氟乙烯管內(nèi)壁上，并在人血中原位衍生化2-丁酮和己醛[20].

然而，由于聚四氟乙烯管具有較高的耐化學(xué)性，很難將吸附劑固定在其內(nèi)壁上.此外，血清樣品不能直接使用IT-SPME進行提取，因為血清中大量的蛋白質(zhì)會堵塞吸附劑的孔隙，大大降低了萃取效率.因此，在IT-SPME程序之前，應(yīng)該先用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)沉淀程序除去大量的蛋白質(zhì).雖然蛋白質(zhì)沉淀過程是快速和簡單的消除血清樣品中的蛋白質(zhì)的一種策略，但這種技術(shù)的低選擇性可能導(dǎo)致一些分析物的損失和共沉淀.因此，發(fā)展高通量、高靈敏、高選擇性的分析方法需要尋找對血清中特定目標具有選擇性的吸附劑和新型的聚四氟乙烯管萃取模式.

限進材料(restricted access materials， RAM)吸附劑通常由具有雙官能團位于內(nèi)外表面的多孔顆粒組成.親水性和生物相容性的外表面結(jié)合一個可控的孔徑作為一個物理屏障排斥大分子，而疏水性或離子交換的內(nèi)表面為小分子量化合物提供結(jié)合位點，這些化合物可以自由地擴散到和出多孔顆粒.由于其親水表面可防止蛋白質(zhì)的不可逆吸附，RAM可作為一種低污染吸附劑，直接從富含蛋白質(zhì)的基質(zhì)中提取小分子[21-23].磁性核殼介孔二氧化硅納米粒子可以作為這樣的RAM吸附劑由于介孔二氧化硅殼可以提供一種控制孔隙大小排除大分子，并可能顯示的分離性能和高效吸附由于其高表面積、均勻的孔隙大小、生物相容性和獨特的超順磁特性[24-25].然而，如何使其疏水內(nèi)表面成為肝癌生物標志物(如2-丁酮和己醛的衍生物)在人血中的結(jié)合位點，以及如何在聚四氟乙烯管中進行萃取程序?qū)⒈谎芯?

本文報道了一種新型的具有Fe3O4核和C8功能化介孔二氧化硅殼的磁性介孔吸附劑C8-Fe3O4@mSiO2及其在磁場作用下用聚四氟乙烯管從人血清中固相微萃取痕量2-丁酮和己醛的應(yīng)用.將C8-Fe3O4@mSiO2吸附劑用2，4-二硝基苯肼預(yù)載在聚四氟乙烯管中，然后提取血清中的醛和酮，在吸附劑表面產(chǎn)生衍生物.大量的血清樣本不需要經(jīng)過預(yù)處理以去除蛋白質(zhì).新型吸附劑可直接提取，且不污染.此外，不需要將吸附劑固定在聚四氟乙烯管內(nèi)表面.利用磁鐵，磁性吸附劑可以在聚四氟乙烯管中進行提取程序，這有利于小而珍貴的樣品，如血清和唾液.對影響萃取、衍生和解吸效率的幾個參數(shù)進行了優(yōu)化.在優(yōu)化的條件下，建立了MITM-MSPE-ISD法，用于健康志愿者和肝癌患者血清中微量丁酮和己醛的測定.

1實驗

1.1化學(xué)藥品和材料

2-丁酮、己醛、正硅酸四乙酯、十六烷基三甲基溴化銨、正辛基三乙氧基硅烷(分析純，阿拉丁).六醛二硝基苯酚和2-丁酮二硝基苯酚均為博納安杰拉(天津)有限公司的高效液相色譜級產(chǎn)品.牛血清白蛋白(95%)是從上海瑞格爾生物技術(shù)有限公司獲得的.2，4-二硝基苯肼、六水氯化鐵、四水氯化鐵、氯化鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸(分析純，國藥).使用前將2，4-二硝基苯肼在乙腈-水(V/V， 1/3)溶液中重結(jié)晶一次.甲醇(高效液相色譜級)和乙腈(高效液相色譜級)從美國費爾勞恩訂購.

1.2儀器

JSM-6700F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，日本JEOL公司)， JEM-100CXII透射電鏡(TEM， 日本JEOL公司) ，Thermo Nicolet Is50 FT-IR傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析儀器(美國Boston， MA公司)，飛利浦MDR X射線衍射儀， PPMS-9振動樣品磁力儀(VSM).Quantachrome IQ2系統(tǒng)孔隙度儀(美國康塔儀器公司) ，安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫科技公司).超聲波儀器KQ-100DE(江蘇超聲波儀器有限公司)， pHS-3C數(shù)字式pH儀(上海雷克斯儀器廠).

1.3樣品制備和采集

如圖1所示，首先，將六水氯化鐵和四水氯化鐵的混合物與濃氨水共沉淀法合成Fe3O4磁性納米粒子.將2.7 g六水氯化鐵和1.0 g四水氯化鐵的混合物溶解在100 mL水中.然后在強烈攪拌下，滴加50 mL濃氨水，直至形成Fe3O4.在封閉的玻璃燒瓶中，在氮氣氣氛中油浴中不斷攪拌，在80 ℃保持混合物4 h.得到的Fe3O4顆粒用去離子水反復(fù)洗滌，在50 ℃烘箱中干燥4 h.然后，將制備好的25 mg Fe3O4和50 mg 十六烷基三甲基溴化銨在25 mL去離子水中超聲分散30 min，形成均勻的分散體系，加入200 mL 0.01 g氫氧化鈉溶液再超聲分散10 min.然后，在50 ℃強烈振動30 min后，向分散體系中加入1.25 mL正硅酸四乙酯/乙醇(V/V， 1/4)溶液，再加入0.05 mL正硅酸四乙酯和0.025 mL正辛基三乙氧基硅烷，在50 ℃持續(xù)振動12 h.產(chǎn)物用磁鐵收集，用去離子水清洗和干燥.用丙酮在回流24 h下從產(chǎn)物中脫除模板十六烷基三甲基溴化銨將得到的C8功能化的棕色介孔Fe3O4@mSiO2納米顆粒用磁鐵收集，用乙醇和丙酮依次洗滌多次，然后在50 ℃烘干12 h.

2結(jié)果與討論

2.1C8-Fe3O4@mSiO2的制備與表征

圖1所示為中孔磁性C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒的合成過程，包括Fe3O4磁性納米顆粒的合成、介孔二氧化硅殼層的涂覆、C8功能化和模板去除.采用溶劑熱法制備了形貌均勻、磁化強度高的親水Fe3O4納米粒子.然后介孔二氧化硅殼層和C8功能化Fe3O4表面的負電荷二氧化硅溶膠—凝膠有利于固定帶正電荷十六烷基三甲基溴化銨膠束和正辛基三乙氧基硅烷修飾.

圖1 C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒的制備示意圖.Fig.1 Schematic diagram of preparation of restricted-access C8-Fe3O4@mSiO2 nanoparticles

通過SEM、TEM、FI-IR和VSM對制備工藝進行了評價.通過掃描電鏡和透射電鏡觀察Fe3O4和Fe3O4@mSiO2的形貌(圖2).Fe3O4的SEM和TEM圖像(圖2a、2c)顯示的是平均直徑約為20～30 nm的微球.在SiO2包覆和正辛基三乙氧基硅烷功能化后，微球表面變得粗糙，粒徑在60 ～ 75 nm之間(圖2b、2d) TEM圖像顯示C8-Fe3O4@mSiO2的納米結(jié)構(gòu)由核殼球狀納米粒子組成，核約為20 ～ 30 nm，與Fe3O4的大小基本相同，殼層約為40 ～ 55 nm，包裹SiO2(圖2e).

a. Fe3O4的SEM圖像； b. C8-Fe3O4@mSiO2的SEM圖像； c. Fe3O4的TEM圖像； d. C8-Fe3O4@mSiO2的TEM圖像 圖2 磁性納米粒子形貌Fig. 2 Morphology of magnetic nanoparticles

圖3顯示了Fe3O4和C8-Fe3O4@mSiO2納米粒子的紅外光譜.3 420 cm-1附近的寬帶是Fe3O4羥基的彎曲振動特征.567 cm-1處的寬帶是鐵氧鐵拉伸振動的特征，是磁鐵礦Fe3O4的特征.在C8-Fe3O4@mSiO2的紅外光譜中，1 050 cm-1和800 cm-1處的特征峰歸因于線性Si—O—Si中Si—O的拉伸和兩個硅原子關(guān)于其橋氧的對稱振動，而在2 920 cm-1和2 850 cm-1處的吸收峰歸因于正辛基三乙氧基硅烷的-CH2和-CH3基團的C-H振動.這些結(jié)果表明，由C8基團修飾的Fe3O4@mSiO2已經(jīng)通過簡單的溶膠—凝膠法成功地沉積在Fe3O4@mSiO2的殼層上.

圖3 Fe3O4(a)與C8-Fe3O4@mSiO2(b) 介孔納米粒子的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4 (a) and C8-Fe3O4/mSiO2 (b) mesoporous nanoparticle

通過氮氣吸附—解吸實驗進一步證實了所制備的C8-Fe3O4@mSiO2的介孔結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表1所示.C8-Fe3O4@mSiO2的BET表面積、平均孔徑和總孔體積分別為91.41 m2·g-1、12.99 nm和0.028 cm3·g-1，而Fe3O4的BET表面積、平均孔徑和總孔體積分別僅為42.38 m2·g-1、1.212 nm和0.015 cm3·g-1，表明C8功能化二氧化硅涂層可以提高磁性Fe3O4微球的表面積、孔徑和孔體積.因此，更多的小分子靶點被吸附到更大的孔中，在SiO2層外排除了大分子蛋白(大于14 nm).

表1 Fe3O4和C8-Fe3O4@mSiO2 納米顆粒的結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.1 Textural parameters obtained for the Fe3O4 and C8-Fe3O4@mSiO2 nanoparticles

2.2影響MIT-MSPE-ISD程序的因素

在實驗中，優(yōu)化了幾個可能影響衍生化和萃取的參數(shù)，如2，4-二硝基苯肼的量、樣品的酸堿度和C8-Fe3O4@mSiO2納米粒子的量.在0.10～0.35 mL-1范圍內(nèi)研究了2，4-二硝基苯肼用量對效率的影響，2，4-二硝基苯肼濃度在50 μmol·L-1時保持不變.如圖S1(見附錄)所示己醛和2-丁酮衍生物的峰面積隨2，4-二硝基苯肼量的增加而迅速增加，但在0.25 mL后增加速率減慢.表明2，4-二硝基苯肼與目標化合物反應(yīng)完全.因此，選擇濃度為50 μmol·L-1的0.25 mL 2，4-二硝基苯肼用于后續(xù)實驗.

合適的酸堿度對醛酮和二硝基苯酚的衍生反應(yīng)至關(guān)重要.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)衍生反應(yīng)可以在酸性介質(zhì)中加速以獲得相應(yīng)的腙.此外，pH值可能影響吸附劑和目標分析物之間的相互作用.因此，在pH為1.5 ～ 6.5的范圍內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)樣品pH值，研究樣品pH的影響，如圖S2(見附錄)所示羰基衍生物的峰面積在pH為3.5時達到最大.隨著pH進一步升高，信號迅速下降.中性和弱酸性條件下衍生效率低可以解釋這種下降.在酸性pH范圍(1.5～3.5)下的穩(wěn)定性信號表明，介孔SiO2改性涂層在pH范圍內(nèi)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，在整個實驗過程中沒有觀察到酸性腐蝕或降解現(xiàn)象.為了獲得較高的衍生化反應(yīng)效率和穩(wěn)定的萃取效率，本實驗選擇pH為3.5.

吸附劑的用量是影響MIT-MSPE-ISD性能的關(guān)鍵因素.通過C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒的添加量(3～7 mg)考察C8-Fe3O4@mSiO2的添加量對萃取效果的影響.從圖S3(見附錄)中可以看出隨著C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒量的增加，被分析物的峰面積增加，然后曲線在5 mg以上略有下降.曲線上升的原因是吸附劑越多，有效吸收部位越多，吸附劑的吸收能力越強.下降的原因可能是解吸溶劑(丙酮)在解吸更多負載的C8-Fe3O4@mSiO2納米粒子時揮發(fā).更多的C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒裝載在管中，僅通過磁鐵的運動進行重復(fù)的提取和解吸是不容易的.因此，采用5 mg C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒對目標化合物進行提取，以保證萃取效率高，重現(xiàn)性好.

從理論上講，低溫不利于衍生化，而加熱可以加速衍生化反應(yīng)，提高醛酮衍生物的收率.反之，高溫會使衍生物與物質(zhì)的相互作用減弱，從而降低醛酮衍生物的萃取效率.因此，在20 ℃～ 60 ℃、0.10 mL·min-1流速下，考察了溫度對MSPE原位衍生化的影響.如圖S4(見附錄)所示，低溫將不利于衍生化，特別是對于酮，而加熱可以加速衍生化反應(yīng)并增加醛酮衍生物的產(chǎn)率，并且它們的峰面積在40 ℃時具有最大值，而過高的溫度將降低吸附劑的穩(wěn)定性并導(dǎo)致提取效率的降低.最佳衍生化時間為1.0 ～ 11.0 min.如圖S5(見附錄)己醛和2-丁酮的衍生率隨著衍生時間的增加而增加，從1.0 min到5.0 min.當(dāng)衍生時間超過5.0 min時，衍生過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)峰更多，因此使用5.0 min完成衍生.

甲醇、乙醇和乙腈、丙酮是常用的有機溶劑，用于從吸附劑中洗脫分析物.以丙酮為洗脫劑的解吸效果最好.在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了丙酮的體積為40 ～ 80 μL.所有分析物的峰面積從40 μL增加到50 μL，然后隨著丙酮體積增大而減小，如圖S6(見附錄)，隨著解吸溶劑用量的增加，解吸峰面積減小是由于稀釋作用.因此，選擇50 μL的丙酮進行解吸.在0.04 ～ 0.12 mL·min-1范圍內(nèi)考察了樣品溶液的流速對萃取效率和衍生化反應(yīng)時間的影響.從0.04到0.06 mL·min-1，醛酮衍生物的峰面積略有增加，如圖S7(見附錄)隨著解吸流速從0.06到0.12 mL·min-1的增加，醛酮衍生物的峰面積略有減少.最后選擇0.06 mL·min-1.總體而言，最佳條件為：0.5 mL樣品溶液(含酸性磷酸鹽緩沖溶液)中羰基用50 μmol·L-12，4-二硝基苯肼衍生，用5 mg C8-Fe3O4@mSiO2萃取5 min，以50 μL丙酮為解吸溶劑解吸.

為了研究磁性限進吸附劑的回收，在下一次使用之前，使用2 mL甲醇和2 mL水清洗C8-Fe3O4@mSiO2納米顆粒.如圖S8(見附錄)，所示經(jīng)過6次循環(huán)后，兩種衍生物的峰面積都有輕微的減小.結(jié)果表明C8-Fe3O4@mSiO2吸附劑是穩(wěn)定的，并且在MIT-MSPE過程中沒有分析物的殘留，顯示出良好的可重用性.

2.3方法評價

為驗證該方法，在最佳實驗條件下，在空白血清基質(zhì)中線性、檢出限、重復(fù)性和回收率等基本分析參數(shù)進行了評價.在優(yōu)化的實驗條件下，制備一系列血清溶液，分別含有0.20、0.5、1.0、2.0、8.0、20.0和50.0 μmol·L-1，并進行提取和測定，建立校準曲線.如表2所示，在0.020 ～ 50 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均為0.999 1.以信噪比(S/N)為3和10的檢測限和定量限分別為1.0 ～ 1.2 nmol·L-1和3.4～4.0 nmol·L-1.以日內(nèi)和日間相對標準偏差表示的重復(fù)性在2.1% ～ 7.9%之間.利用相對回收率來評估該方法在兩種不同濃度下的準確性.由表S1(見附錄)可知，相對回收率為78.4% ～ 92.4%，對于痕量分析相對回收率的要求是70%～110%，即可表明方法的準確性，實驗的相對回收率在100%以下并不存在系統(tǒng)誤差.該方法的相對標準偏差(RSD)為3.2% ～ 7.3%，重復(fù)性在3.2%～ 7.3%之間，適用于血清樣品中羰基化合物的分析.圖S9(見附錄)為肝癌患者和健康志愿者空白和加標血清樣本的典型色譜圖.常規(guī)的前處理方法是固相萃取(SPE)法.使用約100 mg ODS C18吸附劑(30 mm粒徑)1 g為固定相，將之裝入固相萃取柱中，結(jié)果表明固相萃取法的消耗樣品和溶劑量大，不適合血液樣品.因此，本實驗未進一步進行比對分析.同時為了討論所建立的方法在測定2-丁酮和己醛的實用性，與其他方法進行了比較.表3可以看出，該方法操作簡便，抗干擾能力強，選擇性高，檢出限低.

表2 所開發(fā)方法的分析性能Tab.2 Analytical performance of the developed method

表3 本實驗與其他方法的比較Tab.3 Comparison with other methods

2.4人血清樣品中己醛和2-丁酮的測定

為了評價所建立的方法的性能，應(yīng)用MIT-MSPE-ISD測定了15名健康志愿者和15名肝癌患者血清樣本中的2-丁酮和己醛的濃度.分析結(jié)果見表4.可以看出，正常受試者的2-丁酮濃度在0.15 ～ 0.53 μmol·L-1，己醛濃度在0.14～0.71 μmol·L-1.2-丁酮和己醛的濃度分別為0.31～1.1 μmol·L-1和0.44 ～ 1.5 μmol·L-1.雖然肝癌患者血清樣本中己醛和2-丁酮的濃度水平均有高于健康志愿者的趨勢，但兩組血清樣本中兩種羰基的濃度存在相當(dāng)大的重疊.其原因可能與個人的飲食習(xí)慣、刷牙習(xí)慣、性生活、吸煙甚至生活環(huán)境等現(xiàn)象有關(guān).因此，考慮到多種條件，需要進行更廣泛的研究，目前正在對血清樣品中其他揮發(fā)性有機化合物進行系統(tǒng)分析.

表4 健康人與肝癌患者血清結(jié)果分析Tab.4 Results of serum from healthy persons and liver cancer patients analysis

3結(jié)論

本研究成功制備了RAM C8-Fe3O4@mSiO2磁性納米顆粒，并用于從人血清樣品中提取2-丁酮和己醛.該材料結(jié)合了RAM和MNPs的優(yōu)點，對小而珍貴的血清樣品具有良好的抗干擾能力、高選擇性，重復(fù)性合理，檢出限低，為復(fù)雜生物樣品中醛酮代謝物的定量分析提供了一種新的方法.