黃祥 楚光明 徐迎春 王雪蓮 楊梅花

摘要：為探究耐寒睡蓮不同部位對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及其抗寒性，研究以我國新疆原生種雪白睡蓮（Nymphaea candida）和栽培品種伊麗莎白公主睡蓮（Nymphaea ‘Princess Elizabeth）為試驗(yàn)材料，在人工氣候箱中模擬低溫脅迫環(huán)境（0 ℃）設(shè)置持續(xù)低溫處理0、12、24、36、48、60、72 h，測(cè)定不同時(shí)長(zhǎng)低溫脅迫下2種睡蓮葉片、葉柄、根狀莖中的丙二醛（MDA）含量、相對(duì)電導(dǎo)率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、可溶性糖（SS）含量、可溶性蛋白（SP）含量、葉綠素含量等生理指標(biāo)，并用主成分分析法和隸屬函數(shù)法對(duì)2種睡蓮不同部位及其品種之間的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：不同部位之間，雪白睡蓮葉片和葉柄部位抗寒性強(qiáng)于伊麗莎白公主睡蓮，根狀莖部位弱于伊麗莎白公主睡蓮;2個(gè)品種之間，雪白睡蓮抗寒性強(qiáng)于伊麗莎白公主睡蓮。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討耐寒睡蓮品種抗寒機(jī)制和擴(kuò)繁推廣提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雪白睡蓮;伊麗莎白公主睡蓮;低溫脅迫;生理響應(yīng);隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià);抗寒性評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S682.320.1 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0128-07

睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）多年生水生植物，具有很高的觀賞、食用、藥用、生態(tài)修復(fù)等價(jià)值[1]。睡蓮按其生態(tài)習(xí)性特征可分為耐寒睡蓮（hardy waterlily）、熱帶睡蓮（tropical waterlily），前者分布于亞熱帶和溫帶地區(qū)，后者分布于熱帶地區(qū)[2]。低溫是限制睡蓮自然越冬的主要因素，睡蓮在低溫脅迫下的生理響應(yīng)及抗寒性研究對(duì)睡蓮?fù)茝V種植具有重要的指導(dǎo)意義。

0 ℃是低溫對(duì)植物產(chǎn)生危害的溫度界線[3]，低溫脅迫導(dǎo)致植物的細(xì)胞膜透性、保護(hù)酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等發(fā)生顯著性變化[4]。植物抗寒性與多種因素相關(guān)，抗寒性機(jī)理十分復(fù)雜，抗寒性評(píng)價(jià)必須是多方面的[5]。目前，國內(nèi)外對(duì)荷花[6-7]、水生鳶尾[8]、水生菖蒲[9]等水生植物的抗寒性研究較多，其中，吉琴對(duì)6種熱帶睡蓮進(jìn)行人工低溫脅迫處理，研究了不同品種熱帶睡蓮抗寒性并進(jìn)行了抗寒能力綜合評(píng)價(jià)[10]。而針對(duì)耐寒睡蓮及其不同部位的抗寒生理研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)選取我國新疆原生種雪白睡蓮（Nymphaea candida）和栽培品種伊麗莎白公主（Nymphaea ‘Princess Elizabeth）2種耐寒睡蓮為試驗(yàn)材料，在低溫0 ℃環(huán)境下（智能氣候箱人工模擬）處理不同時(shí)長(zhǎng)，測(cè)定其不同部位（葉片、葉柄、根狀莖）的生理指標(biāo)，研究低溫脅迫下其生化指標(biāo)的變化規(guī)律和不同部位對(duì)低溫響應(yīng)的差異，結(jié)合生理指標(biāo)，建立抗寒性評(píng)價(jià)體系，以期為睡蓮抗寒性鑒定、耐寒選育和擴(kuò)繁推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2020年在新疆維吾爾自治區(qū)石河子市石河子大學(xué)進(jìn)行，試驗(yàn)地位于86°3′9″E、44°17′49″N附近，海拔430 m，無霜期為168～171 d，年均氣溫 7～8 ℃，日照時(shí)數(shù)2 300～2 700 h，年降水量180～270 mm。

1.2 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用雪白睡蓮（Nymphaea candida）和伊麗莎白公主（Nymphaea ‘Princess Elizabeth）睡蓮2個(gè)耐寒品種，于2020年4月采用溫室內(nèi)自然光照的盆栽方式，盆深50 cm、口徑45 cm，正常水肥管理，當(dāng)植株長(zhǎng)至9～11張葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，進(jìn)行低溫處理。

1.3 試驗(yàn)方法

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將2種盆栽睡蓮分別移至人工氣候箱中模擬低溫脅迫環(huán)境（0 ℃）。低溫處理時(shí)長(zhǎng)為0、12、24、36、48、60、72 h，取樣時(shí)間為每天10：00。葉片、葉柄取樣點(diǎn)為長(zhǎng)勢(shì)相同的浮水功能葉及其葉柄，根狀莖取樣點(diǎn)為長(zhǎng)勢(shì)相同的主莖，每個(gè)指標(biāo)取3盆重復(fù)。將取樣葉片、葉柄、根狀莖洗凈、擦干，其中葉片去除主脈和葉緣。取樣材料分成2個(gè)部分，一部分剪碎（0.5 cm×0.5 cm）用于測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率和葉綠素含量指標(biāo)，另一部分液氮凍存后置于-80 ℃保存，用于丙二醛含量、可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性等生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率（REC）采用電導(dǎo)法[3]測(cè)定;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[3]測(cè)定;超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法比色法、愈創(chuàng)木酚法和紫外吸收法[11]測(cè)定;可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[3]測(cè)定;葉綠素含量采用分光光度計(jì)法[11-12]測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過隸屬函數(shù)法計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[13]，其中，REC和MDA含量采用降型分布函數(shù)：U（X i）=（X imax-X ij）/（X imax-X imin）;SS、SP含量及SOD、POD、CAT活性與Chl總含量采用升型分布函數(shù)：U（X i）=（X ij-X imax）/（X imax-X imin），式中：X ij表示各指標(biāo)值;X imax和X imin分別表示第i項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值[13]，隸屬函數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的權(quán)重系數(shù)累加求和得出綜合評(píng)定值。通過Excel 2016整理數(shù)據(jù)、繪圖，SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)睡蓮細(xì)胞膜透性的影響

由圖1可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種睡蓮不同部位REC均呈上升趨勢(shì)。處理72 h時(shí)，葉片中REC相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（182.4%）<伊麗莎白公主睡蓮（235.5%）;葉柄中REC相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（142.6%）<伊麗莎白公主睡蓮（175.5%）;根狀莖中REC相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（103.1%）>伊麗莎白公主睡蓮（92.1%）。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種睡蓮葉片、葉柄中MDA含量明顯呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，而根狀莖中MDA含量整體呈逐漸上升趨勢(shì)。低溫處理24～36 h時(shí)，葉片中MDA含量達(dá)到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（41.2%）<伊麗莎白公主睡蓮（120.6%）;低溫處理36 h時(shí)，葉柄中MDA含量達(dá)到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（108.1%）<伊麗莎白公主睡蓮（160.5%）;根狀莖中MDA含量在72 h達(dá)到最大值，相比對(duì)照增幅：雪白睡蓮（135.2%）>伊麗莎白公主睡蓮（77.8%）。0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

2.2 低溫脅迫對(duì)睡蓮抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種睡蓮不同部位SOD活性均整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。低溫處理48 h，葉片中SOD活性均上升到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（166.9%）<伊麗莎白公主睡蓮（314.8%）;低溫處理36～48 h，葉柄中SOD活性分別達(dá)到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（199.3%）>伊麗莎白公主睡蓮（113.4%）;根狀莖的SOD活性分別在低溫處理24、48 h時(shí)上升到最大，相比對(duì)照增幅：雪白睡蓮（158.7%）<伊麗莎白公主睡蓮（178.4%）。

2種睡蓮不同部位POD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。低溫處理12 h，葉片中POD活性上升到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（35.5%）<伊麗莎白公主睡蓮（70.0%）;低溫處理48 h，葉柄中POD活性分別達(dá)到峰值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（87.0%）>伊麗莎白公主睡蓮（63.1%）;根狀莖的POD活性分別在低溫處理48、12 h上升到最大，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（390.4%）>伊麗莎白公主睡蓮（82.7%）。

2種睡蓮不同部位CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。低溫處理12、48 h，葉片中CAT活性均上升到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（263.4%）<伊麗莎白公主睡蓮（356.6%）;低溫處理36、24 h，葉柄中CAT活性分別達(dá)到最大值，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（217.6%）>伊麗莎白公主睡蓮（108.2%）;根狀莖的CAT活性分別在低溫處理36、12 h上升到最大，相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（91.1%）<伊麗莎白公主睡蓮（96.3%）。

2.3 低溫脅迫對(duì)睡蓮可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種睡蓮根狀莖中SS含量整體呈先升后降的趨勢(shì);葉片、葉柄部位SS含量，雪白睡蓮逐漸升高，伊麗莎白公主睡蓮呈先升后降的趨勢(shì)。低溫處理72、24 h，葉片中SS含量相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（165.6%）>伊麗莎白公主睡蓮（156.7%）;低溫處理72、48 h，葉柄中相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（301.0%）>伊麗莎白公主睡蓮（194.2%）;在低溫處理36 h，根狀莖中SS含量相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（168.9%）<伊麗莎白公主睡蓮（286.4%）。

2種睡蓮不同部位中SP含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。低溫處理24 h，葉片中SP含量相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（164.2%）<伊麗莎白公主睡蓮（242.0%）;低溫處理24、36 h，葉柄中SP含量相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（106.3%）<伊麗莎白公主睡蓮（132.2%）;低溫處理48 h，根狀莖中SP含量相比對(duì)照增幅為雪白睡蓮（248.9%）>伊麗莎白公主睡蓮（152.2%）。

2.4 低溫脅迫對(duì)葉綠素總含量的影響

由圖4可知，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種睡蓮不同部位葉綠素總含量呈現(xiàn)先降再升再降的變化趨勢(shì)。2種睡蓮不同部位整體在0～12 h明顯下降，12～36 h逐漸上升，在36 h下降差異性明顯。低溫脅迫72 h后，葉片中葉綠素總含量相比對(duì)照降幅為雪白睡蓮（37.6%）<伊麗莎白公主睡蓮（48.8%）;葉柄中葉綠素總含量相比對(duì)照降幅為雪白睡蓮（55.7%）>伊麗莎白公主睡蓮（53.4%）。

2.5 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

2.5.1 寒性綜合評(píng)價(jià)體系的建立

抗寒性綜合評(píng)價(jià)體系中，提取主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到80%以上的指標(biāo)對(duì)睡蓮的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[14]。由表1可知，葉片、葉柄、根狀莖中前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為80.71%、84.65%、82.64%。以前3個(gè)主成分分析各指標(biāo)的權(quán)重，由表2可知，睡蓮葉片中抗寒性相關(guān)性最大的指標(biāo)是SP含量，其次是CAT活性;睡蓮葉柄中抗寒性相關(guān)性最大的指標(biāo)是CAT活性，其次是SOD活性;睡蓮根狀莖中抗寒性相關(guān)性最大的指標(biāo)是SP含量，其次是SOD活性和SS含量。

2.5.2 各指標(biāo)隸屬度值及抗寒性綜合指數(shù)

抗寒性綜合指數(shù)是各指標(biāo)隸屬函數(shù)值加權(quán)計(jì)算后的綜合評(píng)定值[15]，綜合評(píng)定值越大，抗寒性越強(qiáng)[16]。由表3可知，2種睡蓮的相同部位抗寒性強(qiáng)弱也存在差異，葉片、葉柄部位抗寒性為雪白睡蓮>伊麗莎白公主睡蓮;根狀莖部位抗寒性為雪白睡蓮<伊麗莎白公主睡蓮。以2種睡蓮不同部位綜合得分計(jì)算出每種睡蓮的隸屬函數(shù)值，再求得每種睡蓮的抗寒性綜合評(píng)定值，結(jié)果表現(xiàn)為雪白睡蓮>伊麗莎白公主睡蓮。

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫對(duì)植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷很大，細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞程度常用MDA含量和REC進(jìn)行評(píng)估[17]。研究表明，MDA含量和REC隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均有不同程度的上升[18-19]。本試驗(yàn)中，低溫脅迫期間（0～72 h），雪白睡蓮和伊麗莎白公主睡蓮根狀莖部位MDA含量和REC整體上呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，但根狀莖中REC增幅遠(yuǎn)低于葉片和葉柄。2種睡蓮葉片和葉柄中MDA含量整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，表明低溫脅迫前期，膜質(zhì)過氧化作用加劇， MDA含量大量增加。 但在24～36 h后開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明經(jīng)一段時(shí)間的低溫鍛煉后，2種睡蓮地上部分抵御低溫能力提高，削弱了膜質(zhì)過氧化作用，這與張武君等在低溫脅迫對(duì)金銀花葉片的影響研究中MDA含量變化結(jié)果[20]基本一致。2種睡蓮不同部位的REC值均呈不斷上升趨勢(shì)，表明睡蓮植物細(xì)胞膜在低溫脅迫過程中選擇透性減弱，膜內(nèi)溶質(zhì)外滲，從而導(dǎo)致REC值持續(xù)增加。從MDA含量和REC值的大小及變化趨勢(shì)可得出，雪白睡蓮的葉片和葉柄部分受低溫脅迫的傷害程度低于伊麗莎白公主睡蓮，而根狀莖部位高于伊麗莎白公主睡蓮。

低溫脅迫下，SOD、POD、CAT等活性發(fā)生變化調(diào)控植物體內(nèi)的活性氧系統(tǒng)，參與其對(duì)低溫的調(diào)控[21-22]。本試驗(yàn)中，2種睡蓮不同部位SOD、POD、CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，表明低溫脅迫激發(fā)抗氧化酶使其活性增強(qiáng)，當(dāng)持續(xù)低溫超出其抵抗范圍，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，保護(hù)酶系統(tǒng)清除活性氧的能力下降，與李春燕等在小麥葉片低溫脅迫的研究中，抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)[23]相一致。本試驗(yàn)中，2種睡蓮不同部位SOD活性均保持較高水平，可及時(shí)歧化細(xì)胞內(nèi)的O- 2·，但不同部位中POD、CAT活性存在差異。雪白睡蓮葉片中POD、CAT活性在低溫脅迫12 h時(shí)急劇上升達(dá)到峰值，而伊麗莎白公主睡蓮根狀莖中POD、CAT活性變化情況與之相同，表明2種睡蓮地上地下部位在低溫脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)中清除SOD歧化O- 2·而產(chǎn)生的H 2O 2的機(jī)制上存在差異。這可能是睡蓮在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，為適應(yīng)水生環(huán)境，不同部位結(jié)構(gòu)存在差異[24]，進(jìn)而導(dǎo)致地上部位與地下部分對(duì)低溫響應(yīng)的差異。0510B22B-641D-458D-BCEB-DE920FD38F0F

低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)SS和SP大量積累，通過降低細(xì)胞的滲透勢(shì)來維持膨壓，提高植物的抗寒能力[25-27]。本試驗(yàn)中，2種睡蓮不同部位的SS、SP含量較低溫脅迫前均有不同程度的升高，這是2種睡蓮在提高細(xì)胞內(nèi)可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以減弱低溫對(duì)其傷害，增強(qiáng)自身抗寒性。這與李欣等在低溫脅迫下荷花地下莖可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化情況[28]基本一致。低溫脅迫后，2種睡蓮根狀莖中SS、SP含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，說明在低溫脅迫前期（0～24 h），睡蓮根狀莖細(xì)胞內(nèi)SS、SP含量增加以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，增強(qiáng)其抗寒能力;但在低溫脅迫后期（24～72 h），細(xì)胞質(zhì)膜透性被破壞，細(xì)胞內(nèi)含物外滲的同時(shí)SS、SP含量也因此下降。低溫脅迫期間，雪白睡蓮的葉片和葉柄中SS含量增幅高于伊麗莎白公主睡蓮，根狀莖中SS含量增幅低于伊麗莎白公主睡蓮;2種睡蓮不同部位SP含量增幅情況恰好相反?？赏茰y(cè)SS是雪白睡蓮抵抗低溫脅迫的主要可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而在伊麗莎白公主睡蓮中則是SP，這可能與2種睡蓮不同類型根狀莖相關(guān)。耐寒睡蓮不同類型根狀莖之間的抗寒性需進(jìn)一步研究。

植物體內(nèi)的葉綠素含量在逆境環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生生理變化[29]。本試驗(yàn)中，2種睡蓮的葉片、葉柄中葉綠素總含量整體呈先降后升再降趨勢(shì)。低溫脅迫前期（0～24 h），葉綠素含量的下降與張雪的研究結(jié)果[30]不同，這可能與本研究中處理溫度低于植物葉綠素形成的最低溫度（2～4 ℃）有關(guān);低溫處理24～36 h時(shí)，葉綠素含量整體小幅度增加，這可能是植物前期對(duì)低溫環(huán)境一定程度的適應(yīng);低溫脅迫后期（36～72 h），葉綠素含量逐漸降低，說明在持續(xù)低溫下葉綠素的合成受到限制，2種睡蓮對(duì)低溫逆境做出的生理反應(yīng)。在低溫脅迫下，雪白睡蓮相對(duì)伊麗莎白公主睡蓮葉綠素含量降幅保持一個(gè)較低的水平，這與抗寒性強(qiáng)的品種維持較高的葉綠素含量[31]相一致。

逆境脅迫過程中，多種因素共同影響植物生理生化指標(biāo)的變化，單一指標(biāo)不能滿足對(duì)植物抗逆性的評(píng)價(jià)[15，32]。本研究中，通過主成分分析和隸屬函數(shù)法對(duì)2種睡蓮品種之間及其不同部位的抗寒性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，不同部位之間，雪白睡蓮葉片、葉柄部位抗寒性高，根狀莖部位抗寒性低于伊麗莎白公主睡蓮;2個(gè)品種之間，雪白睡蓮抗寒性高于品種伊麗莎白公主睡蓮。綜合指標(biāo)得出的結(jié)果與單個(gè)指標(biāo)（REC、MDA含量、SS含量）得出的結(jié)果相一致，與抗氧化酶活性等指標(biāo)得出的結(jié)果存在一定差異。且綜合指標(biāo)的結(jié)果與實(shí)際形態(tài)觀測(cè)結(jié)果基本一致，說明運(yùn)用綜合評(píng)價(jià)法來確定睡蓮的抗寒性是很有必要的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，雪白睡蓮和伊麗莎白公主睡蓮的葉片、葉柄、根狀莖均表現(xiàn)出一定的抗寒性。在低溫脅迫下，2種耐寒睡蓮?fù)ㄟ^提高M(jìn)DA含量和REC值，調(diào)節(jié)抗氧化酶SOD、POD、CAT活性，增加SS、SP及葉綠素含量來抵御低溫傷害。通過生理生化指標(biāo)和抗寒性綜合評(píng)價(jià)得出，不同部位之間，雪白睡蓮葉片和葉柄部位抗寒性強(qiáng)于伊麗莎白公主睡蓮，根狀莖部位弱于伊麗莎白公主睡蓮;2個(gè)品種之間，雪白睡蓮抗寒性強(qiáng)于伊麗莎白公主睡蓮。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討耐寒睡蓮品種抗寒機(jī)制和擴(kuò)繁推廣提供了科學(xué)依據(jù)。

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