劉曉珊，來 昊，嚴兆蘭，張 巖，馮艷麗，余 翔

(1.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學 生命科學學院，湖北 黃石 435002)

0 引言

隨著社會發(fā)展與生活節(jié)奏的加快，消費者對新鮮、營養(yǎng)、方便且安全的鮮切凈菜產(chǎn)品日益關(guān)注[1]，蓮藕[2]、菠蘿[3]、西瓜[4]和桃子[5]等眾多果蔬被開發(fā)成鮮切蔬菜產(chǎn)品來滿足消費者的需求，其中鮮切蓮藕制品以其處理方便、營養(yǎng)豐富和口感脆嫩等優(yōu)點而深受消費者的喜愛。由于新鮮蓮藕原料內(nèi)富含水分和酚類物質(zhì)[6]，在切分處理以及后續(xù)低溫貯藏過程中，極易由于機械損傷造成鮮切蓮藕制品表面脫水萎縮、褐變，甚至發(fā)生腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象，從而影響鮮切蓮藕產(chǎn)品感官和安全品質(zhì)，縮短其貨架期，極大地制約了鮮切蓮藕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此如何延長鮮切蓮藕制品保鮮期成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題，眾多研究人員開展了系列研究，出天然保鮮劑保鮮法[7]、化學保鮮劑保鮮法[8]和氣調(diào)保鮮法[9]等技術(shù)，取得了較好的保鮮效果。其中，天然保鮮劑以其成本低廉，操作簡單和安全高效等優(yōu)點受到研究者的廣泛關(guān)注，眾多安全、高效的天然保鮮物質(zhì)，例如殼聚糖、迷迭香提取物、乳酸鏈球菌素(Nisin)、茶多酚等被開發(fā)出來應用于果蔬制品保鮮加工中，取得了較好的應用效果。但研究同時也表明，使用單一天然保鮮劑其保鮮效果有限，往往會出現(xiàn)保鮮劑用量大但保鮮效果有限的現(xiàn)象，其抑菌性、抗氧化能力和膜的理化性能較差[10]。根據(jù)柵欄技術(shù)的原理，將具有不同保鮮功效的天然保鮮劑組分進行復配，可發(fā)揮各種天然保鮮劑組分的協(xié)調(diào)效應，使保鮮效果大幅提升[7]，是未來天然保鮮劑開發(fā)的方向。

課題組前期通過單因素和正交試驗優(yōu)化出一種基于殼聚糖的復配天然保鮮劑(殼聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)，應用于鮮切蓮藕保鮮可以大幅提升鮮切蓮藕的冷藏貨架期。

為盡快將該復配天然保鮮劑應用于規(guī)?；a(chǎn)，本試驗對采用該復配天然保鮮劑處理的鮮切蓮藕在冷藏過程中的感官、色澤、失重率、維生素C含量、可溶性固形物(Total soluble solid, TSS)、多酚氧化酶活性(Polyphenol oxidase, PPO)、過氧化物酶活性(Peroxidase, POD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量和菌落總數(shù)等指標進行跟蹤監(jiān)測，全面評價該復配天然保鮮劑對鮮切蓮藕冷藏保鮮效果的影響，為后續(xù)鮮切蓮藕規(guī)?；ｕr生產(chǎn)提供理論參數(shù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕(鄂蓮3號)，購于黃石市沈家營采陽園農(nóng)貿(mào)市場。

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，迷迭香提取物(水溶性)和乳酸鏈球菌素，均為食品級，河南圣斯得實業(yè)有限公司。

苯酚、3，5-二硝基水楊酸、愈創(chuàng)木酚、硼酸、氧化酶、硫酸、氫氧化鈉等，均為分析級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1900紫外可見分光光度計，日本島津公司；5418R臺式高速冷凍離心機，德國艾本德公司；CR-10型色差計，日本柯尼卡美能達公司；CP114型電子天平，美國奧豪斯儀器(上海)有限公司；YT-4型手持折光儀，上海實驗儀器總廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 復配天然保鮮劑配制及樣品處理方法 基于殼聚糖的復配天然保鮮劑參照前期研究獲得的配方(殼聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)進行配制，簡稱CRN(Chitosan + Rosemary extract + Nisin)保鮮劑。具體步驟為：稱取相應重量的殼聚糖用1%醋酸溶液溶解制成殼聚糖溶液，再根據(jù)比例稱取相應重量的迷迭香提取物和Nisin溶解至殼聚糖溶液中，攪拌均勻制成復配天然保鮮劑，4℃貯藏備用。

1.3.2 樣品處理 對照組(Control組)：挑選成熟度一致、肉質(zhì)白、無病蟲害和機械損傷的蓮藕，洗凈后切成3 mm厚的薄片，從中挑選大小均一的蓮藕切片30片，逐片稱重后編號，用小號保鮮袋分裝，置于4℃貯藏備用。實驗組(CRN處理組)：取30片大小均一的蓮藕切片，置于復配保鮮劑溶液中浸泡10 min，料液比為1∶2(g/mL)。撈出置于4℃瀝干20 min，逐片稱重編號，用小號保鮮袋分裝，4℃冷藏備用。

在鮮切蓮藕冷藏過程中，從新鮮原料開始，每隔2 d各從對照組和實驗組中隨機取3片鮮切蓮藕樣品，拍照后進行相關(guān)指標測定，一共測定12 d.

1.3.3 測定指標與方法

1)色度

采用色差計在所選的鮮切蓮藕樣品上均勻選取3個點進行色度測定，結(jié)果以a*，b*和L*值表示。

2)失重率

采用稱重法測定失重率，結(jié)果以%表示，計算公式如下：

3)可溶性固形物含量(Total soluble solid, TSS)

采用手持折光儀分別測定鮮切蓮藕的TSS，結(jié)果以%表示[11]。

4)維生素C含量

維生素C含量測定參照Yaman等[12]的2，6-二氯酚靛酚鹽滴定法進行測定，結(jié)果以mg/100g表示。

5)多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性測定

參照Gao等[13]的方法進行粗酶液制備，稍作修改。取2 g鮮切蓮藕樣品組織加入8 mL預冷至4℃的磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH 6.8)(含2%聚乙烯吡咯烷酮)，勻漿后4℃，12 000×g離心15 min，取上清即為粗酶液。

PPO測定時，將2.8 mL的鄰苯二酚溶液(9 mM)和0.2 mL粗酶液混合，迅速置于420 nm下測定其吸光度。酶活以樣品鮮重為基礎(chǔ)表示為Ug-1, U=0.01△A420nm min-1.

POD測定時，取0.1 mL粗酶液，2.4 mL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 6.8)和0.25 mL愈創(chuàng)木酚溶液(0.16 mol/L)進行混合后加入0.25 mL H2O2溶液(0.88 mol/L)，迅速置于470 nm下測定其吸光度。酶活以樣品鮮重為基礎(chǔ)表示為Ug-1, U=0.01△A470nm min-1.

6)MDA含量的測定

根據(jù)Gao等[13]方法，稍作修改。取2 g蓮藕組織加入4 mL含0.5%(w/v)硫代巴比妥酸的10%(w/v)三氯乙酸溶液進行勻漿，然后將勻漿混合物在100℃加熱10 min后迅速冷卻，然后置于5 000×g離心15 min，取上清液在450 nm, 532 nm和600 nm下測定吸光度。MDA濃度以樣品鮮重為基礎(chǔ)表示為μmol g-1.

7)菌落總數(shù)的測定

參照GB4789.2—2016規(guī)定的方法《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》對樣品進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件的one-way ANOVA程序進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標準偏差來表示，P<0.05為差異顯著性標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕外觀和色差的影響

圖1為對照組和CRN保鮮組鮮切蓮藕樣品4 ℃貯藏12 d的感官情況，對照組鮮切蓮藕樣品從貯藏第2 d開始，表面顏色變紅而且隨著貯藏時間的延長，顏色逐步加深。貯藏至第6 d，對照組鮮切蓮藕樣品表面開始出現(xiàn)明顯的脫水萎縮現(xiàn)象并隨著貯藏的時間延續(xù)不斷加重。CRN保鮮劑處理組鮮切蓮藕樣品在整個貯藏過程中，色澤鮮亮，無明顯脫水萎縮現(xiàn)象，保鮮品質(zhì)較好。

圖1 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕感官品質(zhì)的影響

采用色差儀進行的色差檢測能夠?qū)⒌蜏刭A藏過程中鮮切蓮藕產(chǎn)品表面的褐變進程以a*，b*和L*值來定量表示，是客觀評價鮮切蓮藕品質(zhì)的重要指標。兩組鮮切蓮藕樣品4℃貯藏過程中的色差變化如圖2 a)b)c)，在整個12 d的低溫貯藏過程中，對照組和CRN處理組鮮切蓮藕樣品的紅度值(a*)和黃度值(b*)值均呈上升趨勢，但CRN處理組的上升幅度明顯低于對照組(P<0.05)。亮度(L*)值在整個貯藏過程中均呈下降趨勢，CRN處理組的下降幅度顯著低于對照組(P<0.05)。色差值的變化與感官結(jié)果相符，據(jù)此分析，可能是由于CRN保鮮劑中的殼聚糖成分在鮮切蓮藕表面形成了致密的可食性膜，隔絕了鮮切蓮藕與空氣的接觸，再加之CRN保鮮劑內(nèi)迷迭香提取物組分的高效抗氧化能力，延緩了CRN處理組鮮切蓮藕樣品的酶促褐變進程。張春潔[14]、李麗[15]和闞超楠等[16]的研究均表明，殼聚糖處理對鮮切蔬菜制品(蓮藕、梨)均有較好的防褐變效果，本研究與之相符。

圖2 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕色差a)a*值，b)b*值，c)L*值的影響

2.2 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕失重率的影響

鮮切蓮藕在加工過程中由于失去表皮的保護，加之切分處理導致的機械損失加劇鮮切蓮藕的呼吸作用，導致其在冷藏過程中出現(xiàn)大量的水分蒸發(fā)使得失重率增大，導致蓮藕組織萎縮和鮮脆的口感喪失，極大地影響其外觀和口感，因此，如何降低鮮切蓮藕的失重率是保鮮的關(guān)鍵。采用CRN保鮮劑處理的鮮切蓮藕樣品4 ℃冷藏過程中失重率變化如圖3，對照組鮮切蓮藕樣品從貯藏第2 d開始，其失重率呈大幅上升趨勢(P<0.05)，而CRN處理組鮮切蓮藕在整個貯藏期間上升幅度較小，貯藏12 d后失重率僅為4.11%，失重率變化不顯著(P>0.05)，與“2.1 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕外觀影響”的結(jié)果一致。分析原因，可能主要是由于殼聚糖在表面形成的致密可食性膜減少了水分的蒸騰作用，降低了水分散失，進而使鮮切蓮藕的失重率下降。陳花[17]和Meng X H等[18]的研究結(jié)果也證實，果蔬采后經(jīng)殼聚糖涂膜后，在表面形成的可食性膜能降低水分的蒸發(fā)，同時阻隔外界O2的進入，使得果蔬表面形成高CO2低O2的氣體環(huán)境減弱果蔬的呼吸作用，有助于減緩果蔬貯藏過程失重率的升高和有機物質(zhì)的分解。

圖3 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕失重率的影響

2.3 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕TSS含量的影響

TSS含量指果蔬內(nèi)可溶性糖類(單糖、雙糖和少量多糖)、維生素和有機酸等小分子物質(zhì)的總量，直接反映果蔬營養(yǎng)品質(zhì)，也是評價其保鮮效果的重要指標[19]。CRN保鮮劑處理鮮切蓮藕冷藏過程中TSS變化如圖4.兩組鮮切蓮藕樣品TSS含量均呈先緩慢下降后急劇升高再緩慢下降的趨勢。在貯藏前4 d，對照組鮮切蓮藕樣品的下降幅度略高于CRN處理組(P>0.05)，可能是由于鮮切蓮藕的呼吸作用會消耗蓮藕組織內(nèi)存在的可溶性糖，導致TSS含量下降，CRN保鮮劑處理后的鮮切蓮藕樣品呼吸強度受到一定的抑制，因此其下降幅度略低于對照組。在貯藏4 d～8 d過程中，兩組鮮切蓮藕樣品內(nèi)TSS含量均急劇上升，CRN處理組上升幅度及含量均顯著高于對照組(P<0.05)，分析原因可能是此階段由于鮮切蓮藕內(nèi)可溶性糖被消耗殆盡，為了維持正常的呼吸代謝，大量的淀粉類多糖被水解為可溶性糖，導致鮮切蓮藕TSS含量快速上升，而CRN保鮮劑處理組樣品的呼吸作用受到抑制，其可溶性糖的損耗速度大幅低于對照組，使得TSS大量積累。貯藏8 d以后，由于鮮切蓮藕呼吸強度的上升和微生物大幅增殖引起鮮切蓮藕發(fā)生腐敗，鮮切蓮藕組織內(nèi)可溶性糖的消耗速度高于淀粉類多糖的分解速度，導致TSS含量開始下降，冷藏至12 d，CRN處理組TSS含量(8.23%)顯著高于對照組TSS含量(6.76%)(P<0.05)。本研究與唐倩等[20]采用電解臭氧水對鮮切蓮藕進行保鮮的研究結(jié)果一致。由此說明，CRN保鮮劑處理能一定程度抑制鮮切蓮藕的代謝，減少TSS的降低和質(zhì)量損失。

圖4 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕維生素可溶性固形物含量的影響

2.4 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕維生素C含量的影響

維生素C又稱抗壞血酸，具有提高免疫力、抗衰老、促進傷口愈合和維持骨骼正常功能等功效，是人體生長發(fā)育過程中必不可少的一種營養(yǎng)元素，果蔬類食品是人體維生素C攝入的主要來源。大量研究已證實維生素C在常態(tài)下不穩(wěn)定，在果蔬加工及貯藏過程中極易由于自身氧化而發(fā)生降解。因此，如何降低果蔬保鮮過程中維生素C的損耗是其保鮮工藝所關(guān)注的重要方面。CRN保鮮劑處理對鮮切蓮藕樣品4℃貯藏過程中維生素C含量的影響見圖5.兩組鮮切蓮藕樣品在冷藏過程中均呈下降趨勢，但CRN保鮮劑處理組的下降速度低于對照組，第4 d以后，CRN處理組鮮切蓮藕維生素C的含量顯著高于對照組(P<0.05)，尤其是在第8 d，CRN組鮮切蓮藕的維生素C含量為21.86 mg/100 g，對照組僅為13.04 mg/100 g，達到最大差值，繼續(xù)冷藏至12 d，CRN組鮮切蓮藕的維生素C含量下降至13.86 mg/100 g，但依然顯著高于對照組(6.24 mg/100 g)(P<0.05)。說明CRN保鮮劑處理能夠降低維生素C的降解從而維持鮮切蓮藕良好的營養(yǎng)品質(zhì)，其原因可能是由于CRN在鮮切蓮藕表面形成的可食性膜隔絕其與外界的O2接觸，在膜內(nèi)形成低O2環(huán)境，再加之可食性膜中的迷迭香提取物組分具有較好的抗氧化能力，協(xié)調(diào)抑制了維生素C的氧化分解。在藍莓[21]和鮮切蘋果[22]的保鮮研究中發(fā)現(xiàn)，基于殼聚糖的復配天然保鮮劑涂膜處理能夠顯著抑制果實維生素C的下降，本研究結(jié)果與之相符。

圖5 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕維生素C含量的影響

2.5 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕PPO和POD活性的影響

果蔬貯藏過程中，PPO能將組織內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化為不穩(wěn)定的醌，醌進一步聚合生產(chǎn)黑色物質(zhì)引起果蔬褐變。POD作為一類氧化酶，能將果蔬代謝中產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，同時能促進酚類物質(zhì)形成醌，與PPO協(xié)同作用促進果蔬褐變[23,24]。因此，控制PPO和POD酶活性是延緩果蔬貯藏過程中酶促褐變速度，提高保鮮效果的關(guān)鍵點。CRN處理對鮮切蓮藕樣品4℃貯藏過程中PPO和POD活性的影響見圖6和圖7.對照組PPO活性從貯藏第2 d開始大幅上升，在第6 d達到最高(60.79 Ug-1)，隨后開始小幅下降，這可能跟鮮切蓮藕樣品貯藏過程中組織內(nèi)的酚類物質(zhì)被消耗導致總量下降有關(guān)，而CRN保鮮劑處理組在整個冷藏過程中呈略微升高趨勢(P>0.05)，貯藏至第12 d，其PPO活性(17.95 Ug-1)仍顯著低于對照組(P<0.05)。兩組鮮切蓮藕貯藏過程中的POD活性變化與PPO活性的變化一致(圖7)，CRN處理組鮮切蓮藕樣品在整個12 d貯藏過程中POD活性變化不明顯，貯藏至第12 d其POD活性為17.32 Ug-1.但相比于對照組，貯藏過程中CRN處理組POD活性顯著低于對照組(P<0.05)。相關(guān)研究表明，采用基于植物多糖(殼聚糖[25]、海藻酸鈉[14]、山藥黏液[26]等)的復配天然保鮮劑對鮮切果蔬進行保鮮處理，能有效降低鮮切果蔬PPO和POD活性，達到延緩鮮切果蔬褐變提高其保鮮效果的目的。本研究結(jié)果與之相符，確定CRN保鮮劑能夠抑制鮮切蓮藕PPO和POD活性的增長，延緩鮮切蓮藕褐變。

圖6 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切藕片PPO活性的影響

圖7 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切藕片POD活性的影響

2.6 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕MDA含量的影響

鮮切果蔬在切分處理中容易導致組織損傷，其創(chuàng)面組織在氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)的作用下導致細胞膜中的多不飽和脂肪酸組分被加速氧化成脂質(zhì)氫過氧化物，使得創(chuàng)面細胞膜進一步發(fā)生過度氧化損傷，容易造成鮮切果蔬切分處發(fā)生快速褐變現(xiàn)象[27]。MDA是植物組織細胞發(fā)生膜脂過氧化的主要產(chǎn)物。通過 MDA的含量可以評價植物組織細胞膜系統(tǒng)的損傷程度和衰老程度[28]。在本研究中，CRN保鮮劑對鮮切蓮藕MDA含量的影響見圖8，對照組鮮切蓮藕在貯藏過程中MDA含量顯著上升(P<0.05)，而CRN處理組鮮切蓮藕MDA含量上升速度較慢，貯藏第12 d 其MDA含量為2.26 μmol·g-1，顯著低于對照組MDA含量(4.31 μmol·g-1)(P<0.05)，說明CRN涂膜保鮮處理后的鮮切蓮藕細胞膜過度氧化程度被降低，有延緩鮮切蓮藕的褐變速度的效果，這與楊麗嬪等[26]對鮮切馬鈴薯保鮮的研究結(jié)果一致。

圖8 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕MDA含量的影響

2.7 CRN保鮮劑對鮮切蓮藕菌落總數(shù)的影響

鮮切果蔬在切分過程中的機械損傷容易造成組織內(nèi)汁液等營養(yǎng)成分外流，為微生物增殖提供了營養(yǎng)供給和生長環(huán)境，是加速鮮切果蔬產(chǎn)品發(fā)生腐敗變質(zhì)的主要原因[29]，因此，如何抑制鮮切果蔬產(chǎn)品冷藏過程中的菌落總數(shù)增長是其保鮮工藝的關(guān)鍵控制點。CRN保鮮劑對鮮切蓮藕菌落總數(shù)的影響見圖9.隨著冷藏時間的延續(xù)，對照組和CRN保鮮組鮮切蓮藕的菌落總數(shù)均呈上升趨勢，貯藏至第12 d, CRN處理組菌落總數(shù)為5.01 lgCFU g-1，且CRN保鮮組始終顯著低于對照組(P<0.05)。分析原因可能是由于鮮切蓮藕經(jīng)CRN保鮮劑處理，保鮮劑中的Nisin組分能夠有效地抑制微生物的增殖，再加之殼聚糖良好的成膜性能在鮮切蓮藕表面形成致密的可食性膜最大化地阻隔了鮮切蓮藕與O2的接觸，抑制了好氧微生物的生長。王發(fā)祥[30]和夏天龍等[31]的研究也表明,低溫下鮮切蓮藕表面微生物主要以假單胞菌屬、歐文氏菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬和霉菌等好氧或兼性好氧微生物為主。據(jù)此確定本研究采用的CRN保鮮劑對鮮切蓮藕具有較好的抑菌效果，能較好地延緩冷藏過程中鮮切蓮藕的腐敗變質(zhì)速度。

圖9 CRN保鮮劑處理對4℃貯藏的鮮切蓮藕菌落總數(shù)的影響

3 結(jié)論

采用基于殼聚糖的復配天然保鮮劑(殼聚糖15 g/L、迷迭香提取物1.5 g/L、Nisin 2.25 g/L)處理的鮮切蓮藕在4℃冷藏過程中，鮮切蓮藕的感官品質(zhì)和色澤良好，失重率、PPO、POD活性、MDA含量和菌落總數(shù)均大幅低于對照組，而維生素C和TSS等營養(yǎng)物質(zhì)含量高于對照組，說明CRN保鮮劑能夠有效抑制鮮切蓮藕冷藏過程中組織脫水、酶促褐變和微生物的增殖，并延緩維生素C和TSS等營養(yǎng)物質(zhì)的損耗，保鮮效果十分明顯。本研究在證明該基于殼聚糖的復配天然保鮮劑合理性和科學性的同時，也為其它基于殼聚糖涂膜的鮮切果蔬復配天然保鮮劑開發(fā)提供研究思路和借鑒。