姚小暄，楊雨嘉，霍慧敏，江 川，崔 昆，黃中恒，唐錦平，韋正波△，謝 瑩,3△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，南寧 530021；3.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

鼻咽癌是一種與Epstein-Barr 病毒感染密切相關(guān)的頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，具有獨(dú)特的地區(qū)分布，在東亞、東南亞、北非和東非，特別是中國(guó)南方等地區(qū)明顯高發(fā)[1]。從鼻咽癌的組織學(xué)檢測(cè)及單細(xì)胞測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞周圍有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，提示免疫失調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2-4]。腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），來(lái)源于腹腔巨噬細(xì)胞、表皮朗格漢斯細(xì)胞、卵黃囊前體、骨髓造血干細(xì)胞等，在微環(huán)境中各種信號(hào)因子的調(diào)節(jié)下極化成不同表型的巨噬細(xì)胞，通常分為經(jīng)典活化型（M1-TAM）和交替活化型（M2-TAM）兩種功能亞型[5]。分泌至腫瘤微環(huán)境中的干擾素（IFN）-γ、脂多糖（LPS）以及粒細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）等，通過(guò)不同途徑激活巨噬細(xì)胞向M1-TAM型極化。M1型細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-12、IL-6 和IL-1β等促炎因子，并將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)CD4+Th1依賴的免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)機(jī)體的免疫應(yīng)答[6-7]。而腫瘤微環(huán)境中，CD4+T細(xì)胞分泌的IL-4、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的IL-10、Th2 型細(xì)胞分泌的IL-13 以及B 細(xì)胞分泌的免疫球蛋白等，使招募的巨噬細(xì)胞向M2-TAM型極化[8]。M2-TAM分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、IL-10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、活性氧類（ROS）、前列腺素E2（PGE2）、趨化因子配體18（CCL-18）等，形成免疫抑制微環(huán)境，誘導(dǎo)新生血管和淋巴管形成，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[9]。本研究擬探索基于人單核細(xì)胞白血病THP-1 細(xì)胞的體外巨噬細(xì)胞極化模型，同時(shí)探討鼻咽癌細(xì)胞系（5-8F、HONE1）培養(yǎng)上清液對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞極化方向的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人THP-1細(xì)胞（Procell CL-0233）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。人鼻咽癌低分化鱗狀細(xì)胞株5-8F和HONE1購(gòu)于湖南湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM完全培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；流式抗體PerCP-Cyanine5.5 anti-Human CD14、FITC anti-Human CD68、PE anti-Human CD86、Alexa Fluor 647 anti-Human CD163、APC anti-Human CD206 均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；引物由AuGCT DNA-SYN Biotechnology Synthesis Lab 提供；佛波酯（PMA）和LPS 購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司；重組人IL-13、IL-4、IFN-γ 均購(gòu)于PeproTech公司。

1.3 THP-1-M0 巨噬細(xì)胞分化 將THP-1 細(xì)胞按1×106～2×106個(gè)/mL 密度接種于完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液。分別用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA 刺激THP-1 細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為M0型巨噬細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，倒置相差顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞形態(tài)，篩選PMA的最佳刺激濃度。

1.4 細(xì)胞因子誘導(dǎo)THP-1-M0 向M1 型和M2 型極化 PMA刺激后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，加入10 pg/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ 處理72 h，使M0 向類M1 型細(xì)胞方向極化，得到THP-1-M1；加 入20 ng/mL IL-4 和20 ng/mL IL-13處理THP-1-M0 使其向類M2 型方向極化，得到THP-1-M2。

1.5 鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)THP-1源M0型巨噬細(xì)胞極化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞5-8F 和HONE1 以適當(dāng)密度接種于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞完全貼壁后，換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)收集培養(yǎng)上清液，用0.22 μm 孔徑的細(xì)胞濾器過(guò)濾細(xì)胞碎片，4 ℃、3 000 r/min 離心5 min，取上清。按1∶1 體積比加入新鮮完全培養(yǎng)基，分別配置5-8F 和HONE1 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，加入THP-1 源M0 細(xì)胞中，處理48 h，以不作處理的M0 細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為5-8F-M0及HONE1-M0。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)多個(gè)標(biāo)記物表達(dá)，分析THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞極化方向。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞CD14、CD68、CD86、CD163、CD206表達(dá) 胞外流式抗體的檢測(cè)：PBS沖洗，消化細(xì)胞，25 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清，用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，制成終濃度為1×106～10×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，加入抗體，室溫避光孵育30 min，染色緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞，過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

胞內(nèi)流式抗體的檢測(cè)：制備單細(xì)胞懸液后，固定液和破膜緩沖液固定細(xì)胞破膜30～90 min，破膜液洗滌，加入蛋白抗體，室溫避光孵育30 min，破膜液洗滌，細(xì)胞染色緩沖液重懸，過(guò)濾細(xì)胞后上機(jī)，分別檢測(cè)CD14、CD68、CD86、CD163和CD206陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.7 RT-qPCR法檢測(cè)IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α表達(dá) 用Trizol 裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，用QuantStudioTM6 Real time-PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法計(jì)算IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，若滿員方差齊，則兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo_V10分析。

2 結(jié)果

2.1 PMA 濃度對(duì)THP-1 細(xì)胞貼壁情況和細(xì)胞形態(tài)的影響 用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L PMA刺激THP-1細(xì)胞后，多數(shù)呈圓形透亮、大小均一的懸浮細(xì)胞，逐漸貼壁，細(xì)胞形態(tài)近似分為3 種：長(zhǎng)梭形且突起明顯的細(xì)胞、中心稍暗的近圓形細(xì)胞、不規(guī)則多觸角形細(xì)胞；100 nmol/L PMA 刺激的已貼壁THP-1細(xì)胞的形態(tài)變化明顯，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞伸出多個(gè)偽足和突起，核碎裂、核空泡細(xì)胞數(shù)目少于200 nmol/L 組，見(jiàn)圖1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇100 nmol/L作為PMA的最佳刺激濃度。

圖1 THP-1細(xì)胞形態(tài)圖

2.2 巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá) 與THP-1 組比較，THP-1-M0 組CD68、CD86 表達(dá)升高（均P＜0.05），THP-1-M1 組CD68、CD86、CD163 表達(dá)升高（均P＜0.05），THP-1-M2 組CD14 表達(dá)降低（P＜0.05），CD68、CD86、CD163 和CD206 表達(dá)升高（均P＜0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表2 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況，n=3

表2 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況，n=3

與THP-1組比較，*P＜0.05。

圖2 CD14、CD68、CD86、CD163和CD206在不同巨噬細(xì)胞亞型中的表達(dá)

2.3 M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá) 與THP-1 組比較，THP-1-M0 組IL-10、TGF-β1表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），THP-1-M1 組IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），THP-1-M2組IL-10、TGF-β1表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 M1型和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，n=3

表3 M1型和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，n=3

與THP-1組比較，*P＜0.05。

2.4 鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)THP-1源M0細(xì)胞極化方向的影響 與M0 組比較，5-8F-M0 組、HONE1-M0組TNF-α、TGF-β1表達(dá)降低，IL-10表達(dá)升高，HONE1-M0組IL-6表達(dá)升高（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理后的THP-1-M0基因表達(dá)水平，n=3

表4 鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理后的THP-1-M0基因表達(dá)水平，n=3

與M0組比較，*P＜0.05。

3 討論

巨噬細(xì)胞在腫瘤免疫治療中起著重要的作用，但人源巨噬細(xì)胞多用作體外的原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存、大量傳代。因此，體外建立活化的巨噬細(xì)胞模型對(duì)于巨噬細(xì)胞各亞型的功能研究有重要意義。人源THP-1 細(xì)胞系作為體外巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)模型之一，常用來(lái)研究炎癥相關(guān)巨噬細(xì)胞亞型的功能，THP-1 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和分化特征上與原代巨噬細(xì)胞相似，低密度的PMA 即可誘導(dǎo)其貼壁分化[10]。以THP-1 細(xì)胞作為研究單核巨噬細(xì)胞極化模型的另一優(yōu)勢(shì)為，THP-1細(xì)胞遺傳同質(zhì)性高，可在體外傳代培養(yǎng)幾十代的同時(shí)維持細(xì)胞活力，細(xì)胞間的變異程度低[11]。本課題組采用THP-1細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)模型，是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的良好模型。

巨噬細(xì)胞被招募到腫瘤微環(huán)境后，具有極強(qiáng)的異質(zhì)性和可塑性，其免疫學(xué)特征常根據(jù)微環(huán)境中釋放的細(xì)胞因子而改變[12]。TAMs 主要分為M1 型和M2 型，當(dāng)組織或器官受到病原體感染時(shí)，M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，釋放TNF-α、IL-1β、IL-12等促炎因子，激活T細(xì)胞，產(chǎn)生Th1型細(xì)胞毒性反應(yīng)，還可在LPS 和IFN-γ 的刺激下高表達(dá)CD68、CD86等共刺激分子，并產(chǎn)生IL-6等MHCⅡ類分子，參與炎癥反應(yīng)和外來(lái)病原體的清除，抑制腫瘤的進(jìn)展。另一種類型為粒細(xì)胞或Th2 型細(xì)胞分泌的IL-4、IL-13 刺激而成的CD163+、CD206+M2 型巨噬細(xì)胞，高表達(dá)IL-10、TGF-β、VEGF、MMP9、TGFB1 和PLA2G7等細(xì)胞因子，抑制炎癥的進(jìn)展，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑血管生成[13-16]。本課題組構(gòu)建的體外巨噬細(xì)胞模型采用相對(duì)特異性標(biāo)記物CD163、CD206 對(duì)THP-1-M2進(jìn)行標(biāo)記，兩種表面蛋白在IL-4和IL-13的作用下均升高；另一方面，THP-1-M0組中單核巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68、CD86 表達(dá)量在加入LPS 和IFN-γ孵育后均升高，表明成功將M0型巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞。

在探討鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響時(shí)，以本課題組建立的巨噬細(xì)胞體外模型為基礎(chǔ)，向THP-1-M0 組中分別加入5-8F 條件培養(yǎng)基和HONE1條件培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，5-8F條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的M0 型巨噬細(xì)胞，促炎基因TNF-α表達(dá)下調(diào)，抑炎基因IL-10上調(diào)，表明5-8F條件培養(yǎng)基主要刺激M0 型巨噬細(xì)胞向M2 表型極化；而HONE1細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)M0細(xì)胞后IL-6、IL-10同時(shí)升高，提示可刺激部分M1 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。5-8F-M0 和HONE1-M0 這兩組中TGF-β1表達(dá)均降低，可能是因?yàn)門(mén)GF-β家族主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制功能，當(dāng)加入腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基后，巨噬細(xì)胞各亞型的免疫功能均受到限制。基于兩種鼻咽癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)M0 極化方向的差異結(jié)果，本課題組考慮可能與細(xì)胞的生物學(xué)特性相關(guān)。5-8F細(xì)胞是從SUNE-1鼻咽癌細(xì)胞株體外優(yōu)化篩選出的具有高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌低分化鱗狀細(xì)胞癌亞株，高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能是否與其對(duì)周圍環(huán)境中巨噬細(xì)胞的M2 型極化作用相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。