高智華，趙勁民

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧 530021）

靜電紡絲分為普通電紡和熔融電紡，是一種簡(jiǎn)單而高效的制造工藝。其中普通電紡具有可控性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，制得的納米纖維膜不僅直徑小、纖維分布均勻，更重要的是比表面積大、孔隙率高，在組織工程、固定化酶催化、傷口敷料、超細(xì)濾膜和防護(hù)織物等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-2]。研究表明，靜電紡絲納米纖維的直徑大小對(duì)細(xì)胞的黏附和增殖具有重要影響。在大尺寸、微米級(jí)尺寸和納米級(jí)尺寸的纖維支架中，細(xì)胞分別主要分布在孔洞之中、單根纖維上以及多根纖維之間，不同直徑大小的纖維對(duì)細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用。例如，微米級(jí)和納米級(jí)纖維可以促進(jìn)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖，而后者對(duì)平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等影響不大[3-4]。

聚己內(nèi)酯（PCL）經(jīng)由美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)認(rèn)證，在組織工程領(lǐng)域中是最常用的高分子材料之一，具有良好的生物相容性和生物降解性。目前缺乏對(duì)不同濃度PCL 在不同紡絲電壓和距離的條件下所制備的納米纖維膜的性能對(duì)比研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，以材料濃度、紡絲電壓、紡絲距離為參考變量對(duì)納米纖維膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物活性作了較深研究[5-6]。通過改變紡絲電壓和紡絲距離，制備出了不同濃度的PCL 納米纖維膜，利用掃描電鏡和力學(xué)儀器分析對(duì)比，探討不同參數(shù)對(duì)靜電紡絲膜的微觀形態(tài)、直徑大小和力學(xué)性能的影響；此外，將乳兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）培養(yǎng)于電紡納米纖維膜表面，觀察細(xì)胞生長狀況。本實(shí)驗(yàn)為PCL 納米纖維膜在骨軟骨缺損修復(fù)組織工程領(lǐng)域的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 出生3 d 的新西蘭白兔1 只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。PCL 購自西格瑪奧德里奇公司（中國上海）；六氟異丙醇購自麥克林公司（中國長沙）；α-低糖培養(yǎng)基（α-DMEM）購自Gibco 公司（美國）；胎牛血清購自VWR 公司（澳大利亞）；青－鏈霉素、胰蛋白酶和PBS 緩沖液均購自索萊寶公司（中國北京）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自Dojindo 公司（日本）；Calcein-AM/PI染色試劑盒購自Invitrogen公司（美國）。

1.2 主要儀器 靜電紡絲機(jī)購自能環(huán)新材料科技有限公司（中國蘇州）；磁力攪拌器購自KEW-LAB公司（澳大利亞）；力學(xué)測(cè)試儀購自NSTRON 公司（美國）；電子精密天平購自TOLEDO 公司（瑞士）；全波長酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher公司（澳大利亞）；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司（美國）；超凈工作臺(tái)購自海爾公司（中國青島）；倒置相差顯微鏡購自O(shè)LYMPUS 公司（日本）；掃描電子顯微鏡購自VEGA3LMU 公司（美國）；真空干燥箱購自龍伍機(jī)械有限公司（中國南京）；超聲波清洗機(jī)購自新芝生物科技股份有限公司（中國寧波）。

1.3 納米纖維膜的制備與分組 用電子精密天平準(zhǔn)確稱取不同重量的PCL 顆粒，溶于5 mL 六氟異丙醇溶液中，配制6%PCL、8%PCL、10%PCL 3 種不同濃度的紡絲前溶液，超聲15 min 混勻，磁力攪拌器攪拌，超聲30 min混勻。通過靜電紡絲機(jī)制備出3 組納米纖維膜，分別為6%PCL 組、8%PCL 組、10%PCL組。

研究不同紡絲電壓時(shí)，選定8%PCL電紡溶液，將紡絲電壓設(shè)置為5 kV、15 kV、25 kV，其他參數(shù)不變，制備3組納米纖維膜，分別為8%PCL+5 kV組、8%PCL+15 kV組、8%PCL+25 kV組。

將紡絲距離設(shè)置為10 cm、15 cm和20 cm，其他參數(shù)不變，制備3 組納米纖維膜，分別為8% PCL+10 cm組、8%PCL+15 cm組、8%PCL+20 cm組。

對(duì)照組為不放置任何納米纖維膜。進(jìn)行靜電紡絲時(shí)，嚴(yán)格控制溫度和濕度。將納米纖維膜放置在真空干燥箱中干燥24 h后備用。

1.4 靜電紡絲PCL 納米纖維膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的檢測(cè) 將不同參數(shù)下獲得的PCL 電紡納米纖維膜裁剪為10 mm×10 mm的矩形，噴金后干燥2 h，置于掃描電鏡（SEM）下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和直徑，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，同一樣本選擇3 種不同倍數(shù)的視野進(jìn)行觀察。

打開力學(xué)測(cè)定儀，將每種電紡納米纖維膜裁剪為20 mm×20 mm 的矩形，每個(gè)樣本準(zhǔn)備5 個(gè)待用。首先用游標(biāo)卡尺測(cè)量膜的厚度并輸入儀器電腦軟件，設(shè)置初始距離為1 cm，拉伸速率為6 mm/min，調(diào)整好角度，測(cè)量拉伸應(yīng)力、拉伸應(yīng)變和楊氏模量。

1.5 兔BMSCs 的提取和培養(yǎng) 取出生3 d 的新西蘭白兔，剃毛，注射3%戊巴比妥鈉麻醉，浸泡在75%酒精中滅菌，在相對(duì)無菌條件下剪下乳兔的四肢，去除皮膚和部分肌肉，放在含5%青－鏈霉素的PBS緩沖液中，蓋好培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)。用PBS 反復(fù)清洗，無菌紗布將肌肉組織剔除，同時(shí)剪去兩端的軟骨，最后利用注射器沖出骨髓。將含有BMSCs的培養(yǎng)皿置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，每3 d換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿后將其取出，轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)中吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化5 min，再加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞備用。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性 裁剪不同參數(shù)下制備的PCL電紡納米纖維膜，輕輕放置在24 孔板中，上面放置銅環(huán)壓住（已高壓消毒）防止膜上浮，巴氏管吸取適量75%酒精到孔板中浸泡6 h，在通風(fēng)的紫外燈櫥下滅菌12 h。將兔BMSCs 以3×105的密度種于24 孔板中，3 d 后取出孔板，吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗3次，避光加入25 μL CCK-8 和250 μL培養(yǎng)液，孵育2 h。用全波長酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。

1.7 活死細(xì)胞檢測(cè) 將兔BMSCs 培養(yǎng)在不同參數(shù)下制備的納米纖維膜上3 d，PBS清洗3次，按照Calcein-AM PI 活死細(xì)胞雙染試劑盒說明書，避光加入活死細(xì)胞染色液，孵育25 min后吸去染色液。熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，觀察活細(xì)胞（呈綠色）的數(shù)量，拍照。用Image J 軟件計(jì)算活細(xì)胞所占面積?；罴?xì)胞所占面積=活細(xì)胞總數(shù)面積/拍照視野面積×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紡絲材料濃度對(duì)纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 當(dāng)PCL濃度為6%時(shí)，電鏡下觀察到纖維表面出現(xiàn)較多的串珠，纖維分布雜亂，當(dāng)PCL 濃度為8%和10%時(shí)，串珠消失，纖維均勻分布，見圖1。當(dāng)紡絲電壓為15 kV或紡絲距離為15 cm時(shí)，納米纖維的直徑最小，分布均勻，孔隙率較大，見圖2、圖3。

圖1 不同材料濃度的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

圖2 不同施加電壓的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

圖3 不同接收距離的PCL 電紡納米纖維膜的SEM圖

2.2 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對(duì)纖維膜機(jī)械性能的影響 當(dāng)濃度為變量時(shí)，與6%PCL 組和10%PCL 組比較，8%PCL 組的拉伸應(yīng)力和楊氏模量提高；當(dāng)紡絲電壓為變量時(shí)，與8%PCL+5 kV組和8%PCL+25 kV組比較，8%PCL+15 kV組的拉伸應(yīng)力和楊氏模量提高；當(dāng)紡絲距離為變量時(shí)，與8% PCL+10 cm 組和8% PCL+20 cm 組比較，8%PCL+15 cm組的拉伸應(yīng)力和楊氏模量提高，見圖4。

圖4 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對(duì)纖維膜機(jī)械性能的影響

2.3 不同溶液濃度、施加電壓和接收距離對(duì)負(fù)載兔BMSCs 納米纖維膜細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，8% PCL 組、8% PCL+15 kV 組、8% PCL+15 cm組細(xì)胞增殖活性和活細(xì)胞所占面積升高最明顯（均P＜0.05）；不同濃度、不同施加電壓和不同接收距離的PCL納米纖維膜均可促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長且培養(yǎng)于膜上的細(xì)胞活性均優(yōu)于對(duì)照組（均P＜0.05），見圖5、圖6。

圖5 負(fù)載兔BMSCs的不同參數(shù)的PCL電紡納米纖維膜的CCK-8檢測(cè)結(jié)果

圖6 負(fù)載兔BMSCs 的不同參數(shù)的PCL 電紡納米纖維膜的活死細(xì)胞染色結(jié)果

3 討論

本研究探討了靜電紡絲過程中不同工藝參數(shù)對(duì)PCL納米纖維膜結(jié)構(gòu)形態(tài)和細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明，不同的溶液濃度、紡絲電壓、紡絲距離對(duì)納米纖維膜的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能以及生物相容性均有影響。

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)紡絲濃度較小時(shí)，紡絲前溶液的黏度也相對(duì)較小，致使聚合物分子鏈之間纏結(jié)機(jī)會(huì)較少，在纖維表面形成串珠。逐漸加大紡絲濃度可以改善納米纖維的形態(tài)[7]。當(dāng)濃度相同時(shí)，隨著電壓升高，納米纖維膜的力學(xué)性能及細(xì)胞活性先升高后降低（P＜0.05）。這是因?yàn)?，隨著電壓升高，電場(chǎng)強(qiáng)度也隨之升高，對(duì)噴射出的溶液牽拉作用增強(qiáng)，導(dǎo)致納米纖維直徑減小，此時(shí)，納米纖維膜的孔隙率較高，更有利于細(xì)胞生長，同時(shí)，納米纖維之間接觸點(diǎn)增多，提高了纖維膜的力學(xué)性能[8]。當(dāng)電壓強(qiáng)度過高時(shí)，射流迅速到達(dá)接收板上，沒有得到充分地牽拉，此時(shí)，纖維直徑增大，纖維膜的力學(xué)性能和生物活性均下降[9-10]。在同一濃度下，隨著紡絲距離的增加，納米纖維膜的機(jī)械性能及細(xì)胞活性先升高后降低（P＜0.05）。這是因?yàn)楫?dāng)紡絲距離較小時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度較大，對(duì)噴射出的溶液牽拉作用較強(qiáng)，當(dāng)作用時(shí)間較短，因牽拉不充分導(dǎo)致纖維直徑較大；隨著紡絲距離增加，電場(chǎng)強(qiáng)度略微減小，同時(shí)牽拉作用時(shí)間延長，此時(shí)射流牽拉充分因而纖維直徑減小，納米纖維膜的孔隙率較高，更有利于細(xì)胞生長，同時(shí)，納米纖維之間接觸點(diǎn)增多，提高了纖維膜的力學(xué)性能。當(dāng)接收距離過大時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度微弱，即使有較長的作用時(shí)間，射流也無法得到充分地牽拉，導(dǎo)致纖維直徑增大，纖維膜的力學(xué)性能和生物活性均下降[11]。

綜上所述，不同的紡絲濃度、紡絲電壓、紡絲距離可以改變PCL納米纖維膜的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物相容性。