王強龍 張同享 高澤川 王立斌 余四九 潘陽陽

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070）

地西泮結(jié)合抑制因子(Diazepam binding inhibitor,DBI)在細胞內(nèi)負責?；o酶A 的轉(zhuǎn)運和儲存，進而調(diào)節(jié)脂肪酸的合成與代謝，因此又稱為?；o酶A 結(jié)合蛋白(Acyl-CoA binding protain, ACBP)(Rosendalet al., 1993)。在人體中，DBI 是Acyl-CoA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(acyl-CoA-binding domain-containing, ACBD) 家族中6 個成員之一(Augoffet al.,2010)。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸的生物合成過程中形成的許多信號分子參與乳腺發(fā)育調(diào)控(Menget al.,2017)。該蛋白在細胞質(zhì)和細胞核均可表達，廣泛發(fā)揮生物學作用。目前發(fā)現(xiàn)，DBI的同源基因廣泛存在于動物界、植物界、真菌界和原生物界(Burtonet al.,2005)。其作為高度保守蛋白，是由87個氨基酸殘基組成的多肽，存在于真核生物和原核生物中，主要參與脂肪酸代謝(Faergemanet al.,1996)，為細胞的生命活動提供重要的能源物質(zhì)，保障細胞的正常生長。研究發(fā)現(xiàn)，DBI在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、垂體前葉、腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、肝臟、胸腺和睪丸中高表達(Bürgiet al., 1999)，但關(guān)于牦牛乳腺DBI基因的研究未見報道。牦牛(Bos grunniens) 是分布于青藏高原及其毗鄰地區(qū)的特有種，能夠適應(yīng)高寒低氧的惡劣環(huán)境(Yuet al.,2010)，是當?shù)啬撩裰匾纳畋Ｕ虾徒?jīng)濟來源。乳腺被認為是一個“脂類合成機器”，其發(fā)育受到遺傳、激素和環(huán)境的多重影響，營養(yǎng)物質(zhì)對乳腺發(fā)育也具有調(diào)控作用(Farmer,2013;Wooet al.,2016)。本文以牦牛不同發(fā)育時期的乳腺組織為研究對象，對DBI基因編碼區(qū)進行克隆和生物信息學分析，采用qPCR、WB 和IHC 等實驗技術(shù)檢測DBI的表達情況，確定其是否參與牦牛的乳腺發(fā)育過程，研究結(jié)果為進一步了解DBI基因功能提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 實驗方法

在甘肅省臨夏市定點屠宰場采集3頭健康牦牛不同時期(泌乳前期、泌乳期、干乳期) 的乳腺組織，乳腺組織分期參考崔英俊和李慶章(2014)。置于含雙抗(青霉素、鏈霉素)的37℃無菌生理鹽水中，經(jīng)過清洗，選擇組織，部分置于液氮罐中，部分用4%的多聚甲醛固定，帶回實驗室。

參照動物組織RNA 提取試劑盒提取牦牛不同時期乳腺組織的總RNA，通過Go ScriptTMReverse Transcription System (Promega) 合成cDNA，利用普通PCR 儀(艾本德公司，德國) 驗證長鏈DBI克隆引物和短鏈qPCR 引物，使用pMDTM18-T Vector Cloning Kit 試劑盒構(gòu)建載體，導(dǎo)入DH5α 感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素(ampicillin,Amp)抗性的固體培養(yǎng)基進行藍白斑篩選陽性菌，送生物公司測序，并使用在線軟件分析DBI 的結(jié)構(gòu)特征、理化性質(zhì)。借助熒光定量PCR 儀檢測DBImRNA 的相對表達差異；乳腺組織蛋白樣品與4×蛋白上樣Buffe混合后做變性處理，對樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗(DBI: ab232760)，普通二抗(bs-0294D)孵育，ECL 化學發(fā)光液在暗室處理2 min，進行曝光檢測DBI 蛋白的表達情況。其他試劑均為國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.2 引物設(shè)計與驗證

參照GenBank 中牛的DBI基因序列，應(yīng)用Primer premier5 分別設(shè)計克隆引物(DBI-F1/R1) 和qPCR驗證引物(DBI-F2/R2)(黃成渝，2020)，引物由上海生工生物公司合成(表1)。以牦牛不同發(fā)育時期乳腺cDNA 為模板進行引物驗證，體系為20 μL：cDNA 1μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq PCR mix 10 μL，free water 8 μL；反應(yīng)條件：95℃3 min，95℃30 s，52.5℃30 s，72℃16 s，35 個循 環(huán)，72℃5 min，4℃保存；反應(yīng)結(jié)束，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物驗證。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 乳腺總RNA的提取和cDNA的合成

按照TransZol 操作說明提取牦牛乳腺組織總RNA(表2)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用紫外分光光度計檢測RNA 提取質(zhì)量及完整性，OD260 nm/ OD280 nm 值控制在1.8 ～2.0。再參照兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeTMRT Reagent Kit說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 乳腺組織RNA的質(zhì)量Table 2 RNA quality in mammary tissue

1.4 牦牛DBI基因的克隆和測序

以牦牛乳腺cDNA 為模板進行DBI基因的擴增，體系為20 μL：cDNA 1μL，上、下游引物各0.5 μL，Taq PCR mix 10 μL，free water 8 μL；PCR反應(yīng)條件：95℃3 min，95℃30 s，52.5℃30 s，72℃16 s，35 個循環(huán)，72℃10 min，4℃保存；反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，用膠回收試劑盒對目的條帶回收純化，并用分光光度計測定回收產(chǎn)物的濃度。將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T 載體成功連接之后，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，于37℃恒溫箱震蕩培養(yǎng)2 h，吸取150 μL涂于LB固體培養(yǎng)基(氨芐抗性)，經(jīng)37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)藍白斑篩選，挑取白斑陽性克隆菌落，迅速接種于LB液體培養(yǎng)基(氨芐抗性)，置于37℃恒溫箱震蕩培養(yǎng)12 h，吸取100 μL菌液送上海生工公司進行測序。

1.5 DBI基因生物信息學分析

利用在線軟件ORF finder 進行開放閱讀框分析；利用在線軟件BLAST 進行不同物種間DBI基因比對，分析同源性，并通過MEGA 7.0根據(jù)氨基酸序列的統(tǒng)計學特征構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用Ex-PASy-Protparam、Protscale、IBCP、Phyre2 分別分析牦牛DBI基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)。

1.6 qPCR檢測DBI基因的相對表達量

qPCR 反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，上、下游 引 物 各0.5 μL，SYBR Premix Dimer EraserTM(2×)10 μL，F(xiàn)ree water 8 μL。程序為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸16 s，35個循環(huán)，樣品重復(fù)4次。每個模板以β-actin為內(nèi)參作為對照。程序運行結(jié)束后，保存循環(huán)閾值(Ct)，采用2-ΔΔCt方法進行相對表達量分析。

1.7 Western-blot檢測DBI分子在乳腺中的表達

將不同時期牦牛乳腺組織進行快速冷凍研磨，取110 mg組織樣加入1 mL RIPA蛋白裂解液(PMSF終濃度1 mmol/L)，置于冰盒內(nèi)充分反應(yīng)3 h，放入超速離心機，4℃12 000 r/min離心10 min。蛋白上樣緩沖液與蛋白上清液按1∶3混合，變性(100℃，10 min)，冷卻5 min，操作完成后，樣品置于-20℃保存。

分別制備蛋白分離膠(15%)、濃縮膠(5%)，進行SDS-PAGE檢測，電泳結(jié)束后，再通過轉(zhuǎn)膜儀完成轉(zhuǎn)膜操作，用PBST 洗去膜上殘留的轉(zhuǎn)膜液，5%的脫脂牛奶進行封閉，室溫封閉3 h ，加入DBI抗體(1∶3 000稀釋)4℃孵育過夜，再用PBST清洗5 次，每次5 min，加入二抗Goat Anti-rabbit IgG (1∶5 000 稀釋)，37℃搖床孵育50 min，完成之后用PBST 沖洗6 次，每次10 min。之后在PVDF 膜上滴加電化學發(fā)光液，避光孵育2 min，使用化學發(fā)光儀進行檢測，最后利用軟件Image J對目的條帶灰度值進行分析。

1.8 IHC檢測DBI分子在乳腺的分布情況

將固定于福爾馬林溶液的乳腺樣品制作成石蠟切片，按組織化學染色方法進行抗原修復(fù)，一抗、二抗孵育，滴加DAB 染色劑顯色，蒸餾水終止，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，最后鏡檢拍照。

1.9 數(shù)據(jù)處理與圖像分析

數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析和顯著性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。Graphpad prism 8 繪制數(shù)據(jù)圖，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 牦牛DBI基因的擴增、測序

對提取的不同時期乳腺組織RNA 進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖1)，以DBI-F1、DBI-R1為引物對DBI基因進行擴增，得到516 bp 的基因片段(圖2)，大小符合預(yù)期，對其進行克隆，送上海生工生物公司測序。

圖1 不同時期牦牛乳腺組織RNA提取膠圖Fig. 1 Gel image of RNA extraction from yak mammary gland tissue in different periods

圖2 牦牛DBI 基因克隆結(jié)果. M：2 000 bp marker；1：DBI 基因擴增片段Fig. 2 Cloning results of yak DBI gene. M:2 000 bp marker;1:DBI gene amplified fragment

2.2 DBI生物信息學分析

將DBI基因序列提交到GenBank (登陸號：MW086940)，與其他物種進行比較，發(fā)現(xiàn)牦牛DBI 氨基酸序列與牛(Bos taurus)、綿羊(Ovis aries)、狷羚(Bubalus bubalis)、火狐(Chlorocebus sabaeus)、人(Homo sapiens)、家犬(Canis lupus familiaris)、野豬(Sus scrofa) 和雪貂(Mustela putori-us furo) 的一致性分別為99.62%、98.48%、98.86%、90.84%、93.94%、90.91%、92.80%和90.53%。

基于同源性分析對DBI基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)牦牛DBI氨基酸序列在生物進化過程中比較保守，與之前的研究結(jié)果基本一致(盛丹等，2018)，其與普通牛、綿羊和狷羚之間同源性較高，與火狐、人、家犬、野豬和雪貂同源性較低。

圖3 牦牛DBI基因的進化樹Fig. 3 Evolution tree of DBI gene of yak

2.3 牦牛DBI基因理化性質(zhì)分析

DBI蛋白分子式為C447H699N115O135S4，原子總數(shù)1 400，分子量為10 kD，理論等電點為6.73。在編碼蛋白質(zhì)的87 個氨基酸中，Lys 含量最高為17.2%，且該蛋白不含Cys、吡咯賴氨酸(Pyl) 和硒半胱氨酸(Sec)，其中帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu) 為16，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg +Lys) 為16。在280 nm 的水中，DBI 的消光系數(shù)為16 960 L/mol·cm(在假設(shè)所有半胱氨酸殘基對形成胱氨酸的條件下)。DBI 蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別為大于20 h和10 h。DBI蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為24.81，屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)60.69，親水性(肉汁)的總平均值為-0.867。

2.4 DBI的二級、三級結(jié)構(gòu)特征

應(yīng)用在線軟件IBCP 預(yù)測DBI 蛋白二級結(jié)構(gòu)(圖4)，結(jié)果表明：該蛋白主要由3 種折疊方式構(gòu)成，44 個α-螺旋占比50.57%，6 個延伸鏈占比6.90%，37 個無規(guī)卷曲占比42.53%。由此可以推測，α-螺旋、無規(guī)卷曲及延伸鏈3種結(jié)構(gòu)是DBI蛋白二級結(jié)構(gòu)的主體。應(yīng)用在線軟件Phyre2 預(yù)測DBI 蛋白三級結(jié)構(gòu)，4 個α-螺旋結(jié)構(gòu)圍成?；o酶A 結(jié)合口袋(圖5)，包括1 個DBI 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)為DBI超家族成員特有。

圖4 牦牛DBI蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig. 4 Secondary structure of yak DBI protein

圖5 牦牛DBI蛋白三級結(jié)構(gòu). A：α-螺旋；B：無規(guī)卷曲Fig. 5 Tertiary structure of yak DBI protein. A: alpha helix; B: random coil

2.5 qPCR短鏈引物的驗證

普通PCR短鏈擴增產(chǎn)物大小符合預(yù)期，DBI為124 bp，β-actin為129 bp(圖6)，且條帶特異性良好，可用于后續(xù)DBIqPCR實驗。

圖6 牦牛DBI基因短鏈引物驗證結(jié)果. M：2 000 bp marker；1：β-actin；2：泌乳前期；3：泌乳期；4：干乳期Fig. 6 Validation results of short-chain primers of yak DBI gene. M:2 000 bp marker; 1: β-actin; 2: Early lactation; 3: Lactation period; 4:Dried milk period

2.6 DBI mRNA在乳腺中的表達量

qPCR 數(shù)據(jù)顯示：DBI在不同發(fā)育時期乳腺組織中均有表達，泌乳前期表達量最高(P=0.005 723)，干乳期次之，泌乳期表達量最低(P=0.026 418)。

2.7 DBI分子在乳腺中的表達

WB 結(jié)果顯示，DBI 分子在牦牛不同發(fā)育時期乳腺組織中均有表達(圖7)，泌乳前期表達量最高(P=0.000 010)，干乳期次之，泌乳期表達量最低(P=0.000 183)。

圖7 DBI 蛋白在牦牛不同時期乳腺中的表達. 1：泌乳前期；2：泌乳期；3：干乳期Fig. 7 Expression of DBI protein in mammary of yaks at different stages. 1:Early lactation;2:Lactation period;3:Dried milk period

2.8 DBI蛋白在牦牛不同時期乳腺中的定位

IHC檢測DBI分子在牦牛不同發(fā)育時期的乳腺組織中的表達情況，圖中棕色部分為DBI 的陽性表達，藍色部分為陰性。DBI主要表達于乳腺腺泡上皮細胞、導(dǎo)管上皮細胞、小葉間質(zhì)細胞，在脂肪細胞中表達很弱或不表達(圖8)。

圖8 DBI 蛋白在牦牛不同時期乳腺中的分布情況. A ～D 為免疫組織化學染色；A ～C：陽性表達；D：陰性對照；A：泌乳前期；B：泌乳期；C：干乳期；EE：乳腺上皮細胞；DE：導(dǎo)管上皮細胞；IS：小葉間基質(zhì)；AT：脂肪組織(400×)Fig. 8 Distribution of DBI protein in mammary gland of yaks in different periods. A- D: Immunohistochemical staining;A- C: Positive expression; D: Negative control;A: Early lactation; B: Lactation period; C: Dried milk period; EE: Mammary epithelial cells; DE: Ductal epithelial cells;IS:Interlobular stroma;AT:Adipose tissue(400×)

3 討論

DBI 最先由Guidotti 等從鼠腦組織中分離純化獲得，后相繼從人、牛、豬、非洲爪蟾和酵母中分離到(李林春等，2010)。DBI是脂肪酸的一種活化形式(Vincenzoet al., 2003)，能夠負責轉(zhuǎn)運Acyl-CoA 的胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白，在脂肪酸代謝中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，DBI在胎盤滋養(yǎng)細胞中廣泛表達，能夠影響滋養(yǎng)細胞的增殖，通過影響類固醇激素合成酶的表達影響滋養(yǎng)細胞合成類固醇激素，與妊娠維持具有潛在關(guān)系(黃成渝，2020)。本研究獲得DBI基因克隆序列全長516 bp，其中編碼區(qū)為264 bp，與盛丹等(2018) 克隆檳榔江水牛(Bos bubalus)DBI基因結(jié)果一致，比李林春等(2010) 克隆青鳉魚(Oryzias latipes)DBI編碼區(qū)少6個堿基，該基因編碼87個氨基酸，蛋白相對分子量為10 kDa，理論等電點為6.73。蛋白性質(zhì)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，牦牛DBI 分子為穩(wěn)定的親水性蛋白，4 個α-螺旋結(jié)構(gòu)圍成?；o酶A 結(jié)合口袋；其基因同源性與普通牛最近，高達99.62%。不同物種間序列比對發(fā)現(xiàn)，DBI基因在生物進化過程中高度保守，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹也發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛、綿羊和狷羚之間同源性很高，表明牦牛DBI基因與其他物種的功能高度一致。

DBI基因在不同類型的組織中表達量有明顯不同，其在代謝活性高的組織中高表達，如肝臟、脂肪組織、皮膚和外分泌腺等(Gallegoet al.,2018)。有研究發(fā)現(xiàn)DBI在水牛的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、小腸、垂體、大腦、肌肉中均表達，且差異明顯(盛丹等，2018)。本研究中，DBI基因在泌乳前期乳腺組織的表達量顯著高于泌乳期和干乳期，與DBI分子的表達一致。DBI基因與蛋白均在泌乳前期高表達，說明該基因參與乳腺發(fā)育。對DBI進行定位研究，已發(fā)現(xiàn)該因子在BeWo 細胞中表達，且影響其增殖能力(黃成渝，2020)，本文結(jié)果顯示：DBI主要在乳腺腺泡上皮細胞、導(dǎo)管上皮細胞、小葉間質(zhì)細胞中高表達，在脂肪細胞中表達較弱。乳腺是生成乳汁的場所，而乳脂是乳汁的主要成分，乳腺組織在泌乳前期需要充分發(fā)育，為泌乳做好充足的準備(McNallyet al.,2017)。脂肪酸調(diào)控乳腺發(fā)育的機制包括兩條途徑：一是通過脂肪酸受體及胞內(nèi)信號通路直接調(diào)控；二是通過調(diào)控相關(guān)激素的分泌間接影響乳腺發(fā)育。動物體內(nèi)激素含量的變化能夠引起動物在不同生理時期乳腺細胞的分化、退化及乳腺細胞總數(shù)的變化(Lecomteet al., 2017; Chiet al., 2019; Treecket al., 2019)。泌乳前期乳腺導(dǎo)管的發(fā)育(Planteet al.,2011)主要是卵巢和胎盤分泌的雌激素作用的結(jié)果。卵巢產(chǎn)生的雌激素和孕酮是引起乳腺發(fā)育的重要因素(Derooet al., 2009; Hiltonet al.,2018)。泌乳前期由于雌激素與孕酮的雙重作用，乳腺充分發(fā)育，尤其到了妊娠的中后期，雌激素和孕酮的分泌同時增加(Bagotet al., 2019)，對乳腺組織持續(xù)發(fā)揮促進作用，促使乳腺小葉—腺泡高度發(fā)育(Hurleyet al.,2019)。雌激素含量在生理水平升高可促進乳腺發(fā)育，但過高會抑制乳腺發(fā)育(Yanget al., 2020)。糖皮質(zhì)激素對乳腺發(fā)育和泌乳也有重要的調(diào)節(jié)作用。雌激素、孕酮和糖皮質(zhì)激素都屬于類固醇激素(Morelet al., 2016)，DBI能夠參與調(diào)節(jié)類固醇激素生物合成與代謝(Papadopouloset al.,1991)。這也印證了本研究結(jié)果，進一步說明DBI 在泌乳前期的高表達與乳腺發(fā)育具有內(nèi)在聯(lián)系。

乳腺組織中合成和分泌乳汁的腺泡結(jié)構(gòu)在泌乳早期已經(jīng)發(fā)育成熟(Akerset al., 2006)。脂肪酸是乳腺組織的一種重要營養(yǎng)素，其對乳腺上皮細胞的生長增殖具有一定的抑制作用。泌乳期乳腺組織DBI mRNA 表達量下降，脂肪酸合成減少，對上皮細胞的增殖、分化和生理功能的抑制作用降低，這將更有利于泌乳。研究表明，泌乳期奶牛乳腺上皮細胞中，DBI在細胞內(nèi)?；o酶A的運輸過程中具有特殊作用(Massimoet al.,2008)，奶牛乳腺上皮細胞增殖速率先上升再下降。而本研究中DBI 在泌乳期的降低是不是與上皮細胞的增值速率升高存在某種內(nèi)在聯(lián)系，還需做進一步的探索。干乳期是奶牛飼養(yǎng)管理的一個關(guān)鍵時期(Hoeijet al., 2016; Fujiwaraet al., 2019)。實踐證明，奶牛的泌乳期長達305 d 左右(Saowaphaket al., 2017; Sehestedet al., 2019)，母體經(jīng)過長期的泌乳及妊娠，機體就像一個晝夜不停高效運作的“加工廠”，需要短期的調(diào)理和緩沖過程。此外，妊娠后期胎兒的快速生長發(fā)育，需要母體提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)滿足其生長需求(Smithet al.,2017)，母牛必須停止擠奶，進入干乳期?？茖W合理的干乳期可以保證胎兒的正常發(fā)育，乳腺組織的休整重建(Weberet al.,2015;Koket al.,2019)，有利于機體儲備大量的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅可以減少產(chǎn)后疾病，還能為下一個泌乳期做好準備。本研究中，牦牛干乳期乳腺組織中DBI 分子的表達與泌乳期相比有明顯的回升趨勢。由此推測，DBI可能與乳腺上皮細胞的更新存在關(guān)聯(lián)。

本研究克隆了牦牛DBI基因CDS 區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)其在牦牛泌乳前期乳腺表達量高，主要表達于乳腺腺泡上皮細胞、導(dǎo)管上皮細胞和小葉間質(zhì)細胞。由此推測，DBI與牦牛的乳腺發(fā)育存在密切聯(lián)系，為進一步研究DBI基因功能奠定理論基礎(chǔ)。