于祎 趙明星 王玉輝 張學(xué)英 徐德立* 王德華,3*

（1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，曲阜 273165）（2 中國科學(xué)院動物研究所，農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，北京 100101）（3 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266237）

免疫系統(tǒng)能防御環(huán)境中病原體如病毒、細(xì)菌、真菌等對動物的攻擊，對動物的生存發(fā)揮重要作用，是適合度的重要組分(Sheldon and Verhulst, 1996；徐德立和王德華，2012)。動物的免疫能力受多種因素如季節(jié)(張志強(qiáng)和王德華，2006;Xuet al.,2018；徐德立等，2021)、光周期(Nelson and Demas,1996)、溫度(Xuet al.,2017)、食物(Xu and Wang,2010,2011)等的影響，其中食物的數(shù)量和質(zhì)量是影響動物免疫功能的重要因素之一(陳競峰等，2007；徐德立和王德華，2015)。

營養(yǎng)不良會損害人和動物的免疫能力,這可能是由于能量和(或)營養(yǎng)成分?jǐn)z入不足引起(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004)，例如能量缺乏如禁食(Lordet al., 1998; Nakamuraet al., 2001, 2004) 或限食(Demas and Nelson, 1998;Bilbo and Nelson, 2004；徐德立和徐來祥，2015)都會抑制動物的免疫功能。同樣營養(yǎng)過剩和(或)能量攝入過多會抑制免疫能力(Calder and Kew,2002;Amaret al., 2007)，例如高脂和(或) 高糖食物會抑制大鼠的天然免疫和體液免疫(陳軼楠等，2020；葛林等，2020；徐肖元等，2020)。有關(guān)食物質(zhì)量對野生動物免疫功能影響的研究較少，例如高蛋白食物不影響長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)胸腺、脾臟濕重以及體液免疫能力(陳競峰等，2007)。因此，有必要在更多野生物種中開展食物質(zhì)量或種類在其免疫功能中作用的研究，以深化對動物食物選擇生理機(jī)制的認(rèn)識。

植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin, PHA)反應(yīng)常用來評估哺乳動物的細(xì)胞免疫能力，主要負(fù)責(zé)控制細(xì)胞內(nèi)病原體(de Bellocqet al., 2006;Zhang and Zhao, 2015)。血液中細(xì)胞種類、數(shù)量和成分的變化可用來檢測動物的免疫功能和健康狀況(張志強(qiáng)，2015;Xuet al.,2017)，例如白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞能直接參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，可指示動物的健康狀況(Calder and Kew, 2002; Xu and Hu,2020)，紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞壓積能反映動物的輸氧能力(Harikrishnanet al., 2011; Kim and Kang,2016;Fazioet al.,2016)。

黑線倉鼠(Cricetulus barabensis) 主要分布于中國北方，在蒙古國、俄羅斯和朝鮮也有分布(張知彬和王祖望，1998)，食性雜，獨居，不冬眠，具有貯食行為(趙志軍，2012; Zhaoet al., 2014)。黑線倉鼠的天然免疫、細(xì)胞和體液免疫能力與血液指標(biāo)均存在季節(jié)變化(Xuet al., 2018; Xu and Hu, 2020；徐德立等，2021)，并且與季節(jié)相關(guān)的光周期、溫度和食物數(shù)量均會影響其免疫功能(徐德立和徐來祥，2015; Xuet al., 2017; Xu and Hu,2017)，而不同繁殖狀態(tài)包括非繁殖期、妊娠期、哺乳期和斷乳期的雌性黑線倉鼠，其細(xì)胞免疫能力無差異(張志強(qiáng)等，2015)。食物的種類和數(shù)量會隨季節(jié)而變化，秋季黑線倉鼠常以農(nóng)田里的花生為食，這是因為該物種對食物的選擇偏好明顯，尤其喜食花生(王淑卿等，1992；楊玉平等，2002)。作為黑線倉鼠的喜食食物，除了適口性和味道外，是否有其他因素影響其食物選擇？在野外條件下，黑線倉鼠是否會優(yōu)先選擇有利于自身健康的食物？為探討這一問題，我們用花生飼喂黑線倉鼠，然后檢測反映健康狀況的免疫學(xué)指標(biāo)和血液指標(biāo)，并預(yù)測飼喂花生會增強(qiáng)黑線倉鼠的免疫能力。

1 研究方法

1.1 實驗設(shè)計

實驗動物為野生非繁殖期雌性黑線倉鼠，秋季捕獲于山東省曲阜市九仙山，單籠(30 cm ×15 cm×20 cm)飼養(yǎng)于光周期為12 L∶12 D、溫度為(21±1)℃的環(huán)境，自由取食和飲水，飼養(yǎng)大約2個月后體重穩(wěn)定，將30只雌鼠隨機(jī)分為正常飼料組(normal fodder group,NF,n=10)、花生加飼料組(normal fodder plus peanuts group,NP,n=10)和花生組(Peanut,n=10)。正常飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)主要含有粗脂肪4.0%、粗蛋白18.0%、粗纖維5.0%、水分10.0%、氨基酸7.7%、維生素0.01%、金屬離子4.0%，能值為14.4 kJ/g；花生主要含有脂肪44.3%、蛋白質(zhì)24.8%、碳水化合物21.7%、粗纖維5.5%、水分9.0%、氨基酸7.1%、維生素3.9%、金屬離子1.3%、多不飽和脂肪酸16.3%，能值為24.03 kJ/g。花生加飼料組為正常飼料和花生按1∶1(W∶W)比例投喂，處理時間為39 d。Day 0和Dayn分別代表處理第0天和第n天，每3 d于09:00—10:00測量體重和攝食量，電子天平精確度為0.1 g，每只動物每3 d投喂30 g食物，每日攝食量為(30 g-3 d后剩余食物)/3。

1.2 細(xì)胞免疫功能的測定

將植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin，PHA)注射到動物足墊中部，可誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)并引起足墊腫脹，腫脹程度越大，即PHA反應(yīng)越大，表明T細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，因此，PHA反應(yīng)可反映哺乳動物細(xì)胞免疫功能(de Bellocqet al., 2006; Xu and Wang, 2010)。在Day 35，用數(shù)顯電子測微尺(Mitutoyo Absolute cod. 547-301,日本) 測量3 組黑線倉鼠左后足足墊的厚度(精確至± 0.01 mm)，后用75%的酒精對左后足足墊進(jìn)行消毒，在足墊中心處注射30 μL 含0.1 mg PHA(PHA-P,Sigma L-8754)的無菌PBS緩沖液(pH值7.4)，分別在6 h、12 h、24 h和48 h 后測量左后足足墊厚度，每只動物測量6次，平均值即為足墊厚度，為減少誤差，測量時由同一個人操作。PHA反應(yīng)=(注射后足墊厚度-注射前足墊厚度)/注射前足墊厚度(Xu and Wang,2010;Xu and Hu,2017)。

1.3 血液指標(biāo)

血液指標(biāo)同樣能反映動物的健康狀況(Harikrishnanet al., 2011; Fazioet al., 2016; Kim and Kang,2016;Xu and Hu,2020)。在Day 34 用異氟烷(山東利諾制藥有限公司) 輕度麻醉，眼眶后竇取血(約100 μL)，迅速取20 μL 血液，用4 mL 血細(xì)胞分析稀釋液(含氯化鈉、硫酸鈉、緩沖劑、抗菌劑、防腐劑) 進(jìn)行稀釋，全自動血液細(xì)胞分析儀(DYMIND UN73) 檢測紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度、白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)等血液指標(biāo)(Xuet al.,2018;Xu and Hu,2020)。

1.4 統(tǒng)計分析方法

用SPSS 18.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)分析前，用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行正態(tài)性檢驗，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。PHA反應(yīng)用反正弦轉(zhuǎn)化后進(jìn)行分析，采用重復(fù)測量(Repeated measures)的方差方法分析體重、攝食量和PHA反應(yīng)的時間變化及組間差異，每個時間點的體重、攝食量、PHA 反應(yīng)以及所有血液指標(biāo)均采用單因素方差(One-way ANOVA)和Tukey’s post hoc 檢驗進(jìn)行分析，利用皮爾遜相關(guān)分析(Pearson correlation analysis)檢測PHA反應(yīng)與血液指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系。統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，其中P＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，P＜0.01表示統(tǒng)計學(xué)差異極顯著，P＜0.001表示統(tǒng)計學(xué)差異極其顯著。

2 結(jié)果

2.1 體重

實驗開始前，NP、NF 和Peanut 組黑線倉鼠的體重沒有顯著差異(Day 0:F2，27= 0.005,P=0.995)，但 在Day 15 (F2，27= 3.437,P= 0.047)、Day 18 (F2，27= 4.529,P= 0.020)、Day 24 (F2，27=3.547,P= 0.043)、Day 27 (F2，27= 3.546,P=0.043) 和Day 30 (F2，27= 4.246,P= 0.025) 的體重組間差異顯著，其他時間點則沒有顯著差異(圖1)。

圖1 飼喂花生對雌性黑線倉鼠體重的影響. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組. *表示組間差異顯著Fig. 1 Effect of feeding peanut on body mass in female striped hamsters. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group; Peanut: peanut group. * indicates significant differences between groups

2.2 攝食量

黑線倉鼠攝食量在Day 3 (F2，27= 0.579,P=0.567)和Day 39(F2，27=1.852,P=0.176)3組間沒有顯著性差異，但Peanut組和NP組的攝食量從Day 6 (F2，27= 13.436,P＜0.001) 至Day 36 (F2，27=11.108,P＜0.001)，均顯著低于NF組(圖2)。

圖2 飼喂花生對雌性黑線倉鼠攝食量的影響. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組. **P ＜0.01，***P ＜0.001Fig. 2 Effect of feeding peanut on food intake in female striped hamsters. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group;Peanut:peanut group. **P ＜0.01,***P ＜0.001

2.3 細(xì)胞免疫反應(yīng)

PHA 反應(yīng)隨注射PHA 溶液后的時間延長而降低(F1,27=472.636,P＜0.001)，但不受時間與分組之間交互作用的影響(F2,27= 1.307,P= 0.287)；NF 組(F1,9= 100.447,P＜0.001)、NP 組(F1,9=239.215,P＜0.001) 和Peanut 組(F1,9= 181.001,P＜0.001)最大PHA 反應(yīng)為注射PHA 后6 h(圖3)。NP 組PHA 注 射 后12 h 高 于NF 組(F2,27= 3.372,P= 0.049)，而PHA 注射后6 h (F2,27= 1.379,P=0.269)、PHA 注射后24 h (F2,27= 1.782,P= 0.187)以及PHA注射后48 h(F2,27=0.373,P=0.692)在3組間均無顯著差異(圖3)。

圖3 飼喂花生對雌性黑線倉鼠PHA反應(yīng)的影響. 柱子上方不同字母代表組間差異顯著. NF：正常飼料組；NP：花生加飼料組；Peanut：花生組Fig. 3 Effect of feeding peanut on PHA response in female striped hamsters. Different letters above the columns indicate significant differences at the level of P ＜0.05. NF: normal fodder group; NP: normal fodder plus peanuts group;Peanut:peanut group

2.4 血液指標(biāo)

與NF組相比，NP組和Peanut組紅細(xì)胞(RBC)和紅細(xì)胞壓積(PCV) 顯著增加，Peanut 組的血小板(PLT)高于NF與NP組(表1)；白細(xì)胞(WBC)和淋巴細(xì)胞(LYMF) 在3 組間沒有顯著差異，但NP組 和Peanut 組WBC 比NF 組 分 別 高22.9% 和25.0%，LYMF 分別高15.0%和22.5% (表1)。其他血液指標(biāo)包括紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血紅蛋白濃度(HGB)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC) 和淋巴細(xì)胞比率(LYMF%)在3 組之間均無顯著差異(表1)。相關(guān)性分析表明，PHA注射6 h與PLT數(shù)和LYMF%呈負(fù)相關(guān)，PHA 注射24 h 與LYMF%呈負(fù)相關(guān)，而PHA 注射12 h和24 h與RBC數(shù)和PCV呈正相關(guān)(表2)。

表1 飼喂花生對雌性黑線倉鼠血液指標(biāo)的影響Table 1 Effect of feeding peanut on hematological indices in female striped hamsters

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3 討論

飼喂花生增加了黑線倉鼠的體重，但降低了攝食量，這可能與花生脂肪含量和能值比正常飼料高有關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn)，高脂食物能增加人和動物的體重(Conway and Rene, 2004; Lamaset al.,2004;Amaret al., 2007)，也有研究發(fā)現(xiàn)高脂食物不影響動物體重，但降低了攝食量(畢中強(qiáng)等，2018)。本研究的不足在于沒有區(qū)分花生加飼料組中黑線倉鼠攝入的花生與正常飼料的量，因而無法確定其能量攝入。

與預(yù)測一致，花生加飼料組注射PHA 12 h 反應(yīng)顯著高于正常飼料組，而單純飼喂花生組與正常飼料組PHA 反應(yīng)無差異，這些結(jié)果表明在正常飼料的基礎(chǔ)上添加飼喂花生能提高黑線倉鼠的細(xì)胞免疫能力，這可能與花生含有豐富的維生素、必需氨基酸、必需脂肪酸以及多種微量元素等有關(guān)(李立等，2013；張慧文等，2015；劉寶軍等，2019)。食物中的營養(yǎng)成分是影響人和動物免疫能力的重要因素，營養(yǎng)不良會損害免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致宿主感染風(fēng)險增加，這可能是由于能量攝入和食物營養(yǎng)成分(包括糖、脂肪和蛋白質(zhì)) 以及某些特定的微量營養(yǎng)成分?jǐn)z入不足引起(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004; Westerterp-Plantengaet al., 2012)。例如禁食會抑制實驗室小鼠和大鼠(Lordet al., 1998; Nakamuraet al.,2001, 2004) 以及野生長爪沙鼠(Xu and Wang,2010；徐德立和王德華，2015) 的細(xì)胞免疫能力，限食同樣會抑制動物如黑線倉鼠的體液免疫(徐德立和徐來祥，2015)、拉布拉多白足鼠(Peromyscus maniculatus) (Demas and Nelson, 1998) 和黑線毛足鼠(Phodopus sungorus) (Bilbo and Nelson, 2004) 的細(xì)胞免疫能力。許多研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)成分包括必需氨基酸、必需脂肪酸、維生素(Vitamin,V)(如VA、VB6、VC和VE) 和微量元素(如Zn、Cu、Fe 和Se)對于維持免疫系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要(Calder and Kew, 2002; Kaminogawa and Nanno, 2004)。VE可通過抗氧化和清除自由基的作用增強(qiáng)免疫功能，例如衰老小鼠食物中添加VE后細(xì)胞免疫功能增加(Meydaniet al.,1986;Meydaniet al.,1997)，Zn 缺乏會損害多種免疫反應(yīng)(Fraker and King, 1998)，而補(bǔ)充Zn 能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫能力(Shankar and Prasad, 1998)。本研究中，單獨飼喂花生組與正常飼料組的細(xì)胞免疫功能沒有差異，與正常飼料相比，花生含有較多的脂肪、蛋白質(zhì)以及維生素，這一結(jié)果表明不同營養(yǎng)成分按不同比例混合的食物可能對免疫反應(yīng)的作用相似。綜上可見，多種營養(yǎng)成分均會影響動物的免疫能力，但究竟花生中的哪些營養(yǎng)成分或者不同營養(yǎng)成分按什么比例混合增加了黑線倉鼠的細(xì)胞免疫能力，還需要進(jìn)一步的研究。

與預(yù)測不同的是，WBC、LYMF 和LYMF%在正常飼料組、花生加飼料組和花生組之間差異不顯著，但花生加飼料組和花生組WBC 比正常飼料組分別高22.9%和25.0%，LYMF分別高15.0%和22.5%，這些結(jié)果暗示飼喂花生可能促進(jìn)了白細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞的增殖。注射PHA 6 h、PHA 12 h、PHA 24 h、PHA 48 h 與血液中WBC 以及LYMF不存在相關(guān)性，但LYMF%與注射PHA 6 h和PHA 24 h呈顯著負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明在黑線倉鼠左后足足墊中心部位注射PHA 溶液后，作為抗原，PHA一方面可能刺激了T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，另一方面也可能會誘導(dǎo)血液中的淋巴細(xì)胞遷移到PHA 注射部位，從而導(dǎo)致足墊腫脹。Zhang 和Zhao(2015)的研究發(fā)現(xiàn)黑線倉鼠左后足足墊中心部位注射PHA 發(fā)生的腫脹反應(yīng)主要與T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞增殖或聚集有關(guān)。

花生加飼料組和花生組的RBC 和PCV 均高于正常飼料組，表明飼喂花生增加了黑線倉鼠運輸氧氣的能力，這可能是因為花生比正常飼料含有更高蛋白質(zhì)、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分(孫中瑞和封海勝，1986；劉麗娜等，2009)，它們可能更有利于紅細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，注射PHA 12 h 與RBC 和PCV 呈正相關(guān)，暗示動物具有較強(qiáng)輸氧能力，可能有助于提高其細(xì)胞免疫功能。Peanut 組PLT顯著高于NF組和NP組，表明花生具有增強(qiáng)凝血的作用，這可能與攝入的花生種皮有關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn)，花生種皮能增加血小板數(shù)目(劉寶軍等，2019；高雅婷和張永軍，2020)?；ㄉN皮中含有白藜蘆醇、單寧酸、原花色素等成分(Udenigweet al., 2008)，至于哪種成分促進(jìn)了血小板增殖，還需要進(jìn)一步的研究。

總之，飼喂花生增加了黑線倉鼠的體重，但其攝食量降低。正常飼料中添加花生能增強(qiáng)黑線倉鼠的細(xì)胞免疫功能，暗示其清除細(xì)胞內(nèi)病原體的能力可能增加。飼喂花生增加了黑線倉鼠RBC和PCV，表明花生具有增強(qiáng)動物輸氧能力的作用。雖然飼喂花生不影響黑線倉鼠WBC 和LYMF，但花生加飼料組和花生組的WBC 和LYMF 比正常飼料組高，暗示花生可能具有促進(jìn)WBC 和LYMF 增殖的作用?；ㄉMPLT高于正常飼料組，說明花生可能具有增強(qiáng)凝血的作用。以上這些結(jié)果表明，飼喂花生能提高黑線倉鼠的健康水平?？梢?，在選擇食物時，除適口性和味道外，黑線倉鼠會選擇有利于健康的食物——花生，由于花生營養(yǎng)成分復(fù)雜多樣，至于哪種營養(yǎng)成分能增加免疫功能，還需要深入研究。