鄧潔華　王佳　祁曉明　王剛生

摘要：為了研發(fā)靶向抗真菌藥物，研究桂皮醛對念珠菌抗菌活性及對白念珠菌細胞壁的影響。參照CLSI的M27-A3方案，采用微量液基稀釋法，測定桂皮醛對念珠菌（白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌）的抗菌作用。將白念珠菌的菌懸液（1×10?cfu/mL）加入到RPMI 1640液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃孵育48 h后，離心、制片，在透射電鏡下觀察細胞結(jié)構(gòu)，以卡泊芬凈、氟康唑作對照。結(jié)果表明：桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑?qū)δ钪榫腗IC分別為白念珠菌3.91，15.62，31.25 mg/L，熱帶念珠菌3.91，15.62，31.25 mg/L，克柔氏念珠菌3.91，31.25，>250 mg/L）。電鏡顯示，01%（質(zhì)量分數(shù)）的桂皮醛只作用于白念珠菌細胞壁，致細胞壁外層溶解脫落，細胞核及細胞器溶解消失，但細胞膜仍然完整;0.1%（質(zhì)量分數(shù)）的卡泊芬凈致白念珠菌細胞壁完全溶解脫落變薄，同時細胞膜部分受損;0.1%（質(zhì)量分數(shù)）的氟康唑致白念珠菌細胞膜溶解脫落，但細胞壁較完整。桂皮醛、卡泊芬凈對念珠菌（白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌）均有較強的抗菌活性，氟康唑?qū)Π啄钪榫?、熱帶念珠菌也有較強的抗菌活性，但對克柔氏念珠菌顯示耐藥。桂皮醛的抗菌活性優(yōu)于卡泊芬凈，卡泊芬凈優(yōu)于氟康唑。桂皮醛作用于白念珠菌細胞壁而不影響細胞膜，卡泊芬凈作用于白念珠菌細胞壁但對細胞膜也有一定影響，氟康唑作用于白念珠菌細胞膜，而不影響細胞壁。因此，桂皮醛有望成為一種靶向治療念珠菌感染的理想藥物。

關(guān)鍵詞：中醫(yī)學與中藥學其他學科;桂皮醛 ;卡泊芬凈;白念珠菌;氟康唑;抗菌活性;細胞壁;細胞膜;電鏡

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx02005

Sensitivity of cinnamaldehyde to Candida?and its effect on cell wall

DENG Jiehua WANG Jia QI Xiaoming WANG Gangsheng

（1Department of Dermatology and Venereology，Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050000，China;2Hebei Clinical Research Center for Dermatology and Venereology，Shijiazhuang，Hebei 050000，China;3Construction Unit of Sub-center of National Clinical Medical Research Center for Skin and Immune Diseases，Shijiazhuang，Hebei 050000，China;4Scientific Research Department，Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei 050000，China;5Electron Microscope Room Department，Second Hospital of Hebei Medical University，Shijia-zhuang，Hebei 050000，China;6Translational Medicine Center，Second Hospital of Hebei Medical University，Shijia-zhuang，Hebei 050000，China）

Abstract：In order to develop targeted antifungal drugs，the antifungal activity of cinnamaldehyde on Candida?and its effect on the cell wall of Candida albicans?were investigatedAccording to M27-A3 procedure of CLSI，the antibacterial effect of cinnamaldehyde on Candida?（Candida albicans，Candida tropicalis，and Candida krusei） was determined by the micro-liquid dilution methodThe Candida albicans?suspension （1×10?cfu/mL） was added to RPMI 1640 liquid medium，incubated at 37 ℃ for 48 h，centrifuged to prepare sections，and the cell structure was observed by transmission electron microscope，and Caspofungin and fluconazole were used as controlsThe results show that the MIC of cinnamaldehyde，caspofungin and fluconazole against Candida?are as follows：Candida albicans?3.91，15.62，31.25 mg/L，Candida tropicalis?3.91，15.62，31.25 mg/L，Candida krusei?3.91，31.25，> 250 mg/LElectron microscope shows that 01% cinnamaldehyde only acts on the cell wall of Candida albicans，causing the outer layer of the cell wall to dissolve and fall off，the nucleus and organelles to dissolve and disappear，but the cell membrane is still intact;0.1% caspofungin causes the cell wall of Candida albicans?to dissolve，fall off and thin，and the cell membrane is partially damaged0.1% fluconazole dissolves the cell membrane of Candida albicans，but the cell wall is relatively intactCinnamaldehyde and caspofungin have strong antibacterial activity against Candida?（Candida albicans，Candida tropicalis，and Candida krusei），and fluconazole has strong antibacterial activity against Candida albicans?and Candida tropicalis，but it shows resistance to Candida kruseiThe antibacterial activity of cinnamaldehyde is better than caspofungin，and caspofungin is better than fluconazoleCinnamaldehyde acts on the cell wall of Candida albicans?without affecting the cell membraneCaspofungin acts on the cell wall of Candida albicans?but also has a certain effect on the cell membraneFluconazole acts on the cell membrane of Candida albicans?without affecting the cell wallCinnamaldehyde is expected to be an ideal drug for the targeted treatment of Candida?infections

Keywords： traditional Chinese medicine and other disciplines of traditional Chinese pharmacy;Cinnamaldehyde;caspofungin;Candida albicans;fluconazole;antifungal activity;cell wall;cell membrane;electron microscope

念珠菌病是由各種致病性念珠菌引起的局部或全身感染性疾病，好發(fā)于免疫力低下患者，可侵犯皮膚、黏膜以及全身組織器官。近年來，隨著糖皮質(zhì)激素、廣譜抗生素及免疫抑制劑的使用及介入性操作、器官移植、腫瘤放化療的增多等危險因素，念珠菌感染率呈上升趨勢[1]。當宿主免疫力低下時還可引起嚴重的深部組織器官的侵襲性感染或菌血癥[2-3]。念珠菌是臨床上深部真菌病感染的主要致病菌，感染率以白念珠菌居首位[4]。臨床上為降低侵襲性念珠菌菌血癥的發(fā)生，常預防性或經(jīng)驗性地使用唑類抗真菌藥物，長此以往念珠菌對唑類藥物的敏感性逐漸下降，形成耐藥性[5]。唑類抗真菌藥物作用于麥角甾醇生物合成通路上14a-去甲基化酶，抗真菌活性和較寬的抗菌譜，僅有抑菌作用而無殺菌效果[6-7]。新型抗真菌藥物棘白菌素作為真菌細胞壁結(jié)構(gòu)（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶制劑，它能夠通過破壞真菌細胞壁結(jié)構(gòu)而殺傷真菌細胞[8]。由于真菌細胞壁是真菌細胞所獨有并且為真菌生存所必須，不存在于哺乳動物的細胞中，所以以真菌細胞壁為靶位的抗真菌藥物成為研究的熱點。

桂皮醛常又稱為肉桂醛、桂醛、β-苯丙烯醛（β-phenylacrolein）、3-苯基-2-丙烯醛，其化學名稱為三苯基丙烯醛，系醛類化合物，為黃色液體，在肉桂等植物中含量較多，天然產(chǎn)物主要存在于桂皮油、藿香油、風信子油、玫瑰油等中，也可被人工合成。肉桂醛為反式結(jié)構(gòu)，其分子是1個苯環(huán)連接1個丙烯醛，分子式為CHO，結(jié)構(gòu)簡式為CHCHCHCHO，相對分子質(zhì)量為132.16。國內(nèi)外對桂皮醛的大量藥理研究表明，其具有抗炎、降糖、抗腫瘤、抗菌等多種藥理活性[9-11]，及對多種真菌的抗菌活性[12-13]，尤其是對念珠菌的抗菌活性較強[14-15]。日益嚴重的侵襲性真菌感染致死率高，從資源豐富的植物藥中尋找有應用價值的抗深部真菌感染藥物有重要意義[16]。為此，本研究參照美國國家臨床實驗室標準化研究所（clinical and laboratory standards institute，CLSI）制訂的M27-A3方案中酵母菌微量液基稀釋法，檢測桂皮醛對念珠菌的抗菌活性，進行其對白念珠菌細胞壁影響作電鏡觀察，并與卡泊芬凈、氟康唑的抗真菌作用對照，為研發(fā)靶向抗真菌藥物提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1儀器和試劑

透射電子顯微鏡（JEM-1200EX型），日本電子株式會社（JEOL）提供;超凈工作臺，北京半導體一廠提供;離心機，美國雅培公司提供;電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司提供;光學顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社（Olympus）提供;麥氏比濁管，法國Biomerieux公司提供;血細胞計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司提供;96孔細胞培養(yǎng)板，浙江黃巖塑料制品廠提供;RPMI1640粉，美國Gibco公司提供;沙氏培養(yǎng)基原料，國藥集團化學試劑有限公司上海分公司提供。

1.1.2菌株

標準株：白念珠菌（Candida albicans），中國科學院微生物研究所提供（ATCC90028）。臨床株：白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌，均為河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院真菌室保存菌株。

1.1.3藥物

桂皮醛（純度98%以上，批號20170101），湖北武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司提供;注射用醋酸卡泊芬凈（批號20170910），默沙東公司提供;氟康唑（批號20170912），輝瑞制藥有限公司提供;羅瑞（注射用氟康唑，批號20170912），山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司提供。

1.2測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）方法

1.2.1微量液基稀釋法（M27-A3）[17]的制備

1）藥物儲存液的制備

將桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑分別溶于高壓滅菌后的9%（質(zhì)量分數(shù)）吐溫80生理鹽水內(nèi)，配制成0.5%（質(zhì)量分數(shù)）的藥物母液（5 mg/mL），置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2）藥物敏感測試板的制備

用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將配制好的藥物儲存液按所需測試濃度的2倍稀釋后，加入一次性使用的96孔板第1—10孔（250～048 μg/mL），每孔100 μL，第11，12孔分別加入不含藥物RPMI 1640液體培養(yǎng)基100，200 μL，其中第11孔為陽性生長對照，第12孔為陰性空白對照。

3）菌懸液的制備和接種

為保證受試菌株（白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌）的純度和活力，將其連續(xù)轉(zhuǎn)種至沙堡弱斜面培養(yǎng)基2次，35 ℃培養(yǎng)48 h，用3 mL無菌生理鹽水制成菌懸液，于血細胞計數(shù)板上調(diào)整菌株濃度至1×10～5×10cfu/mL。用麥氏比濁管調(diào)整為0.5個麥氏單位。[JP3]用1640液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋1 000倍，取100 μL接種于藥物敏感測試板第1—11孔中。

4）孵育和終點判定

接種后的藥物敏感測試板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用視覺判定終點。藥物敏感終點判讀參照M27-A3中對微量液體培養(yǎng)基稀釋法的標準，判斷最低抑菌濃度（minimum inhibitory con-centration，MIC）。

1.2.2電鏡標本的制備

1）0.1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）桂皮醛液基制備

取1 g桂皮醛加入到9 g吐溫80中，溶解后逐漸加入到90 mL的1640液體培養(yǎng)基中，分裝試管，每管15 mL，消毒滅菌。將白念珠菌（1×10?cfu/mL）0.5 mL接種于0.1%桂皮醛藥基內(nèi)，35 ℃震動培養(yǎng)24 h，離心取菌絲及孢子，再經(jīng)生理鹽水沖洗、離心后送透射電子顯微鏡（以下簡稱電鏡）觀測。0.1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）卡泊芬凈和0.1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）氟康唑作對照。

2）電鏡觀察

分別取經(jīng)0.1%的桂皮醛、卡泊芬凈、氟康唑作用后的白念珠菌，用3%（質(zhì)量分數(shù)）戊二醛磷酸緩沖液（pH值為7.4）洗后，1%（質(zhì)量分數(shù)）鋨酸雙重固定，再逐級用丙酮脫水。環(huán)氧樹脂包埋，制備超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鈉溶液雙重染色，于電鏡下觀察。

1.2.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果及分析

2.1桂皮醛實驗組及卡泊芬凈和氟康唑?qū)φ战M對念珠菌的抗菌活性

桂皮醛實驗組對白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌的MIC均值均為3.91 mg/L;卡泊芬凈對照組對白念珠菌、熱帶念珠菌的MIC均值為15.62 mg/L，對克柔氏念珠菌均值為31.25 mg/L;氟康唑?qū)φ战M對白念珠菌、熱帶念珠菌均值為31.25 mg/L，對克柔氏念珠菌均值為> 250 mg/L。

結(jié)果表明，桂皮醛和卡泊芬凈對白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌均有較強的抗菌活性，且桂皮醛優(yōu)于卡泊芬凈。氟康唑?qū)Π啄钪榫?、熱帶念珠菌也有較強的抗菌作用，但對克柔氏念珠菌顯示耐藥，結(jié)果見表1。

2.2電鏡下桂皮醛、卡泊芬凈和氟康唑?qū)Π啄钪榫毎诘挠绊?/p>

未經(jīng)藥物作用的白念珠菌在電鏡下，白念珠菌芽生孢子細胞表面光滑，胞壁層次清楚，胞膜完整，胞核及內(nèi)容物清晰（見圖1 a）—b））。實驗組的桂皮醛作用白念珠菌后，細胞形態(tài)呈不規(guī)則，外層胞壁缺損，不完整，胞核破壞，內(nèi)容物消失，呈空泡狀，但細胞膜較完整（見圖1 c）—d））;對照組的卡泊芬凈作用白念珠菌后，細胞壁溶解變薄，胞核破壞，內(nèi)容物消失，部分胞膜缺損（見圖1 e）—f））;對照組的氟康唑作用白念珠菌后，細胞壁較完整，但胞膜部分破壞或消失，不完整，內(nèi)容物部分被破壞（見圖1 g）—h））。

3討論

目前，能有效治療深部真菌感染尤其是免疫缺陷合并系統(tǒng)性侵襲性真菌感染的藥物尚不多，深部真菌與其哺乳類宿主都是真核生物，在基因、結(jié)構(gòu)和代謝等方面有許多相同之處。因此，研發(fā)理想抗真菌藥物時應考慮到藥物只作用于真菌特有的結(jié)構(gòu)或代謝過程而不影響宿主，這樣才能提高抗真菌藥物的有效性和安全性。

1）桂皮醛的抗菌性優(yōu)于卡泊芬凈和氟康唑

本研究顯示，桂皮醛、卡泊芬凈對念珠菌（白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌）均有較強的抗菌活性，桂皮醛、卡泊芬凈均優(yōu)于氟康唑，二者比較桂皮醛優(yōu)于卡泊芬凈。實驗進一步證明桂皮醛是最活躍的抗微生物的有效成分，依據(jù)其最低抑菌濃度（MIC）可預見桂皮醛將成為一種強有力的天然抗菌劑[18-19]。

2）桂皮醛對宿主不易產(chǎn)生副作用

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，桂皮醛作用白念珠菌后，細胞形態(tài)呈不規(guī)則，胞壁結(jié)構(gòu)受損，胞壁外層脫落缺損，導致細胞內(nèi)外的滲透壓破壞、細胞器溶解，最終菌體破裂、死亡。但細胞膜仍然保持完整、無損、清晰。這說明桂皮醛只破壞真菌細胞壁而不影響細胞膜，對宿主不易產(chǎn)生毒副作用。研究進一步驗證了謝小梅等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，通過電鏡和同位素標記發(fā)現(xiàn)桂皮醛作用于曲霉菌細胞壁后使其結(jié)構(gòu)破壞，細胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，影響了物質(zhì)的吸收，生物大分子合成，從而抑制了真菌的生長繁殖。鄧潔華等[21]通過電鏡發(fā)現(xiàn)桂皮醛作用于曲霉菌細胞壁后使其結(jié)構(gòu)破壞，但細胞膜不受影響。

3）卡泊芬凈對宿主的毒副作用不確定

卡泊芬凈是一種棘白菌素類抗真菌藥物，作用機制主要是通過非競爭性抑制（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶，干擾真菌細胞壁（1，3）-β-D-葡聚糖合成，導致真菌細胞壁滲透性改變，細胞溶解死亡[22-24]。張明等[25]發(fā)現(xiàn)棘白菌素類抗真菌藥可抑制真菌細胞中（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶導致細胞破壞菌體裂解死亡?？ú捶覂魧Υ蠖鄶?shù)念珠菌具有殺菌作用，包括白念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌等[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈作用白念珠菌后，菌絲、孢子外層胞壁缺損，不完整，胞壁層次不清，變薄，胞核破壞，內(nèi)容物消失，部分胞膜缺損，致細胞變性、死亡。這說明卡泊芬凈主要破壞白念珠菌細胞壁，同時對細胞膜也有一定的影響，可能具有雙向靶位抗菌作用，臨床治療真菌感染可能會產(chǎn)生一定的副作用。卡泊芬凈作用在真菌細胞壁抑制真菌細胞中（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶，但是卡泊芬凈是否影響真菌細胞膜，尚未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈可能會對細胞膜有一定的影響，今后應進一步深入研究。

4）氟康唑?qū)λ拗饕桩a(chǎn)生毒副作用

氟康唑?qū)Π啄钪榫毎跓o顯著影響，對細胞膜有顯著影響。這說明，氟康唑主要是作用在真菌細胞膜，對宿主易產(chǎn)生毒副作用。氟康唑為三唑類抗真菌藥，其藥理作用主要是對真菌依賴的細胞色素P450酶有高度特異性，可抑制真菌細胞膜麥角甾醇的生物合成，影響細胞膜的通透性，達到抑制真菌生長。因此，臨床可見氟康唑具有顯著的副作用。

4結(jié)語

深部念珠菌感染日益普遍且形勢嚴峻，這已經(jīng)成為業(yè)內(nèi)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[26]，探討桂皮醛抗深部念珠菌的抗菌活性及作用機理，對研發(fā)靶向抗真菌藥物具有重要意義。實驗表明，桂皮醛對念珠菌有很強的抗菌活性（其MIC分別為白念珠菌3.91 mg/L，熱帶念珠菌3.91 mg/L，克柔氏念珠菌3.91 mg/L）且優(yōu)于卡泊芬凈和氟康唑。電鏡結(jié)果顯示，桂皮醛作用白念珠菌后只破壞細胞壁而不影響細胞膜，對人類不易產(chǎn)生毒副作用。

在抗真菌藥物研發(fā)方面，重點研發(fā)葡聚糖合成酶抑制劑，降低抗真菌藥物的毒副作用，提高臨床的治療效果。但是，桂皮醛有望成為一種靶向治療念珠菌感染的理想藥物，今后在針對桂皮醛的藥物研發(fā)工作中還應進一步注重深入探討其作用機制，充分利用其多種藥理活性使其發(fā)揮更大的臨床價值。

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