謝文蕊，鄧程偉，符正奇，張志東，吳進盛（1.海南省儋州市人民醫(yī)院a.腫瘤內(nèi)科，b.放療科，c.腫瘤外科海南 儋州 571700；.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤康復(fù)與姑息治療科，海南 ?？?570100）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管乳腺癌的綜合診療技術(shù)不斷提高，但全世界每年仍有50 萬人死于乳腺癌[1]。目前，放射治療（簡稱放療）作為乳腺癌治療的主要輔助手段，對降低乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險、提高患者生存（OS）率具有重要意義[2-3]。然而，乳腺癌細胞放療抗性的出現(xiàn)嚴重影響了放療的效果[4]。因此，了解乳腺癌細胞放療抗性的潛在機制，提高其放射敏感性是臨床乳腺癌放療亟待解決的重大課題。有研究[5]結(jié)果指出，miR-620 表達上調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。miR-620 通過調(diào)控靶基因表達可促進腫瘤細胞增殖，并增加腫瘤細胞的放療抗性[6]。此外，在乳腺癌組織中生長抑制因子4（inhibitor of growth 4，ING4）表達下調(diào)，上調(diào)ING4 可抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡[7-8]，但其在乳腺癌放療中的作用并不清楚。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-620對ING4具有潛在的靶向調(diào)控作用，然而，目前miR-620調(diào)控ING4 表達介導(dǎo)乳腺癌細胞放射敏感性的作用機制尚未見報道。本研究通過檢測miR-620和ING4在人乳腺癌組織和細胞中的表達水平，探討miR-620/ING4 軸調(diào)控乳腺癌細胞放射敏感性的分子機制，旨在為提高臨床乳腺癌患者的放療效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本、細胞和主要試劑

收集2017 年3 月至2018 年3 月在海南省儋州市人民醫(yī)院確診并手術(shù)切除的21例乳腺癌患者的癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣大于5 cm）標本。所有乳腺癌患者術(shù)前均未接受放療或化療。患者均為女性，年齡28～65歲之間，中位年齡47歲。本研究開展前已征得患者或其家屬同意并簽署知情同意書，研究方案獲得所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員批準。

人乳腺癌細胞MCF-7 和BCaP-37 以及乳腺上皮細胞HBL-100 購于中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為美國Gibco 公司產(chǎn)品，LipofectamineTM2000、BCA 蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR 試劑盒均購于TaKaRa 公司，TRIzol試劑、MTT試劑、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和WB 相關(guān)試劑購于上海碧云天生物科技有限公司，Cyclin D1、P21 和ING4抗體均為Abcam 公司產(chǎn)品，BAX、Bcl-2 和GAPDH 抗體及二抗均為Santa Cruz 公司產(chǎn)品，實驗所用引物、anti-miR-NC、anti-miR-620、si-NC、si-ING4、miR-NC、miR-620 mimics由北京華大基因公司提供。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

將MCF-7 細胞按照細胞密度2×105個/孔接種于6 孔板，利用LipofectamineTM2000 在細胞匯合度為60%時按照操作步驟進行轉(zhuǎn)染。MCF-7細胞分組如下：miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC）和miR-620 組（轉(zhuǎn)染miR-620 mimic）、anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC）和anti-miR-620組（轉(zhuǎn)染anti-miR-620）、anti-miR-620+si-NC組（anti-miR-620和si-NC共轉(zhuǎn)染）和anti-miR-620+si-ING4 組（anti-miR-620 和si-ING4 共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染24 h后，利用qPCR法檢測miR-620或ING4 mRNA表達驗證轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染成功的細胞方可用于后續(xù)實驗。

1.3 qPCR 法檢測乳腺癌組織和細胞中miR-620 和ING4 mRNA的表達水平

利用TRIzol試劑分別提取乳腺癌組織和細胞中總RNA，進行RNA定量。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按照qPCR 試劑盒說明測定miR-620 和ING4 mRNA 水平。引物序列：miR-620 上游為5′-GCCGAGATGGAGATAGATAT-3′，下游為5′-CTC AACTGGTGTCGTGGA-3′；U6上游為5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，下游為5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′ ；ING4上游為5′-CACAAGTCCTG AGTATGGGAT-3′，下游為5′-AGGGGATGTGGA AGAAACTGT-3′；GAPDH 上游為5′-GAAATCCCAT CACCATCTTCCAGG-3′，下游為5′-GAGCCCCAGC CTTCTCCATG-3′。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)。分別以U6 和GAPDH 作為內(nèi)參對照，按照2-△△Ct法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-620與ING4的靶向關(guān)系

用StarBase 網(wǎng)站預(yù)測miR-620 與ING4 之間是否存在特異性結(jié)合位點。將含有miR-620 結(jié)合位點的ING4-3′UTR 的野生型（WT）序列、ING4 的突變型（MUT）序列克隆到pmirGLO 載體，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒WT-ING4、MUT-ING4。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書方法將WT-ING4與miR-620 mimic 或miR-NC、MUT-ING4 與miR-620 mimic 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染至MCF-7 細胞，培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.5 克隆形成實驗檢測乳腺癌細胞克隆形成能力

將anti-miR-NC組、anti-miR-620組、anti-miR-620+si-NC 組和anti-miR-620+si-ING4 組MCF-7 細胞分別以不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）的X 線照射2 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，當肉眼可見克隆形成時，吸除培養(yǎng)液，PBS 洗滌后用甲醇固定20 min，再用0.2%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下計算≥50 個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%）。利用GraphPadPrism 7 軟件，單擊多靶模型公式存活分數(shù)（survival fraction，SF）=1-（1-e-D/D0）N，擬合細胞存活曲線曲線，D為照射劑量，D0為平均致死劑量。計算準域劑量（Dq）和放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER），Dq=ln N×D0，SER=Do對照組/D0實驗組。照射劑量為2 Gy 時對應(yīng)的細胞存活分數(shù)記為SF2。

1.6 MTT法檢測乳腺癌細胞增殖活力

將anti-miR-NC組、anti-miR-620組、anti-miR-620+si-NC 組和anti-miR-620+si-ING4 組MCF-7 細胞消化為單細胞懸液，按照每孔200 μl接種到96孔板（5×103個細胞/孔），當細胞貼壁后用4 Gy X 線照射2 h，依次記 為IR+anti-miR-NC 組、IR+anti-miR-620 組、IR+anti-miR-620+si-NC組和IR+anti-miR-620+si-ING4組，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后，上酶標儀在490 nm 波長處測定每孔細胞的光密度（D）值。

1.7 FCM檢測乳腺癌細胞凋亡和周期

細胞凋亡檢測：取轉(zhuǎn)染后4 Gy X線照射2 h并繼續(xù)培養(yǎng)48 h的各組MCF-7細胞，PBS液洗滌并重懸細胞，每孔加入Annexin V-FITC和PI溶液各5 μL，混合均勻后，避光處理10 min，上FCM檢測細胞的凋亡情況。

細胞周期檢測：43×g離心5 min收集各組細胞沉淀，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次后，加入預(yù)冷75%乙醇，4 ℃固定4 h以上。以805×g離心5 min，棄上清，PBS洗滌后，加入400 μL PI（50 μg/mL）、100 μL RNase A（100 μg/mL），4 ℃避光處理30 min，上FCM檢測細胞周期分布情況。

1.8 WB 法檢測乳腺癌細胞中ING4、BAX、P21、Bcl-2和Cyclin D1蛋白表達

利用RIPA裂解液提取各組MCF-7細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，沸水浴3 min變性細胞蛋白。隨后按照試劑盒說明書的實驗步驟上樣、進行SDSPAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，在5%脫脂奶粉中封閉2 h。然后加入ING4（1∶1 000）、BAX（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Cyclin D1（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗中，4 ℃處理12 h，洗膜后，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）中37 ℃處理2 h。利用ELC 發(fā)光試劑盒進行顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以GADPH為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

qPCR法、克隆形成、MTT法、FCM和WB法等實驗均重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和細胞中miR-620 高表達、ING4 mRNA低表達

qPCR法檢測結(jié)果（圖1）顯示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中miR-620 表達顯著升高、ING4 mRNA表達水平顯著降低（均P＜0.01，圖1A）；與乳腺上皮細胞HBL-100 比較，乳腺癌MCF-7 和BCaP-37 細胞中miR-620 表達水平均顯著升高、ING4 mRNA 表達水平均顯著降低（均P＜0.01，圖1B）。由于miR-620 在MCF-7 細胞中的表達水平較高，選用該細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 成功轉(zhuǎn)染anti-miR-620和si-ING4

qPCR 法檢測結(jié)果顯示，anti-miR-620 組MCF-7細胞中miR-620 表達水平顯著低于anti-miR-NC 組（0.31±0.03vs1.00±0.00，P＜0.01），說明anti-miR-620轉(zhuǎn)染成功；anti-miR-620+si-ING4 組ING4 mRNA 表達水平顯著低于anti-miR-620+si-NC 組（0.37±0.05vs1.00±0.09，P＜0.01）。結(jié)果表明，anti-miR-620 和si-ING4轉(zhuǎn)染成功。

2.3 敲減miR-620 或同時敲減ING4 對MCF-7 細胞的放射敏感性的影響

以0、2、4、6、8 Gy X線照射各轉(zhuǎn)染組MCF-7細胞后，克隆形成實驗結(jié)果（圖2）顯示，anti-miR-620 組細胞存活分數(shù)顯著低于anti-miR-NC 組（P＜0.01），anti-miR-620+si-ING4 組細胞存活分數(shù)顯著高于anti-miR-620+si-NC 組（P＜0.01）。結(jié)果表明，敲減miR-620降低放射線照射的MCF-7細胞活性，而同時敲減ING4 則逆轉(zhuǎn)敲減miR-620 對放射線照射的MCF-7細胞活性的影響。

當照射劑量為4 Gy 時，敲減miR-620 的MCF-7細胞活性抑制率約為50%，因此比較照射劑量為4 Gy時細胞克隆形成率和增敏比，結(jié)果（圖3，表1）顯示，IR+anti-miR-620 組細胞克隆形成率顯著低于IR+anti-miR-NC 組（P＜0.01），增敏比為1.891；IR+anti-miR-620+si-ING4 組細胞克隆形成率顯著高于IR+anti-miR-620+si-NC 組（P＜0.01），增敏比為0.628。結(jié)果表明，敲減miR-620 提高MCF-7 細胞放射敏感性，而同時敲減ING4 則逆轉(zhuǎn)敲減miR-620 對MCF-7細胞放射敏感性的作用。

表1 單擊多靶模型參數(shù)

2.4 敲減miR-620 或同時敲減ING4 對MCF-7 細胞增殖和凋亡的影響

4 Gy 照射MCF-7 細胞后，MTT 法和FCM 檢測結(jié)果（表2，圖4）顯示，與IR+anti-miR-NC 組比較，IR+anti-miR-620 組MCF-7 細胞增殖活力、S 期細胞比例均顯著降低（均P＜0.01），細胞凋亡率、G0-G1期細胞比例顯著升高（均P＜0.01）；與IR+anti-miR-620+si-NC 組比較，IR+anti-miR-620+si-ING4 組MCF-7 細胞增殖活力、S期細胞比例均顯著升高（均P＜0.01），細胞凋亡率、G0-G1 期細胞比例均顯著降低（均P＜0.01）。結(jié)果表明，敲減miR-620 抑制放射線照射的MCF-7細胞增殖和細胞周期進程，并促進細胞凋亡；同時敲減ING4可逆轉(zhuǎn)敲減miR-620對放射線照射的MCF-7細胞增殖、細胞周期進程及凋亡的作用。

表2 敲減miR-620或同時敲減ING4對MCF-7的細胞周期、增殖和凋亡的影響

2.5 miR-620靶向負性調(diào)控ING4的表達

靶基因測序工具StarBase 預(yù)測結(jié)果（圖5A）顯示，ING4 的3'UTR 存在于miR-620 特異性結(jié)合的核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（圖5B）顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ING4 與miR-NC 的細胞相比，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ING4 與miR-620 mimic 的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01）；而與共轉(zhuǎn)染MUT-ING4 與miR-NC的細胞相比，共轉(zhuǎn)染MUT-ING4 與miR-620 mimic 的細胞熒光素酶活性無變化（P=0.851＞0.05）。qPCR法和WB 法檢測結(jié)果（圖5C）顯示，與miR-NC 組比較，miR-620 組MCF-7 細胞中miR-620 表達水平顯著升高（4.15±0.12vs1.00±0.00，P＜0.01）、ING4 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；anti-miR-620 組MCF-7 細胞miR-620 表達低于miR-NC 組（0.31±0.03vs1.00±0.00，P＜0.01）、ING4 蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組（P＜0.01）。結(jié)果表明，miR-620 靶向負性調(diào)控ING4的表達。

2.6 敲減miR-620 或同時敲減ING4 對MCF-7 細胞中ING4、細胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

4 Gy照射MCF-7細胞后，WB法檢測結(jié)果（圖6）顯示，與IR+anti-miR-NC 組比較，IR+anti-miR-620組細胞中BAX、P21 和ING4 蛋白表達均顯著升高（均P＜0.01），Bcl-2和Cyclin D1 蛋白表達均顯著降低（均P＜0.01）；與IR+anti-miR-620+si-NC 組比較，IR+anti-miR-620+si-ING4 組細胞中BAX、P21 和ING4 蛋白表達均顯著降低（均P＜0.01）、Bcl-2 和Cyclin D1 蛋白表達顯著升高（均P＜0.01）。結(jié)果表明，敲減miR-620可能通過靶向下調(diào)ING4 調(diào)控BAX、P21、Bcl-2和Cyclin D1的表達，進而抑制放射線照射的MCF-7細胞增殖并促進細胞凋亡。

3 討論

目前，放療是局部晚期乳腺癌患者的主要治療方式之一，但由于腫瘤細胞放射抗性的產(chǎn)生，使腫瘤細胞增殖能力增強，進而誘導(dǎo)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不良。因此，探究調(diào)控乳腺癌細胞放射敏感性的基因和分子機制，對解決臨床乳腺癌細胞放射抗性難題具有重要意義。miRNA是一類短鏈非編碼RNA，其通過與靶mRNA 的3′非編碼區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。miRNA的異常表達與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，影響著惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。近年來，有研究[11-13]結(jié)果證實，miRNA 與腫瘤細胞的放射抗性密切相關(guān)，多種miRNA 通過調(diào)控其靶基因參與對腫瘤細胞放射敏感性的調(diào)控。例如，miR-139-5p通過抑制DNA 修復(fù)和ROS 防御的多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控乳腺癌的放療耐藥[12]，miR-22通過靶向SIRT1抑制腫瘤發(fā)生，提高乳腺癌細胞的放射敏感性[13]。此外，HUANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-620通過靶向下調(diào)HPGD表達，促進癌細胞增殖，減少G2/M阻滯，從而增強癌細胞的放療抗性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與乳腺上皮細胞HBL-100 相比，miR-620 在乳腺癌細胞中呈高表達。選取表達量最高的MCF-7 細胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)敲減miR-620 表達可降低促增殖蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達，提高抗增殖蛋白P21、促凋亡蛋白BAX 表達水平，抑制乳腺癌MCF-7 細胞增殖，促進細胞凋亡，進而上調(diào)MCF-7細胞的放射敏感性。這與HUANG等[6]miR-620增強乳腺癌細胞MDA-MB-231放療抗性的結(jié)論相吻合。

ING4 是生長抑制蛋白家族的成員之一，該家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)特征，包括PHD指狀結(jié)構(gòu)域、典型的核定位信號和一個未知功能的特殊區(qū)域[14]。ING4是一種潛在的腫瘤抑制因子，在調(diào)控細胞周期、凋亡、DNA 修復(fù)、染色質(zhì)修飾、抑制細胞遷移和血管生成等過程發(fā)揮重要作用，ING4 表達下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移增加、TMN 分期進展及乳腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[15-16]。已有研究[17]證實，ING4在非小細胞肺癌組織中呈低表達，過表達ING4可增強非小細胞肺癌細胞SPC-A1 的放射敏感性。此外，有研究[18]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ING4 在乳腺癌組織中表達下調(diào)，ING4 和IL-24 兩種抑癌基因的共表達可顯著提乳腺癌MDA-MB-231細胞的放療敏感性。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，ING4 可能是miR-620 的靶基因，但miR-620 能否通過調(diào)控ING4表達影響乳腺癌細胞的放射敏感性尚未可知。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖B 實驗證實，miR-620 可靶向負性調(diào)控ING4 表達。研究結(jié)果[19]表明，ING4 可能通過引起G2/M 期阻滯，誘導(dǎo)細胞凋亡，進而抑制乳腺癌細胞增殖，這與本研究中敲減ING4逆轉(zhuǎn)anti-miR-620對Cyclin D1蛋白表達抑制和P21蛋白表達促進作用的結(jié)果相吻合。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減ING4 能解除anti-miR-620 對MCF-7細胞增殖抑制和凋亡促進的作用，并降低細胞的放射敏感性。

綜上所述，miR-620在乳腺癌MCF-7細胞中表達上調(diào)，敲減miR-620 可促進ING4 表達，抑制MCF-7細胞增殖，促進細胞凋亡，從而增加MCF-7細胞的放射敏感性，這為臨床乳腺癌的放射治療提供了新的靶點。