梁佳，沈素朋，郭煒，郭艷麗，董稚明（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤研究所，河北 石家莊 050011）

胃賁門(mén)腺癌（gastric cardia adenocarcinoma，GCA）是胃癌中侵襲性最強(qiáng)的一種類(lèi)型，相對(duì)于其他類(lèi)型的胃癌，其發(fā)病率及病死率均較高[1-2]。由于GCA 出現(xiàn)癥狀時(shí)，大多數(shù)患者已到疾病的中、晚期，加上術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。lncRNA 是指長(zhǎng)度大于200 nt、無(wú)蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 分子[3-4]。越來(lái)越多的研究結(jié)果[5-7]表明，lncRNA 的異常表達(dá)參與多種類(lèi)型惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。LINC00997 在腎透明細(xì)胞癌、宮頸癌及結(jié)直腸癌中均異常表達(dá)[8-10]，但其在GCA中的作用研究鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)LINC00997在人GCA組織及胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)應(yīng)用siRNA 干擾胃癌細(xì)胞SGC7901 中LINC00997 的表達(dá)，觀察敲減LINC00997 對(duì)胃癌SGC7901 細(xì)胞遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程的影響，并探討其在GCA 發(fā)生與發(fā)展中的作用及其機(jī)制，為GCA 的靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 LINC00997表達(dá)數(shù)據(jù)的來(lái)源及分析

利用在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中LINC00997在胃癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中胃癌組織408例，癌旁組織211例。根據(jù)LINC00997表達(dá)水平進(jìn)行胃癌患者總生存期（OS）和無(wú)病生存率（DFS）的分析，其中LINC00997高表達(dá)組190例，低表達(dá)組192例，采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，用于假設(shè)檢驗(yàn)。

1.2 臨床標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑

臨床標(biāo)本取自2013年2月至2015年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)的68例GCA手術(shù)患者，其中男性37 例、女性31 例，年齡39～74歲，中位年齡60.0歲。全部患者術(shù)前均未接受任何放射與化學(xué)治療。每例患者均取GCA原發(fā)灶組織及距原發(fā)灶邊緣3～5 cm的相應(yīng)癌旁組織。所有標(biāo)本的切取和使用均經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。手術(shù)切除標(biāo)本一部分常規(guī)制作蠟塊、H-E染色，另一部分置入-80℃低溫冰箱中保存，用來(lái)提取總RNA。所有組織標(biāo)本均由3位病理醫(yī)師共同確診為GCA組織，癌旁組織中均未見(jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)68例GCA患者進(jìn)行隨訪，最長(zhǎng)時(shí)間為65個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為49個(gè)月。

人胃癌細(xì)胞SGC7901、HGC-27、BGC823 和MGC-803由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所病理研究室留存并傳代。TRIzol 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和MTS試劑均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)PAN 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，Transwell 小室和人工基膜（matrigel 膠）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司。蛋白提取試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），兔抗人上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin），以及β-actin等一抗均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司，電化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 qPCR法檢測(cè)GCA組織及胃癌細(xì)胞中LINC00997及EMT相關(guān)基因的表達(dá)

根據(jù)TRIzol 試劑說(shuō)明提取組織和細(xì)胞的總RNA，并將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用于檢測(cè)LINC00997 及EMT 相關(guān)基因的表達(dá)，以GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為CT值，采用相對(duì)定量法，ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，ΔΔCT=ΔCT-ΔCT對(duì)照組，以2-ΔΔCT表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列

1.4 特異性siRNA的構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

2 條siRNA-LINC00997 由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成，分別命名為si-LINC00997#1、si-LINC00997#2，si-NC作為對(duì)照。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，待細(xì)胞匯合度至70%左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明分別將si-LINC00997#1、si-LINC00997#2 及其si-NC 轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞，6 h后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，提取各組細(xì)胞的總RNA，用于觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中LINC00997 的表達(dá)水平，選取干擾效率較高的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾LINC00997表達(dá)對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移的影響

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用直尺比對(duì)，用記號(hào)筆在6孔板背面均勻劃?rùn)M線。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞密度（5×105個(gè)/mL）接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合時(shí)，用200 μL加樣槍頭比著直尺，垂直于橫線劃痕。使用PBS沖洗2次，分別于劃痕后的0、24 h在倒置顯微鏡下（×100）觀察細(xì)胞的遷移距離，計(jì)算細(xì)胞的劃痕愈合率。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾LINC00997表達(dá)對(duì)SGC7901細(xì)胞侵襲的影響

將50 μL稀釋好的matrigel膠預(yù)鋪于Transwell小室上層內(nèi)，37 ℃過(guò)夜。使用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓SGC7901 細(xì)胞24 h，胰酶消化并收集各組細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，每孔上室加入200 μL 細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS 洗3 次，結(jié)晶紫染色、固定后，用棉簽輕輕擦除上室中matrigel 膠及膠上細(xì)胞，PBS 沖洗后室溫晾干，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5 個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，比較各組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 WB法檢測(cè)干擾LINC00997表達(dá)對(duì)SGC7901細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明提細(xì)胞總蛋白，按照BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度，取適量蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，入5%脫脂奶粉的封閉液中室溫處理1 h，加入一抗E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶6 000）、vimentin（1∶2 000）及β-actin（1∶10 000），在搖床上4 ℃過(guò)夜。TBST清洗膜3次（5 min/次），加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶100 000），室溫下靜置1 h 后，用TBST 清洗膜3 次（5 min/次），用電化學(xué)發(fā)光法曝光、顯影。以β-actin為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

qPCR 法、WB 法、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)等均重復(fù)3次。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和近似t檢驗(yàn)，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；應(yīng)用Kaplan-Meier 生存曲線分析LINC00997 表達(dá)與GCA 患者預(yù)后的關(guān)系，采用Log-Rank 檢驗(yàn)比較兩組OS 和DFS 差異，Cox 多因素回歸分析影響GCA 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00997在胃癌組織中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良相關(guān)

利用GEPIA2 網(wǎng)站分析TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中LINC00997在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)胃癌患者OS的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00997 在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05，圖1A），LINC00997高表達(dá)組患者的OS（圖1B）及DFS（圖1C）均顯著低于LINC00997低表達(dá)組患者（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 LINC00997在GCA組織及胃癌細(xì)胞中高表達(dá)

qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，LINC00997在GCA組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖2A）。結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)（表2），GCA 組織中LINC00997 表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）及TNM 分期相關(guān)聯(lián)（P＜0.01）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，LINC00997在胃癌SGC7901、HGC-27、BGC823 和MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05 或P＜0.01；圖2B）。

表2 LINC00997在GCA組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LINC00997表達(dá)與GCA患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)LINC00997在GCA組織中表達(dá)的均值將患者分為L(zhǎng)INC00997 高表達(dá)組（36 例）和低表達(dá)組（32 例）。經(jīng)Log-Rank 檢驗(yàn)分析顯示，LINC00997 高表達(dá)可明顯縮短GCA 患者的5年OS（P＜0.01，圖3）；Cox 多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，LINC00997 表達(dá)是GCA患者獨(dú)立的預(yù)后因素（P＜0.01，表3）。

表3 影響GCA患者預(yù)后的臨床病理特征的單因素和多因素分析

2.4 轉(zhuǎn)染si-LINC00997 可顯著抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移及侵襲能力

qPCR法檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，si-LINC00997#1和si-LINC00997#2組SGC7901細(xì)胞中LINC00997表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功。由于si-LINC00997#1 組的干擾效率最高（P＜0.01），所以，選擇si-LINC00997#1 組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4B）顯示，轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)，si-LINC00997#1 組SGC7901 細(xì)胞的劃痕愈合率顯著低于si-NC 對(duì)照組（P＜0.01）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4C）顯示，si-LINC00997#1 組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于si-NC 組（P＜0.01）。實(shí) 驗(yàn) 結(jié)果表明，敲減LINC00997可顯著抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

2.5 敲減LINC00997 可顯著抑制胃癌SGC7901 細(xì)胞的EMT進(jìn)程

qPCR法檢測(cè)結(jié)果（圖5A）顯示，敲減LINC00997后，SGC7901細(xì)胞中E-cadherin 的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），但N-cadherin 和vimentin 表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

WB 法檢測(cè)結(jié)果（圖5B）顯示，與si-NC 組比較，敲減LINC00997后，SGC7901細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），N-cadherin 和vimentin 表達(dá)均顯著下調(diào)（均P＜0.01）。結(jié)果表明，敲減LINC00997 可顯著抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

3 討論

LINC00997 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于染色體7p14.3，此位置在很多惡性腫瘤中有基因拷貝數(shù)的異常擴(kuò)增[11-12]。為了探索LINC00997 在惡性腫瘤中的表達(dá)，利用GEPIA2 網(wǎng)站分析了TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00997 在多種腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、前列腺癌、膽管癌、食管癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤和肝細(xì)胞癌等，提示LINC00997可能發(fā)揮癌基因的作用。

LINC00997 在腎透明細(xì)胞癌[8]、結(jié)腸癌[9]及宮頸癌[10]中均異常表達(dá)。本研究通過(guò)分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，LINC00997在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且其高表達(dá)組胃癌患者的OS 及DFS 均顯著低于低表達(dá)組患者（均P＜0.05）。在隨后的驗(yàn)證中，本研究檢測(cè)了68例GCA組織和相應(yīng)癌旁組織中LINC00997 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00997 在GCA 組織中高表達(dá)，而且其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)聯(lián)；同時(shí)，分析了LINC00997 表達(dá)與GCA 患者預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，LINC00997 高表達(dá)明顯縮短了GCA 患者的OS；Cox 多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，LINC00997 表達(dá)是GCA患者獨(dú)立的預(yù)后因素。

CHANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00997通過(guò)與STAT3 結(jié)合上調(diào)S100A11 表達(dá)，提高轉(zhuǎn)移相關(guān)分子vimentin、MMP2 和MMP7 的水平，進(jìn)而促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。SHI 等[9]的研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中LINC00997 表達(dá)水平升高，沉默LINC00997后顯著抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制為L(zhǎng)INC00997 通過(guò)靶向miR-512-3p調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CHU 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00997 在宮頸癌組織中高表達(dá)，通過(guò)調(diào)控miR-574-3p/CUL2軸激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增遷移和侵襲。以上研究結(jié)果提示，LINC00997可能與惡性腫瘤的高侵襲和轉(zhuǎn)移力相關(guān)。因此，本課題組設(shè)計(jì)了細(xì)胞遷移和侵襲體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究LINC00997 對(duì)胃癌SGC-7901 細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示，敲減LINC00997后顯著抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞的遷移及侵襲能力，提示LINC00997 在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲中可能發(fā)揮重要作用，與既往研究結(jié)果[8-10]一致。

轉(zhuǎn)移是造成惡性腫瘤預(yù)后不良的主要原因，尋找與轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物對(duì)于延長(zhǎng)患者OS 具有重要意義[13-14]。EMT是與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的最重要的通路[15-16]。為了研究LINC00997 是否參與胃癌的EMT進(jìn)程，本研究檢測(cè)了EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，敲減LINC00997后，SGC-7901細(xì)胞中上皮相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)升高，間充質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin、vimentin的表達(dá)降低，提示LINC00997有可能參與EMT 進(jìn)程并通過(guò)調(diào)控EMT 相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，但其具體的分子機(jī)制尚未明了。大量研究結(jié)果[17-21]表明，lncRNA通過(guò)ceRNA機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生，猜測(cè)其也很有可能通過(guò)miRNA 分子海綿機(jī)制發(fā)揮調(diào)控作用，這有待在今后的研究中得到證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示LINC00997 在GCA組織中高表達(dá)并導(dǎo)致預(yù)后不良，特異性的敲減LINC00997 的表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，并抑制EMT 進(jìn)程，提示LINC00997 可能在GCA 中是一種促癌基因，并在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，有望成為GCA預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。