沈晨露，孔 昊，郭嘉文，仇小麗，倪雅萍，姜維娜

(南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 225300)

1 引言

石蓮花，景天科擬石蓮花屬，莖節(jié)間短，株型矮小，葉灰綠色，肥厚多汁，是一類多肉植物的統(tǒng)稱，也是近年來較流行的小型多肉植物[1]。目前對多功能多肉植物的化學(xué)成分、藥理和臨床等方面的研究取得了一定的進展，但對其有效成分、藥理機制方面還有待深入研究[2]。因此，加快多功能多肉植物資源及其藥用、觀賞，以及作為食用和食品加工原料于一體的綜合研究和開發(fā)具有重要的意義。

研究表明，多糖類物質(zhì)是石蓮花最主要的活性成分之一，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎等療效[3]，并且其在化妝品工業(yè)上也有應(yīng)用，如透明質(zhì)酸、肝素甲殼素及其衍生物的應(yīng)用等。目前，常用熱水回流法[4]、超聲波法[5]、微波法[6]等方法提取多糖成分，熱水回流法提取溫度高，提取率較低；超聲波法和微波法有引起糖苷鍵斷裂的可能，因此，本實驗采用果膠酶和纖維素酶的復(fù)合酶法來提取石蓮花多糖[7]。酶提法能在比較溫和的條件下分解植物組織，加速多糖的釋放，有著廣闊的應(yīng)用前景。同時，本實驗對石蓮花多糖的護膚特性進行了相關(guān)研究，以此為石蓮花多糖的深度開發(fā)及其在化妝品等膚用產(chǎn)品中的應(yīng)用提供一定參考。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

石蓮花，市售；果膠酶、纖維素酶，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

鹽酸、苯酚、硫酸、過二硫酸鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、無水磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑。

FA2004型電子分析天平，上海方瑞儀器有限公司；XMTD-701型恒溫水浴鍋，上海碩光電子科技有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器，上海百申儀器設(shè)備有限公司；LGJ-12S型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；P8型皮膚水分測試儀，深圳市朵美琳科技有限公司；Bruker VERTEX 80 V傅里葉變換紅外光譜儀

2.2 從石蓮花葉中提取多糖

采用復(fù)合酶解法提取石蓮花中的多糖。取新鮮的石蓮花葉肉洗凈去皮，研磨碾碎，以料液比1：20(g/ml)加入到蒸餾水中，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH[8]，加入5.0 %的復(fù)合酶量(纖維素酶-果膠酶，比例為2：1，先加入纖維素酶后加入果膠酶)，在設(shè)定的溫度條件下于水浴鍋中加熱一定時間，酶解后將溫度升高到100 ℃滅酶10 min終止酶解反應(yīng)，離心，提取上清液進行旋轉(zhuǎn)濃縮至10 ml，5倍體積的無水乙醇，混勻；在低溫冰箱中靜置12 h，再于3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min左右，收集沉淀并冷凍干燥。

2.3 石蓮花多糖的含量測定

采用苯酚-硫酸法[9]，在490 nm處測吸光度。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得葡萄糖標準曲線方程為：A=27.424c-0.005900，R2=0.9992。按下式計算石蓮花多糖提取率[10]：

多糖質(zhì)量濃度( %)=(C×V×D×M)/(m×W)

式中C為標準曲線上查得的濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；m為測定所用的粗多糖質(zhì)量(mg)；M為粗多糖質(zhì)量(g)；W為稱取的石蓮花葉片重量(g)。

2.4 單因素實驗

按照“2.2”項下的方法，對提取工藝中酶解時間、溫度、溶液pH進行考察：①在溶液pH為4.5，酶解時間為210 min的條件下，以酶解溫度35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃分別進行提取[11]；②在酶解溫度為50 ℃，溶液pH為4.5，其他條件不變的情況下，用復(fù)合酶法提取180 min、210 min、240 min、270 min、300 min[12]；③在酶解溫度為50 ℃，酶解時間為270 min，其他條件不變的情況下，以溶液pH為3、4、5、6、7分別進行提取[13]。

2.5 紅外光譜分析

石蓮花樣品用FT-IR分光光度計進行分析。樣品用KBr粉末研磨并壓制成1毫米顆粒，紅外分析的吸光度模式為4000-500 cm-1，進行FT-IR分析[14]。

2.6 保濕性的測定

將石蓮花多糖配制成50 mg/ml的溶液。隨機選取十名志愿者，在受試者手臂內(nèi)側(cè)5 cm處標記作為測試區(qū)域，將多糖溶液均勻的涂抹在測試區(qū)域，每個測試區(qū)涂抹1 ml樣品溶液。采用皮膚水分測試儀，分別測量未涂抹樣品前、涂抹樣品后10 min、30 min、50 min、60 min、120 min測試區(qū)域的皮膚水分含量，以評價石蓮花多糖的保濕性能。

2.7 抗紫外活性測定

配制濃度為2.5 mg/ml的石蓮花多糖溶液，用分光光度計測量其在吸收波長220 nm-600 nm之間的吸光度。

2.8 抗氧化性能測定

采用ABTS法[15]，取0.8 mLABTS工作液進行實驗，加入95 %的乙醇0.2 mL，振搖10 s使其充分混合，靜置6 min后測試吸光度。記錄734 nm處的吸光值A(chǔ)0。

再次取0.8 mLABTS工作液，加入多糖溶液0.2 mL，振搖10 s充分混合后，靜置6 min后測試吸光度。測試734 nm處的吸光值A(chǔ)。根據(jù)公式計算自由基清除率

ABTS自由基清除率=(1-A/A0)×100 %

其中A0為對照組的吸光度，A為石蓮花多糖的吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗結(jié)果

3.1.1 溫度對石蓮花多糖提取率的影響(圖1)

如圖1所示，隨著提取溫度的增加，石蓮花多糖得率逐漸增加，在溫度超過50 ℃后多糖得率反而下降，在50 ℃提取得率達到最大值。這可能是隨著溫度的升高，酶的活性也隨之增強，大大提高了復(fù)合酶對細胞壁的破壞能力，促進多糖從裂解的細胞中溶出；而溫度過高時，酶蛋白變性，復(fù)合酶的活性逐漸喪失或多糖糖苷鍵斷裂，使多糖的溶出受到影響，因而得率下降。故以50 ℃作為最優(yōu)的酶解溫度。

圖1 溫度對石蓮花多糖提取率的影響

3.1.2 酶解時間對石蓮花多糖提取率的影響(圖2)

如圖2所示，酶解時間在180 min-270 min之間，石蓮花多糖得率不斷上升；而在時間超過270 min后得率開始下降，最終得到在270 min時多糖得率最高。這可能是在適宜的酶解時間內(nèi)，復(fù)合酶與石蓮花葉肉充分反應(yīng)，從而使石蓮花葉肉細胞壁組織結(jié)構(gòu)被充分破壞，有利于多糖的溶出；但當時間過長時，雜質(zhì)可能也會被提取出來，以致多糖的提取被抑制，同時多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也使得多糖得率降低。故以270 min為最優(yōu)的酶解時間。

圖2 酶解時間對石蓮花多糖提取率的影響

3.1.3 溶液pH對石蓮花多糖提取率的影響(圖3)

如圖3所示，當溶液pH值逐漸的升高，石蓮花多糖得率呈不斷下降趨勢；在pH為3時，多糖得率達到最高。這可能是復(fù)合酶的生物效應(yīng)受溶液pH的影響較大，同時過酸或過堿的環(huán)境會造成多糖中糖苷鍵的斷裂，使得多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，多糖得率降低。故以pH值為3為最優(yōu)的溶液pH值。

圖3 溶液pH對石蓮花多糖提取率的影響

3.2 含量測定結(jié)果

根據(jù)標準曲線和表1的數(shù)據(jù)，可得到最佳提取工藝提取的石蓮花粗多糖的平均含量為6.09 %。

表1 多糖含量測定數(shù)據(jù)

3.3 石蓮花多糖的FT-IR分析

圖4顯示了石蓮花多糖的吸收峰特征，根據(jù)與茯苓多糖、魔芋甘露多糖等紅外光譜圖[16]的對比，其吸收峰和對應(yīng)的化學(xué)基團分別是：3393 cm-1(-OH的伸縮振動)，2930 cm-1和2426 cm-1(-C-H的伸縮振動)，1609 cm-1(-OH的彎曲振動)，1416 cm-1(=CH2的變形振動)，1079 cm-1和1022 cm-1(C-O-H，C-O-C振動)、881 cm-1(β-糖苷鍵)。通過紅外光譜的分析，可以推測得到的多糖屬于β多糖。

圖4 石蓮花多糖的FT-IR圖譜

3.4 保濕性結(jié)果

根據(jù)圖5可以看出，石蓮花多糖溶液在涂上樣品后的一個小時內(nèi)可以保持不錯的水分含量，但其水分含量呈下降趨勢，在短時間內(nèi)具有良好的保濕效果。后續(xù)會進一步在不同年齡，不同性別的實驗對象中展開研究。

圖5 石蓮花多糖的保濕性效果

3.5 抗紫外活性結(jié)果

根據(jù)圖6可知，石蓮花多糖溶液在吸收波段有峰值，說明石蓮花多糖有一定的抗UV活性。

圖6 石蓮花多糖的抗紫外活性

3.6 抗氧化性結(jié)果

采用ABTS法，測得在波長為734 nm處，A0=0.2080，A=0.1000

ABTS自由基清除率=(1-A/A0)×100 %=(1-0.1000/0.2080)×100 %=51.92 %

由此可知，石蓮花多糖具有一定的抗氧化活性，但其方法存在多糖析出，影響吸光值的問題，仍需繼續(xù)研究。

4 結(jié)論

以石蓮花多糖提取率為評價指標，采用單因素實驗優(yōu)化了石蓮花多糖的復(fù)合酶法提取工藝。確定復(fù)合酶法提取石蓮花多糖的最佳工藝條件為：復(fù)合酶用量為5.0 %、料液比1：20(g/ml)、酶解溫度為50 ℃、提取時間為270 min、pH值為3，在此條件下，提取得石蓮花粗多糖的含量大致在6.09 %左右。石蓮花多糖具有一定的保濕性、抗紫外活性和抗氧化活性，對于其深度開發(fā)利用還必須進行更深入的作用機制研究。