佟樂(lè)

中國(guó)食品藥品檢定研究院

孫巍

中國(guó)食品藥品檢定研究院

楊亞莉

中國(guó)食品藥品檢定研究院

王佑春

中國(guó)食品藥品檢定研究院

楊振＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的流行不僅嚴(yán)重威脅了公眾健康，同時(shí)對(duì)生物制品的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。當(dāng)前，新冠病毒疫苗臨床試驗(yàn)進(jìn)展迅速，多項(xiàng)產(chǎn)品已獲批上市后廣泛使用，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括滅活疫苗、蛋白亞單位疫苗、蛋白亞單位佐劑疫苗、非復(fù)制性載體疫苗、多肽疫苗、脂質(zhì)顆粒的mRNA 疫苗等。在眾多技術(shù)平臺(tái)中，mRNA 疫苗憑借其平臺(tái)化的生產(chǎn)方式，通常編碼不同抗原的mRNA 具有相似理化性質(zhì)，新mRNA 疫苗的配方設(shè)計(jì)和生產(chǎn)過(guò)程遵循相同的步驟，具有易于開(kāi)發(fā)且生產(chǎn)工藝相對(duì)穩(wěn)定等特性[1]，受到各方面的廣泛關(guān)注。本文基于mRNA 技術(shù)特點(diǎn)，結(jié)合WHO 最新發(fā)布的《關(guān)于預(yù)防傳染病mRNA 疫苗質(zhì)量、安全性及有效性評(píng)估的法規(guī)考慮》[2]（Evaluation of the Quality,Safety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines for the Prevention of Infectious Diseases:Regulatory Considerations），對(duì)mRNA疫苗產(chǎn)品設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)中需要著重考慮的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行分析和探究。

1 mRNA 技術(shù)的主要特點(diǎn)及設(shè)計(jì)要點(diǎn)

目前處于臨床開(kāi)發(fā)最前沿的mRNA 疫苗或廣泛用于預(yù)防新冠病毒的mRNA 疫苗是通過(guò)酶的方式制備，這種方式不同于其他多數(shù)生物制品[3-4]，其產(chǎn)生免疫原性的mRNA 是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成的，并利用合適的遞送系統(tǒng)將mRNA 運(yùn)輸進(jìn)入人體，依靠細(xì)胞自身的翻譯系統(tǒng)將mRNA 翻譯成目標(biāo)蛋白，從而達(dá)到臨床治療或預(yù)防的目的[5-6]。

1.1 mRNA 的合成和修飾

目前，mRNA 的合成方式主要有2種[2]：一種類(lèi)似于DNA 疫苗的生產(chǎn)方法，由細(xì)菌擴(kuò)增的線(xiàn)性化DNA 質(zhì)粒制備；另一種方式是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或其他合成方法以酶的方式制備線(xiàn)性DNA 分子。無(wú)論是源于質(zhì)粒DNA 產(chǎn)生的線(xiàn)性化分子，還是線(xiàn)性DNA 序列，均是通過(guò)DNA 依賴(lài)性的RNA 聚合酶在體外以酶的方式將線(xiàn)性DNA 模板轉(zhuǎn)錄成mRNA 分子的。

在mRNA 合成中使用的是天然存在的核苷或修飾核苷[7-8]。修飾核苷主要包括使用假尿苷或N1-甲基假尿苷來(lái)代替尿苷[7，9-10]，其可以引發(fā)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的整體變化，從而達(dá)到更高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，通過(guò)對(duì)目的抗原序列進(jìn)行修飾或優(yōu)化，可以改進(jìn)mRNA 的體內(nèi)穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)蛋白的翻譯能力。例如，可根據(jù)臨床提示，通過(guò)適當(dāng)修飾減少固有免疫應(yīng)答，減少體內(nèi)炎癥反應(yīng)[7，9-10]?；蛘?，對(duì)于某些預(yù)防性疫苗，一些固有免疫應(yīng)答可能有助于增強(qiáng)所需的獲得性免疫應(yīng)答，mRNA 也可以相應(yīng)地設(shè)計(jì)。編碼目的抗原的基因序列一般應(yīng)包含起始和終止密碼子的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），兩側(cè)有5'和3'的非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），通常還包括一個(gè)5'帽子和3' poly（A）尾。帽子可通過(guò)酶添加到mRNA 上或在體外轉(zhuǎn)錄中使用適當(dāng)?shù)拿弊宇?lèi)似物，同樣，3' poly（A）尾也可編碼在DNA 模板中或在體外轉(zhuǎn)錄后通過(guò)酶的方式添加。

目前處于臨床開(kāi)發(fā)最前沿的mRNA 疫苗或廣泛用于預(yù)防新冠病毒的mRNA 疫苗是通過(guò)酶的方式制備，這種方式不同于其他多數(shù)生物制品，其產(chǎn)生免疫原性的mRNA 是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成的，并利用合適的遞送系統(tǒng)將mRNA 運(yùn)輸進(jìn)入人體，依靠細(xì)胞自身的翻譯系統(tǒng)將mRNA翻譯成目標(biāo)蛋白，從而達(dá)到臨床治療或預(yù)防的目的。

1.2 mRNA 的結(jié)構(gòu)元件

如上所述，體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA 一般包括帽子結(jié)構(gòu)、UTR、編碼抗原蛋白的ORF 和poly（A）尾等結(jié)構(gòu)元件，這些結(jié)構(gòu)元件對(duì)于維持mRNA 的穩(wěn)定性和調(diào)控翻譯能力均至關(guān)重要。帽子結(jié)構(gòu)類(lèi)似于真核細(xì)胞中的帽子，包含一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷，通過(guò)三磷酸橋接到mRNA 的5'端。其作用是阻止mRNA 被細(xì)胞中識(shí)別病毒RNA 的傳感器識(shí)別，避免不必要的免疫應(yīng)答，并保護(hù)mRNA 不被核酸外切酶降解[11]。poly（A）尾可以間接影響mRNA 翻譯和半衰期，其通常與帽子、poly（A）結(jié)合蛋白和翻譯起始因子蛋白協(xié)作，使mRNA 環(huán)化，并招募核糖體啟動(dòng)翻譯[11-12]。在該過(guò)程中，poly（A）尾的長(zhǎng)度（100～150bp）至關(guān)重要，其長(zhǎng)度需要確保能夠與poly（A）結(jié)合蛋白相互作用，形成必要復(fù)合物，從而啟動(dòng)翻譯[12-13]和保護(hù)帽子不被脫帽酶降解[14]。編碼區(qū)兩側(cè)的UTR 用于調(diào)控mRNA 的翻譯、半衰期和亞細(xì)胞定位[11，15]，通常來(lái)源于高表達(dá)基因中的UTR，如α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因，是合成mRNAs 的首選[16]。但UTR 的作用因細(xì)胞類(lèi)型而異，需要結(jié)合預(yù)期用途和細(xì)胞類(lèi)型對(duì)UTR 進(jìn)行有針對(duì)性的修飾[17-19]，以減少mRNA 的降解，這些修飾包括去除miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)[17-19]和3' UTR中富含腺苷酸和尿苷酸的區(qū)域[20]。ORF 作為最重要的結(jié)構(gòu)元件，其主要功能是編碼翻譯蛋白質(zhì)的序列。對(duì)于自擴(kuò)增mRNA（self-amplifying mRNA，samRNA），其編碼區(qū)除能編碼目的抗原外，還能編碼特定病毒（如甲病毒）的非結(jié)構(gòu)性蛋白，其可與抗原在同一分子上，也可在單獨(dú)分子上。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，這些ORFs 將合成具有病毒復(fù)制機(jī)制的蛋白，使細(xì)胞產(chǎn)生多個(gè)編碼抗原蛋白的mRNA，從而潛在地增加疫苗的效力[21]。

1.3 遞送mRNA 疫苗載體

為確保不被核酸酶降解，mRNA 被整合到具有保護(hù)性脂質(zhì)，并在進(jìn)入目的細(xì)胞后及時(shí)釋放。目前，脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）是臨床進(jìn)展最快的mRNA 遞送技術(shù)，所有獲得授權(quán)使用的新冠mRNA 疫苗均采用LNPs 作為載體。LNPs 由多種脂質(zhì)組成，其成份包括但不限于可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)（如磷脂和/或膽固醇）和通過(guò)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的脂質(zhì)。陽(yáng)離子脂質(zhì)通常攜帶正電荷，可以促使與帶有負(fù)電荷的mRNA 結(jié)合，易于遞送，但其明顯的缺點(diǎn)是會(huì)誘發(fā)毒性促細(xì)胞凋亡和促炎癥反應(yīng)[22-23]，而后續(xù)開(kāi)發(fā)的可電離脂質(zhì)則完美地解決了這些問(wèn)題，并在mRNA 的包封和遞送中發(fā)揮了重要作用。可電離脂質(zhì)在生理pH 時(shí)呈中性，避免陽(yáng)離子脂質(zhì)所存在的安全性問(wèn)題，同時(shí)延長(zhǎng)了在血液循環(huán)中的駐留時(shí)間[24]。當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝原h(huán)境時(shí)，可電離脂質(zhì)又轉(zhuǎn)為正電性，可以促使其與mRNA 結(jié)合生成LNPs。同時(shí)，當(dāng)被細(xì)胞攝取進(jìn)入內(nèi)體后，內(nèi)體的酸性環(huán)境會(huì)讓其重新攜帶正電荷，從而促進(jìn)與內(nèi)體細(xì)胞膜的融合，將mRNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中[22-23]。膽固醇是一種天然形成的脂質(zhì)，通過(guò)填補(bǔ)脂質(zhì)間的空隙來(lái)增強(qiáng)納米顆粒的穩(wěn)定性，并在細(xì)胞攝取時(shí)幫助脂質(zhì)體與內(nèi)體細(xì)胞膜的融合[25]。輔助脂質(zhì)分子調(diào)節(jié)納米顆粒的流動(dòng)性，并且輔助與內(nèi)體的細(xì)胞膜融合[26-27]。PEG 修飾的脂質(zhì)成份提高LNPs 的穩(wěn)定性，而且通過(guò)限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒的大小[28]，并通過(guò)減少與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用來(lái)提高納米顆粒的半衰期[29]。

2 WHO 評(píng)價(jià)mRNA 疫苗設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的指導(dǎo)性文件

隨著新冠候選疫苗的臨床試驗(yàn)進(jìn)展迅速，已有多個(gè)mRNA 疫苗產(chǎn)品獲批上市并廣泛使用，這迫切需要世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）出具指南對(duì)人用預(yù)防傳染病mRNA 疫苗的質(zhì)量、安全性和有效性進(jìn)行評(píng)估。為此，WHO 經(jīng)過(guò)多次修訂和征求意見(jiàn)，于2021年10月22日在生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專(zhuān)家委員會(huì)（Expert Committee Biological Standardization，ECBS）第74 屆會(huì)議上審議通過(guò)了《關(guān)于預(yù)防傳染病mRNA 疫苗質(zhì)量、安全性及有效性評(píng)估的法規(guī)考慮》[2]，該指導(dǎo)性文件不僅為mRNA 疫苗設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供了指導(dǎo)，還明確了mRNA 疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制、臨床和非臨床中安全性和有效性評(píng)價(jià)的相關(guān)考慮要點(diǎn)，同時(shí)也促進(jìn)了該類(lèi)疫苗全球采購(gòu)和流通使用。

鑒于目前對(duì)mRNA 技術(shù)的作用機(jī)制了解尚少，各企業(yè)的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)甚至檢測(cè)方法等還沒(méi)有完全公開(kāi)，臨床前和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)還有限，而且該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展和更新也非常迅速，安全性和有效性也需要較長(zhǎng)時(shí)間的觀(guān)察等因素，并考慮到當(dāng)前新冠肺炎疫情大流行以及新冠mRNA 疫苗的研發(fā)速度，此次WHO 制定的“法規(guī)考慮”不同于以往的“指導(dǎo)原則”，其僅針對(duì)LNPs 包封mRNA 和sa-mRNA 在體內(nèi)遞送與傳染病預(yù)防主動(dòng)免疫相關(guān)目的抗原編碼序列的情形，并以新冠mRNA 疫苗作為示例，旨在盡快為此類(lèi)疫苗研發(fā)提供指導(dǎo)，同時(shí)還兼顧了需要開(kāi)發(fā)的多價(jià)mRNA 疫苗或針對(duì)某些病原體（如流感病毒或SARS-CoV-2）改變現(xiàn)有疫苗株的考慮要點(diǎn)。同時(shí)，作為一項(xiàng)新興的技術(shù)，WHO 建議每種mRNA 疫苗都要從其收益和風(fēng)險(xiǎn)角度進(jìn)行評(píng)估，并結(jié)合現(xiàn)行WHO 關(guān)于疫苗非臨床評(píng)價(jià)[30]、臨床評(píng)價(jià)[31]、疫苗佐劑和含佐劑疫苗非臨床評(píng)價(jià)[32]、藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[33]和生物制品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[34]等多個(gè)指導(dǎo)原則共同考慮。

3 WHO 評(píng)價(jià)mRNA 疫苗設(shè)計(jì)中的考慮要點(diǎn)

ICH Q8 提出質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）的藥品質(zhì)量管理理念，即藥物開(kāi)發(fā)的目的是設(shè)計(jì)出高質(zhì)量的產(chǎn)品[35]。因此，WHO認(rèn)為評(píng)估m(xù)RNA 疫苗設(shè)計(jì)是否合理，應(yīng)從其質(zhì)量、安全性和有效性等方面考慮，并結(jié)合mRNA 技術(shù)的特性，著重關(guān)注以下方面：mRNA 固有免疫、理化和結(jié)構(gòu)特性；遞送系統(tǒng)的適宜性，即能否確保mRNA 的體內(nèi)穩(wěn)定性和遞送效率；新型無(wú)細(xì)胞的酶工藝生產(chǎn)特點(diǎn)，如對(duì)線(xiàn)性DNA 模板和雜質(zhì)的控制。這些要點(diǎn)對(duì)于mRNA 疫苗的質(zhì)量、安全性和有效性至關(guān)重要。

3.1 對(duì)mRNA 固有免疫、理化和結(jié)構(gòu)特性的考慮要點(diǎn)

免疫原性是由mRNA 所編碼的目的抗原所引起的，這是mRNA 疫苗極為重要的一項(xiàng)特征。因此，應(yīng)首先關(guān)注mRNA 的相關(guān)生物學(xué)特性，包括mRNA 觸發(fā)固有免疫應(yīng)答以及目的抗原特異性應(yīng)答的能力，免疫應(yīng)答的質(zhì)量、數(shù)量和偏差[如1 型輔助性T 細(xì)胞（Th1）或Th2 細(xì)胞表型]和體內(nèi)穩(wěn)定性，同時(shí)并獲悉與特定病原體和疾病相關(guān)的免疫類(lèi)型的信息（保護(hù)性和免疫致病性），以驗(yàn)證疫苗設(shè)計(jì)的合理性。

其次，對(duì)目的抗原的選擇是評(píng)價(jià)mRNA 疫苗開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，應(yīng)明確目的抗原的選擇依據(jù)、抗原序列元件結(jié)構(gòu)及其表達(dá)蛋白對(duì)疫苗作用機(jī)制的貢獻(xiàn)，包括所有ORF（預(yù)期外ORF）和其他序列元件的完整序列和注釋?zhuān)瑢?duì)特定的或特別設(shè)計(jì)的非編碼序列[poly（A）尾]和結(jié)構(gòu)元件（如5'帽子或替代物）應(yīng)提供合理理由。對(duì)于sa-mRNA，應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明所有編碼在疫苗結(jié)構(gòu)中用于mRNA 遞送后在人體細(xì)胞中擴(kuò)增的病毒復(fù)制子基因。應(yīng)指出編碼在mRNA中的每段基因序列和特定的非編碼和結(jié)構(gòu)元件的預(yù)期功能和目的，說(shuō)明其對(duì)整體作用機(jī)制的貢獻(xiàn)。

結(jié)構(gòu)特征方面，RNA 通常以單鏈存在，但在體外轉(zhuǎn)錄中也可能形成由短雙鏈片段和中間各種單鏈環(huán)組成的雙鏈RNA(dsRNA)，這類(lèi)dsRNA 作為某些RNA 病毒基因組的一種呈現(xiàn)形式，能夠被細(xì)胞內(nèi)的受體感知，誘導(dǎo)細(xì)胞激發(fā)免疫應(yīng)答作為對(duì)病毒感染的固有反應(yīng)。對(duì)于此類(lèi)免疫應(yīng)答，需要在疫苗設(shè)計(jì)、非臨床研究和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行定性。此外，不同的mRNA 會(huì)導(dǎo)致所形成的LNPsmRNA 的顆粒大小、形態(tài)、表面性質(zhì)（如電荷）和包封率的不同，這取決于mRNA 的長(zhǎng)度、二級(jí)結(jié)構(gòu)和LNPs中的脂質(zhì)成份。因此，有必要同時(shí)對(duì)mRNA 和LNPs 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性和理化特性進(jìn)行考慮，以便人們更加了解成品制劑所期待的特性。

3.2 對(duì)LNPs 的考慮要點(diǎn)

對(duì)于LNPs，應(yīng)明確所有可能影響疫苗安全性、免疫原性和有效性的特征。首先，脂質(zhì)來(lái)源和質(zhì)量信息應(yīng)足夠詳細(xì)，特別是在LNPs中含有未開(kāi)展過(guò)非臨床或臨床研究的新型脂質(zhì)，以便對(duì)其安全性和質(zhì)量進(jìn)行有意義的評(píng)價(jià)。例如，對(duì)含有陽(yáng)離子脂質(zhì)的LNPs，在可行的情況下，應(yīng)提供其生產(chǎn)工藝和檢定的詳細(xì)信息，包括起始材料和任何中間產(chǎn)物的信息和相關(guān)論證。如果適用，還應(yīng)考慮對(duì)（陽(yáng)離子）脂質(zhì)進(jìn)行亞硝胺風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。此外，由于PEG 化脂質(zhì)可增強(qiáng)LNPs 體內(nèi)穩(wěn)定性和細(xì)胞相互作用[36]，應(yīng)對(duì)PEG 化脂質(zhì)的分子量、多分散性和分子百分比進(jìn)行充分檢定。其次，應(yīng)對(duì)包封技術(shù)和生產(chǎn)工藝進(jìn)行不斷探索和優(yōu)化，如考慮不同脂質(zhì)的濃度、mRNA-脂質(zhì)比、緩沖劑/溶劑的pH、mRNA 包裹效率、mRNA 和脂質(zhì)的流速和混合率，以及不同成份的解凍溫度，以實(shí)現(xiàn)對(duì)mRNA 包裹進(jìn)入LNPs 的過(guò)程進(jìn)行細(xì)致控制。同時(shí)，還應(yīng)對(duì)LNPs-mRNA 及其在目的細(xì)胞中的攝取進(jìn)行充分研究，包括了解合成LNPs-mRNA 的表面化學(xué)、大小、多分散性、形狀、電荷和蛋白質(zhì)結(jié)合特性，確保對(duì)mRNA 的充分保護(hù)和疫苗達(dá)到必要穩(wěn)定性。此外，有些LNPs 根據(jù)其成份也可能具有免疫調(diào)節(jié)作用[37-39]，應(yīng)明確其潛在的收益和不良反應(yīng)的相關(guān)信息，并在關(guān)鍵質(zhì)量屬性、非臨床和臨床評(píng)價(jià)中加以考慮。

3.3 對(duì)線(xiàn)性DNA 模板的考慮要點(diǎn)

線(xiàn)性DNA 模板被認(rèn)為是mRNA 合成的起始材料。應(yīng)明確線(xiàn)性DNA 模板的來(lái)源和原材料，對(duì)于動(dòng)物（包括人類(lèi)）來(lái)源的成份應(yīng)特別注意。對(duì)于已有證據(jù)證明或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的具有潛在外源因子的起始材料應(yīng)確保已去除或加以控制。此外，需要特別注意的是，盡管mRNA 疫苗生產(chǎn)的起始材料是線(xiàn)性DNA 模板，但其可能來(lái)源于上游材料，如重組細(xì)胞庫(kù)中擴(kuò)增的DNA 質(zhì)粒。為此，應(yīng)建立細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)，說(shuō)明微生物負(fù)荷測(cè)定和鑒別情況，并驗(yàn)證種子庫(kù)的遺傳穩(wěn)定性。如果poly（A）尾編碼在質(zhì)粒DNA 上，則應(yīng)特別測(cè)定DNA 質(zhì)粒上該區(qū)域的重組率。此外，應(yīng)通過(guò)純化工藝減少DNA 質(zhì)粒中的雜質(zhì)。

3.4 對(duì)雜質(zhì)控制的考慮要點(diǎn)

對(duì)于潛在雜質(zhì)，如起始材料中引入的雜質(zhì)，以及mRNA 純化中產(chǎn)品相關(guān)或工藝相關(guān)的雜質(zhì)，應(yīng)進(jìn)行描述和研究。這些雜質(zhì)一般包括：細(xì)菌宿主細(xì)胞殘留蛋白、殘留RNA 和染色體DNA（如用于生產(chǎn)DNA 模板）、內(nèi)毒素、酶（如DNA 和RNA 聚合酶和限制性?xún)?nèi)切酶）、未結(jié)合的核苷、dsRNA、不完整或不同大小的RNA，以及其他生產(chǎn)工藝中所用的材料。應(yīng)提供mRNA 純化后所含雜質(zhì)的數(shù)據(jù)，用于驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置中最大接受范圍或最低能達(dá)到的水平。對(duì)于已知或具有潛在毒性作用的雜質(zhì)和殘余物，應(yīng)開(kāi)展毒理風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。對(duì)包封過(guò)程中所使用的脂質(zhì)產(chǎn)生的潛在（工藝和產(chǎn)品相關(guān)）雜質(zhì)也應(yīng)進(jìn)行定性分析和研究，并對(duì)設(shè)定的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的臨界值進(jìn)行論證，以便能夠?qū)ζ溥m當(dāng)檢定和達(dá)到臨床接受范圍。

3.5 對(duì)sa-mRNA 疫苗的考慮要點(diǎn)

目前，sa-mRNA 也可包封于LNPs中[21]，主要有2種形式：一種是其復(fù)制子與抗原基因在一個(gè)讀碼框中，另一種是其復(fù)制子在單獨(dú)的讀碼框中。2種設(shè)計(jì)中合成的LNPs 顆粒大小和形態(tài)特征可能不同，將導(dǎo)致疫苗不同的安全性和有效性。此外，2種設(shè)計(jì)中的表達(dá)效率、dsRNA 含量、固有免疫應(yīng)答、mRNA 和sa-mRNA 半衰期等方面的差異，會(huì)使達(dá)到相同藥效水平所需的mRNA 總量可能有所不同，也可能導(dǎo)致疫苗安全性的不同，需要在疫苗設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)中加以考慮。另外，相比于病毒復(fù)制子（包裝成病毒結(jié)構(gòu)蛋白），sa-mRNA是通過(guò)LNPs 或其他遞送系統(tǒng)傳遞的，這意味著，細(xì)胞攝取sa-mRNA 可能不同于攝取病毒復(fù)制子，因?yàn)椴《緩?fù)制子是通過(guò)病毒受體進(jìn)入宿主細(xì)胞的，而sa-mRNA 是依靠細(xì)胞內(nèi)的遞送系統(tǒng)，這些因素在sa-mRNA 疫苗設(shè)計(jì)中應(yīng)加以考慮。

4 未來(lái)mRNA 疫苗開(kāi)發(fā)中還需要考慮的問(wèn)題

由于疫苗的作用機(jī)制仍未研究透徹，且病原體仍不斷變異，未來(lái)還需對(duì)疫苗進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn)，而WHO 此次頒布的《關(guān)于預(yù)防傳染病mRNA 疫苗質(zhì)量、安全性及有效性評(píng)估的法規(guī)考慮》中也針對(duì)進(jìn)一步優(yōu)化疫苗，以及開(kāi)發(fā)多價(jià)mRNA 疫苗或針對(duì)某些病原體（如流感病毒或SARS-CoV-2）改變現(xiàn)有疫苗株，提出了相應(yīng)的考慮要點(diǎn)。

4.1 對(duì)優(yōu)化遞送系統(tǒng)的考慮

就當(dāng)前mRNA 疫苗而言，注射部位的各種細(xì)胞類(lèi)型都會(huì)攝取mRNA。然而，未來(lái)的遞送系統(tǒng)可以設(shè)計(jì)成選擇性地將mRNA 靶向特定的細(xì)胞類(lèi)型或組織——如使用表面修飾的LNPs，將靶向配體/基序可以附著在LNPs 表面。任何理化性質(zhì)的改變，都可能導(dǎo)致固有免疫刺激作用的不同，進(jìn)而影響mRNA 或sa-mRNA 疫苗安全性或有效性。此外，鑒于當(dāng)前近乎苛刻的貯運(yùn)條件要求，未來(lái)應(yīng)考慮開(kāi)發(fā)耐熱性更強(qiáng)的疫苗遞送系統(tǒng)，以促進(jìn)全球使用。

4.2 對(duì)疫苗更新的考慮

由于病毒的不斷變異，如何更新疫苗株，確保疫苗持續(xù)達(dá)到對(duì)變異株的最佳保護(hù)效果是研發(fā)者需要考慮的問(wèn)題，通常來(lái)說(shuō)，所選擇的疫苗株應(yīng)在抗原性和基因進(jìn)化方面與流行的毒株相近。對(duì)于mRNA 技術(shù)平臺(tái)，當(dāng)選定適合的目的抗原序列后，其開(kāi)發(fā)的優(yōu)勢(shì)在于如果本質(zhì)上未改變疫苗的生產(chǎn)工藝、檢測(cè)項(xiàng)目或技術(shù)參數(shù)，則此前mRNA 候選疫苗或已獲批產(chǎn)品的數(shù)據(jù)將支持新的mRNA 候選疫苗。例如，某些情況下僅序列的變化，既不影響新mRNA 的大小或二級(jí)結(jié)構(gòu)，也不改變其與LNPs的相互作用，新候選疫苗仍可視為是由平臺(tái)技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品。但需要注意的是，對(duì)每種疫苗的質(zhì)量控制、非臨床和臨床研究以及產(chǎn)品的所有特性均應(yīng)分別考慮[2]。在此過(guò)程中，與監(jiān)管當(dāng)局的早期咨詢(xún)是確?？焖傺邪l(fā)候選疫苗的關(guān)鍵。

4.3 對(duì)多價(jià)/聯(lián)合疫苗的考慮

自新冠肺炎疫情暴發(fā)以來(lái)，先后有Alpha,Beta,Gamma,Delta 和Omicron 5種變異株在全球擴(kuò)散，通常疫苗更新速度往往無(wú)法跟上病毒變異的節(jié)奏。為了更有效地保護(hù)病毒的感染以降低其傳播，同時(shí)誘導(dǎo)更廣譜、更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的免疫應(yīng)答，未來(lái)可能需要開(kāi)發(fā)含有多個(gè)mRNA 編碼不同變異株抗原的多價(jià)疫苗或聯(lián)合疫苗。在多價(jià)疫苗設(shè)計(jì)中，應(yīng)注意每種目的抗原中的mRNA 含量、表達(dá)效率和所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與其他目的抗原的平衡，避免干擾對(duì)所有目的抗原的表達(dá)（進(jìn)而影響免疫應(yīng)答），并確保整個(gè)疫苗的必要菌毒株或抗原的特異性免疫應(yīng)答。同時(shí)，為確保每個(gè)目的抗原適宜的mRNA 劑量，還應(yīng)考慮開(kāi)展適當(dāng)?shù)姆桥R床毒性研究，評(píng)價(jià)mRNA 和LNPs 最高可耐受總劑量，如果適用，應(yīng)結(jié)合過(guò)往臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行論證。

5 結(jié)語(yǔ)

新冠病毒的流行對(duì)生物制品的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，mRNA 候選疫苗具有構(gòu)建和生產(chǎn)速度快等特點(diǎn)，獲得全球科研機(jī)構(gòu)、監(jiān)管機(jī)構(gòu)和工業(yè)界的廣泛關(guān)注。然而，mRNA 疫苗作為全新的技術(shù)路線(xiàn)，目前對(duì)其作用機(jī)制的了解尚不全面，且安全性尚需較長(zhǎng)時(shí)間觀(guān)察，特別是近期的兩項(xiàng)研究分別發(fā)現(xiàn)mRNA 可能導(dǎo)致罕見(jiàn)自身免疫性肝炎的不良反應(yīng)[40]以及存在整合到宿主基因組的遺傳風(fēng)險(xiǎn)[41]，引發(fā)了人們對(duì)其安全性的憂(yōu)慮。因此，未來(lái)隨著更多科學(xué)和臨床數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，還需不斷優(yōu)化和改進(jìn)疫苗的開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)方案。現(xiàn)有 WHO發(fā)布的《關(guān)于預(yù)防傳染病mRNA 疫苗質(zhì)量、安全性及有效性評(píng)估的法規(guī)考慮》是首個(gè)全球性的預(yù)防傳染病mRNA 疫苗的指導(dǎo)性文件，對(duì)評(píng)價(jià)mRNA 疫苗質(zhì)量、安全性及有效性具有重要意義。本文結(jié)合mRNA 技術(shù)特點(diǎn)、WHO 法規(guī)，梳理了現(xiàn)階段評(píng)價(jià)mRNA 疫苗設(shè)計(jì)以及未來(lái)疫苗開(kāi)發(fā)中需要關(guān)注的法規(guī)要點(diǎn)，以期為疫苗研發(fā)企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)評(píng)價(jià)提供參考。

致謝：感謝中國(guó)食品藥品檢定研究院的王軍志院士、李玉華主任對(duì)本研究的貢獻(xiàn)。

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