鐘夢龍，張浩吉，陳祥杰，李復(fù)坤，邱茜茜，李 易，黃福強，王妮娜，余新剛

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231）

十二指腸賈第蟲（Giardiadoudenalis，G.doudenalis），簡稱賈第蟲，又稱藍氏賈第鞭毛蟲（Giardialamblia），是一種寄生于宿主十二指腸的寄生性原蟲，可感染人類、野生動物、家畜和犬貓等，常引起消化不良、腹痛和腹瀉等癥狀[1-2]，而且賈第蟲病對兒童的生長發(fā)育和認(rèn)知能力有重要影響，被世界衛(wèi)生組織列為危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一[3]。

按照基因型的不同，賈第蟲可分為8個集聚體（A～H），集聚體A和B可感染人類和多種哺乳動物，引起人獸共患病，集聚體C～H表現(xiàn)出一定的宿主特異性，集聚體C和D多感染犬，集聚體E多感染豬和反芻動物，集聚體F多感染貓，集聚體G和H分別感染嚙齒類動物和海豹[4]。但是近年來也發(fā)現(xiàn)了不同集聚體跨宿主傳播的事例，如在賈第蟲患者人群中發(fā)現(xiàn)了集聚體C、E和F的感染[5-7]。更有報道顯示，在人類與動物密切接觸的地區(qū)，已發(fā)現(xiàn)賈第蟲在人與動物之間相互傳播[8-9]。

目前中國對賈第蟲的研究主要集中在人、牛、羊和伴侶動物等[10-12]，對豬賈第蟲的研究資料較少。感染賈第蟲的豬糞便中常含有大量的感染性包囊，這些感染性包囊能通過水源或其他途徑造成環(huán)境污染，進而可引起人類或其他動物感染。廣東省是中國養(yǎng)豬大省，掌握廣東省各地區(qū)豬群中賈第蟲的感染現(xiàn)狀，并進一步研究其基因型的分布特征，不僅能為賈第蟲病的防控提供基礎(chǔ)資料，而且具有一定公共衛(wèi)生意義。本試驗通過巢式PCR（nested-PCR）擴增谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，gdh）基因，并進行序列分析，對廣東不同地區(qū)豬源賈第蟲的基因型進行鑒定，以期為豬群賈第蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

PremixTaqTMVersion 2.0 plus dye、DL2000 DNA Marker均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；E.Z.N.A. Stool DNA Kit（D4015-02） 購自O(shè)MEGA Bio-Tek公司。

梯度基因擴增儀購自Biometra 公司；電泳儀、水平電泳槽購自Bio-Rad公司；江南光學(xué)顯微鏡（NLCD500）購自江南光電股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2019年12月-2021年6月，分別從廣東省清遠、佛山、茂名、江門、肇慶、陽江、河源、韶關(guān)、廣州和惠州部分豬場共采集521份新鮮豬糞樣品，其中斷奶仔豬（21～60 d）糞便樣品203份，育肥豬（61～180 d）208份，母豬（>180 d）110份，每份樣品約30 g，單獨裝入潔凈密封袋，標(biāo)明采集地、性別、年齡和編號，樣品低溫保存于泡沫箱并當(dāng)天運送至實驗室，4 ℃保存待檢。

1.2.2 顯微鏡檢測 取6 g新鮮糞便樣品，加入2倍體積的雙蒸水混勻后經(jīng)200目網(wǎng)篩過濾，濾液3 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀加入4倍體積的33%硫酸鋅溶液重懸，1 500 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)至另一個離心管，加入4倍體積ddH2O稀釋，混勻后3 000 r/min離心5 min，棄上清，剩余1 mL上清重懸沉淀，取適量懸液滴加在載玻片中，加入適量盧戈氏碘液染色，于顯微鏡下鏡檢。

1.2.3 樣品DNA提取 取糞便樣品200 mg置于2 mL離心管中，按照糞便DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 賈第蟲gdh基因巢式PCR擴增 參照文獻報道[13]的方法設(shè)計gdh基因巢式PCR引物，第一輪PCR上游引物Ghd1：5′-TTCCGTRTYCA-GTACAACTC-3′，下游引物Gdh2：5′-ACCTCG-TTCTGRGTGGCGCA-3′；第二輪PCR上游引物Gdh3：5′-ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT-3′，下游引物Gdh4：5′-GTGGCGCARGGCATGAT-GCA-3′。引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系均為25 μL：2× rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序均為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，并拍照記錄。所有陽性樣品均進行2次巢式PCR檢測。

1.2.5 測序及遺傳特性分析 將所有g(shù)dh基因陽性的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測序。所獲序列進行BLAST比對，并應(yīng)用MegAlign程序與NCBI獲得的參考序列進行比對，確定賈第蟲的基因型；運用Mega 7.0軟件的最大似然法構(gòu)建進化樹。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0中的χ2檢驗的方法分析不同年齡段豬賈第蟲感染率的差異性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡觀察結(jié)果

經(jīng)顯微鏡鏡檢，可見賈第蟲包囊呈橢圓形，囊壁較厚，大小為（10～14）μm ×（7～10）μm，具有明顯縱向軸柱，細胞核分布于軸柱兩側(cè)（圖1）。

圖1 顯微鏡觀察結(jié)果（400×）Fig.1 The results of microscopic observation （400×）

2.2 豬賈第蟲陽性率調(diào)查結(jié)果

基于gdh基因的巢式PCR擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在521份豬糞樣品中，有94份樣品于530 bp處有清晰可見的目的條帶（圖2），賈第蟲陽性率為18.04%。不同地區(qū)豬群賈第蟲的陽性率明顯不同（表1），陽性率在3.90%～40.00%之間，其中茂名豬賈第蟲陽性率最高，達40.00%；肇慶樣品豬賈第蟲陽性率最低，為3.90%。

M,DL2000 DNA Marker;1～27,樣品；N，陰性對照；P，陽性對照M,DL2000 DNA Marker;1-27,Samples;N,Negative control;P,Positive control圖2 部分樣品賈第蟲gdh基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of gdh gene of Giardia duodenalis in partial sample

表1 廣東省不同地區(qū)豬賈第蟲陽性率Table 1 Positive rates of Giardia duodenalis in pigs in different areas in Guangdong province

2.3 不同飼養(yǎng)階段豬賈第蟲陽性率調(diào)查結(jié)果

不同飼養(yǎng)階段豬賈第蟲陽性率統(tǒng)計結(jié)果見表2，母豬的賈第蟲陽性率顯著高于斷奶仔豬（P<0.05），與育肥豬的賈第蟲陽性率差異不顯著（P>0.05）。

表2 廣東省不同飼養(yǎng)階段豬賈第蟲陽性率Table 2 Positive rates of Giardia duodenalis in pigs in different feeding stages in Guangdong province

2.4 豬賈第蟲基因分型結(jié)果

將gdh基因的PCR陽性樣品進行測序，共獲得94條賈第蟲gdh序列，經(jīng)BLAST比對，結(jié)果形成5個不同基因亞型（表3）。以賈第蟲分離株TX443gdh基因（登錄號：MK645799）為參考序列，有58份樣品相似性為95%～100%，為集聚體AⅠ亞型。以賈第蟲分離株HY32和ECUST20410gdh基因（登錄號：MK645797、KY633476）為參考序列，有30份樣品的相似性在95%～100%之間，為集聚體E1亞型。以賈第蟲分離株QQ1gdh基因（登錄號：KT698971）為參考序列，有3份樣品的相似性均為99%以上，為集聚體E10亞型。以賈第蟲gdh基因（登錄號：MK881605）為參考序列，有2份樣品的相似性為99%和100%，為集聚體E2亞型；以賈第蟲分離株MSZ-96gdh基因（登錄號：MH621339）為參考序列，有1份樣品相似性為97%，為集聚體E13亞型。

表3 廣東省不同地區(qū)豬賈第蟲基因分型結(jié)果Table 3 Genotyping results of Giardia duodenalis in pigs in different areas of Guangdong province

惠州以集聚體E1為優(yōu)勢亞集聚體，廣州、佛山等其他地區(qū)均以AⅠ為優(yōu)勢亞集聚體。在不同飼養(yǎng)階段的豬群中，斷奶仔豬和育肥豬以AⅠ為優(yōu)勢亞集聚體，而母豬則以E1為優(yōu)勢亞集聚體。

2.5 系統(tǒng)進化分析

選擇上述gdh基因測序5個亞型的代表性序列，其中每個亞型各1條序列，以蒼鷺賈第蟲（Giardiaardeae）gdh基因序列（登錄號：AF069060）為外群，構(gòu)建遺傳進化樹（圖3）。58個樣品的代表序列AⅠ與集聚體A為一群，其他36個樣品的4條代表序列與集聚體E為一群。

圖3 豬賈第蟲gdh基因序列遺傳進化樹Fig.3 Genetic evolution tree of gdh gene sequence of Giardia duodenalis in pig

3 討 論

十二指腸賈第蟲是近些年來國內(nèi)外學(xué)者非常關(guān)注的腸道寄生性原蟲。越來越多的報道顯示，賈第蟲是豬常見的腸道寄生性原蟲，但不同國家和地區(qū)的賈第蟲的陽性率具有一定的差異，如韓國豬賈第蟲的陽性率為14.8%[14]、加拿大為66.4%[15]、英國為57.1%[16]、美國為7.4%[17]；國內(nèi)豬賈第蟲的陽性率最低為1.6%[18]，最高為26.9%[19]。本次對廣東省10個地區(qū)的調(diào)查顯示，在受檢的521份樣品中，賈第蟲的陽性率達18.04%，其中不同地區(qū)和不同飼養(yǎng)階段豬群的陽性率皆存在差異，如茂名豬賈第蟲陽性率高達40.00%，肇慶的陽性率僅為3.90%；而且育肥豬（19.23%）和母豬（24.55%）的賈第蟲陽性率均高于仔豬（13.30%）。這些結(jié)果說明廣東省豬群賈第蟲的感染比較普遍，而且隨著豬年齡的增長，賈第蟲的陽性率有升高的趨勢。

賈第蟲有8個集聚體（A～H），宿主范圍廣泛，包括人、哺乳動物及鳥類。不同集聚體的賈第蟲感染的宿主存在一定的差異[4]。集聚體A和B具有廣泛宿主，可通過污染水源感染人類和多種哺乳動物，其他集聚體多表現(xiàn)出一定的宿主特異性。因此，研究豬源賈第蟲的分子特征，進一步進行基因分型，具有重要的公共衛(wèi)生意義。Wang等[20]報道集聚體E為豬源賈第蟲的優(yōu)勢集聚體，但在上海和陜西等地區(qū)也有關(guān)于豬感染人畜共患性集聚體A的報道[19,21]。本研究基于gdh基因的序列特征，選擇獲得的代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中58份樣品屬于集聚體AⅠ亞型，占測序陽性樣品的61.70%（58/94），另外36份樣品屬于集聚體E的不同亞型。對不同年齡段的豬樣品進行基因分型分析顯示，斷奶仔豬和育肥豬均以AⅠ為優(yōu)勢亞集聚體，而母豬則以E1為優(yōu)勢亞集聚體。

賈第蟲是一種重要的機會致病寄生性原蟲，生產(chǎn)及生活污水等導(dǎo)致的水源污染是引起賈第蟲病流行的重要途徑，人吞食10個具有活力的包囊即可感染[22]。人賈第蟲病流行病學(xué)資料顯示,中國人群賈第蟲感染率近年來在0.16%～6.75%，沿海地區(qū)和西部地區(qū)的感染率相對較高[23]。姚月嫻等[24]報道廣州腹瀉兒童的賈第蟲感染率為4.6%（16/348），檢出的16份陽性樣本中有14份屬于A型集聚體（9份AⅠ亞型，5份AⅡ亞型），2份為B型集聚體。目前，在中國人群中發(fā)現(xiàn)的賈第蟲有集聚體A、B和C，其中以集聚體A為主[5,23-24]。雖然集聚體E一般認(rèn)為具有宿主特異性，但也有感染人的報道[5]。本研究在廣東省豬群中檢出94份陽性糞便樣本，其中61.70%（58/94）屬于人獸共患的集聚體AⅠ亞型，38.30%（36/94）屬于集聚體E的不同亞型，表明本地區(qū)豬群中的賈第蟲具有人獸跨物種傳播能力。華南地區(qū)雨水充沛，廣東省河流眾多且縱橫交錯，南方地區(qū)農(nóng)村供水水源調(diào)查顯示，賈第蟲包囊的檢出率曾經(jīng)達33.33%[25]。長期在豬養(yǎng)殖場、屠宰場的工人或其所在水域附近的居民具有感染賈第蟲的風(fēng)險，因此有必要對附近人群及水源進一步開展賈第蟲流行病學(xué)調(diào)查，同時要警惕豬源十二指腸賈第蟲可能引起的公共衛(wèi)生問題。

4 結(jié) 論

廣東省豬群豬十二指腸賈第蟲的感染較為普遍，總體陽性率達18.04%，不同地區(qū)豬群的陽性率在6.49%～40%之間；其中母豬群和育肥豬群的陽性率分別為24.55%和19.23%，高于斷奶仔豬的陽性率13.30%。基于gdh基因特征分析，本研究共獲得5個不同的集聚體亞型，其中58份樣品屬于人獸共患性集聚體AⅠ，36份樣品屬于集聚體E的4個不同亞型。結(jié)果表明，廣東省豬源賈第蟲存在人獸跨物種傳播的風(fēng)險，應(yīng)重視該病可能引起的公共衛(wèi)生問題。