朱道仙 ， 劉 莉 , 趙學(xué)剛 ， 陸 江 ， 盧 煒 ， 劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 泰州 225300 ； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院 ， 江蘇 泰州 225300)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)表現(xiàn)為腎功能減退，代謝廢物潴溜，水、電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)，以及與腎臟有關(guān)的多種內(nèi)分泌功能失調(diào)，以至于不能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而引發(fā)的臨床綜合征[1]。近年來，寵物犬的慢性腎衰竭發(fā)病率逐年上升，治療費(fèi)用較高，治療效果較差，對(duì)寵物診療工作者和寵物主人均產(chǎn)生了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。微炎癥狀態(tài)是指機(jī)體內(nèi)存在低水平、持續(xù)性的炎癥狀態(tài)，但無炎癥表現(xiàn)，表現(xiàn)為促炎因子(如IL-1、IL-6及TNF-ɑ等)升高。大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷與微炎癥狀態(tài)是慢性腎衰竭發(fā)生發(fā)展的重要因素，并且與預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。大黃素是中藥大黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素對(duì)不同動(dòng)物的CRF治療效果不一，對(duì)人的CRF具有一定療效[5]，而對(duì)貓的CRF無治療價(jià)值[6]。大黃素是否可通過抑制氧化應(yīng)激和微炎癥狀態(tài)改善犬的CRF未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過收集犬CRF臨床病例并給予大黃素進(jìn)行干預(yù)治療，探討大黃素對(duì)CRF患犬氧化應(yīng)激和微炎癥狀態(tài)的影響，為大黃素在犬腎臟疾病中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2018年1月—2019年7月于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)寵物醫(yī)院就診的按國際腎病研究協(xié)會(huì)(IRIS)犬貓慢性腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]診斷為慢性腎衰竭的患犬47例。所有用于研究病例的主人均對(duì)本試驗(yàn)計(jì)劃有詳細(xì)的了解，并簽署知情同意書。

1.2 試驗(yàn)方法 按隨機(jī)數(shù)字表法將47例病例隨機(jī)分成4個(gè)治療組：常規(guī)治療組(UT組，n=8)、低劑量大黃素治療組(LRT組，n=12)、中劑量大黃素治療組(MRT組，n=12)和高劑量大黃素治療組(HRT組，n=15)；同時(shí)選擇10例健康犬作為對(duì)照組(CG組)。UT組患犬治療方案為口服復(fù)方α-酮酸片(河北天成藥業(yè)有限公司，1片/次，2 次/d)+自由采食腎臟處方糧(上海信元?jiǎng)游锼幤酚邢薰旧a(chǎn))；LRT組、MRT組和HRT組分別在UT組治療基礎(chǔ)上按25、50 mg/(kg·bw·d)和100 mg/(kg·bw·d)口服大黃素(西安嘉和生物技術(shù)有限公司，大黃素含量≥98%)。治療期間所有動(dòng)物自由飲食，試驗(yàn)期15 d。

1.3 樣本采集與指標(biāo)測定 治療前和治療后，空腹采集血液用ELISA法檢測血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平；化學(xué)比色法測定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)；ELISA檢測血清炎癥因子C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。同時(shí)采集尿液用ELISA檢測尿8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)、肌酐(Cr)和尿腎臟損傷因子-1(KIM-1)含量。尿中8-OH-dG濃度的最終數(shù)值采用Cr值較正，單位為ng/mg Cr。

1.4 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA程序單因素方差分析進(jìn)行組間比較，治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，分類資料用卡方檢測，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。各檢測指標(biāo)的變化幅度=(治療后水平-治療前水平)/治療前水平×100%。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)CRF患犬腎功能的影響 結(jié)果如圖1所示，各治療組的Scr、BUN和KIM-1水平治療后均低于治療前(P<0.05)。治療后比較，HRT組Scr水平低于MRT組、LRT組和UT組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組≥LRT組≥UT組(圖1A)；HRT組BUN水平低于其他3個(gè)治療組(P<0.05)， MRT組BUN低于LRT組和UT組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組>LRT組≥UT組(圖1B)；HRT組KIM-1水平低于其他3個(gè)治療組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組≥LRT組>UT組(圖1C)。

圖1 各組犬腎功能指標(biāo)的變化

2.2 大黃素對(duì)CRF患犬氧化應(yīng)激水平的影響 治療后的結(jié)果如表1所示，與UT組比較，HRT組血清MDA和尿液8-OH-dG水平均顯著降低(P<0.05)，血清SOD和T-AOC水平均顯著升高(P<0.05)，LRT組和MRT組僅MDA水平顯著降低(P<0.05)，但各治療組的MDA、SOD、T-AOC和8-OH-dG水平均與CG組存在顯著差異(P<0.05)。經(jīng)過治療，HRT組的MDA和8-OH-dG水平比治療前分別降低了38.6% 和17.2%，SOD和T-AOC水平比治療前分別升高了19.3%和18.6%，與其他治療組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2A)。

表1 治療后各組氧化應(yīng)激水平的比較

2.3 大黃素對(duì)CRF患犬血清炎癥因子水平的影響 治療后的結(jié)果如表2所示，HRT組的CRP水平顯著低于LRT組和UT組，IL-6、TNF-α水平顯著低于MRT組、LRT組和UT組(P<0.05)；MRT組CRP、IL-6和TNF-α水平均低于UT組(P<0.05)；但各治療組CRP、IL-6和TNF-α水平均顯著高于CG組(P<0.05)。 經(jīng)過治療，HRT組的CRP、IL-6和TNF-α水平較治療前分別降低了40.5%、47.1%和48.2%，與其他治療組均有顯著差異(P<0.05，圖2B)。

圖2 各治療組治療后氧化應(yīng)激與炎癥因子水平的變化程度

表2 治療后各組血清炎癥因子的變化

2.4 腎功能指標(biāo)與氧化應(yīng)激及炎癥因子的相關(guān)性分析 通過Pearson分析腎功能指標(biāo)與氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Scr、BUN和KIM-1等腎功能指標(biāo)均與MDA、CRP、IL-6、TNF-α和8-OH-dG呈正相關(guān)關(guān)系，Scr、KIM-1與SOD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,BUN與SOD、T-AOC均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3)。

圖3 腎功能指標(biāo)與氧化應(yīng)激及炎癥因子相關(guān)性熱圖

3 討論

Scr和BUN分別為肌肉組織代謝終產(chǎn)物和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，由腎小球?yàn)V過而排出體外，當(dāng)患者腎功能不全時(shí)，血清中兩者含量將會(huì)升高，因此檢測血清中Scr和BUN的含量即可反映腎小球?yàn)V過功能[8-9]。KIM-1是腎臟近曲小管上皮細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，在正常肝、脾、腎等組織微量表達(dá)，而在受損后的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，是腎小管損傷的重要標(biāo)志物[10]。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腎損傷指標(biāo)Scr、BUN和KIM-1與氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、微炎癥指標(biāo)CRP、IL-6和TNF-α等呈正相關(guān)，提示犬慢性腎衰的發(fā)生發(fā)展可能與氧化應(yīng)激和微炎癥狀態(tài)有關(guān)。

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受各種有害刺激后，體內(nèi)氧化和抗氧化之間的平衡被破壞，引起過多的氧化產(chǎn)物釋放，導(dǎo)致組織損傷。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激對(duì)于腎衰竭的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，且隨著腎功能損傷嚴(yán)重程度的增加，機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激程度亦增強(qiáng)[11]。SOD、T-AOC對(duì)氧化應(yīng)激起到防御作用，MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用的中間產(chǎn)物，這些指標(biāo)變化反映了機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[12-13]。研究表明，慢性腎衰竭可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低且MDA含量增加，從而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃素可以增加SOD和T-AOC活性，降低MDA含量，改善CRF犬的氧化應(yīng)激水平。

微炎癥狀態(tài)指以單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活為中心的慢性、持繼性炎癥發(fā)應(yīng)，主要以CRP、IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的高表達(dá)為表現(xiàn)，而無明顯臨床癥狀[15]。腎衰時(shí)腎臟功能下降，不能很好地清除炎性因子是引起微炎癥狀態(tài)的一個(gè)重要因素，而微炎癥狀態(tài)可進(jìn)一步加劇腎衰的發(fā)展。有研究表明，CRP升高程度與炎癥的范圍或活力呈正相關(guān)[16]，IL-6可致腎小球系膜細(xì)胞增殖、硬化，加重腎臟疾病[17]，TNF-α在慢性腎衰竭發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用[18]。改善腎衰患犬微炎癥狀態(tài),對(duì)提高其腎功能及生存率具有重要意義。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大黃素可以顯著降低血液中CRP、IL-6和TNF-α水平，減輕CRF的微炎癥狀態(tài)。

在給予大黃素治療后，CRF患犬血清Scr、BUN和尿液KIM-1水平降低，且呈量效關(guān)系，說明大黃素可以提高CRF患犬的腎功能，這可能與大黃素抑制機(jī)體氧化應(yīng)激和微炎癥狀態(tài)有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。