張小波 ， 溫貴蘭 ， 張喜懿 ， 陳 廣 ， 劉蔓蔓 ， 胡 璇 ， 孫 蕓

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室 ， 貴州 貴陽 550025)

2020年8月，貴州省某養(yǎng)雞場部分雞只出現(xiàn)流淚、呼吸困難，少數(shù)雞只雞冠痘狀結(jié)痂，精神沉郁，采食量與飲水量均減少，其余部分雞只無明顯癥狀。通過對送檢病雞進行實驗室診斷確診為J亞型禽白血病病毒(Avian leucosis virus J,ALV-J)、血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)和雞痘病毒(Fowlpox virus,FWPV)的混合感染。

1 材料與方法

1.1 病料 病料采自貴州省畢節(jié)市某養(yǎng)雞場，送檢麻黃雞保存于貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室。

1.2 實驗室剖檢與細菌分離 對病雞進行解剖并于無菌環(huán)境采集病雞的雞冠、肝臟、心臟、脾臟和腎臟等組織接種于LB固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧或需氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h后觀察。

1.3 引物設(shè)計 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中ALV-J原型毒株HPRS-103(登錄號：Z46390)gp85基因序列、FAdV-4(登錄號：GU188428.1)penton基因序列和FWPV(登錄號：NC-002188.1)TK基因序列分別設(shè)計3對特異性擴增引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR鑒定 按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書對病雞組織提取總DNA和總RNA，再依據(jù)HiFi-Script cDNA第1鏈合成試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用所設(shè)計的3對特異性擴增引物分別對所得cDNA進行PCR擴增，其擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 目的基因克隆及序列測定 將電泳鑒定后的PCR產(chǎn)物切膠進行膠回收，膠回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，16 ℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，其菌液在氨芐固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后，挑取單個白色菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)12～16 h，取純培養(yǎng)菌液2 μL進行PCR鑒定，選取陽性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 基因遺傳進化分析 將測序所得結(jié)果上傳于NCBI上進行比對，利用MEGA 7.0分析同源性，并構(gòu)建其遺傳進化樹。參考毒株信息見表2、3、4。

表2 ALV-J gp85基因參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 實驗室剖檢與細菌分離 實驗室剖檢可見雞冠痘狀結(jié)痂(圖1)、肝臟腫瘤結(jié)節(jié)(圖2)、心包積液(圖3)、脾臟腫大(圖4)等明顯癥狀。對送檢病雞進行細菌分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示無菌落形成。

圖1 雞冠痘狀結(jié)痂

圖2 肝臟腫瘤結(jié)節(jié)

圖3 心包積液

圖4 脾臟腫大

2.2 ALV-Jgp85基因克隆與分析 由圖5可知，克隆菌液在1 061 bp處出現(xiàn)特異性的擴增條帶，與目的基因預期大小相符，將其命名為GZ-ALV-J gp85-Z。經(jīng)測序拼接后獲得長度為924 bp的基因序列，上傳至GenBank中進行核苷酸同源性比對，結(jié)果如圖6所示，GZ-ALV-J gp85-Z與國內(nèi)外ALV A、B、C、D、E亞群的同源性僅為50.1%～52.0%，GZ-ALV-Jgp85-Z與ALV-J亞群參考株屬于同一分支，同源性為93.8%～99.7%，其中與國內(nèi)HuB09 JY04株親緣性最近，為99.7%，表明該分離株屬于ALV-J亞群。

表3 FAdV-4 penton基因參考毒株信息

表4 FWPV TK基因參考毒株信息

圖5 ALV-J gp85基因的PCR鑒定

圖6 GZ-ALV-J gp85-Z系統(tǒng)進化樹

2.3 FAdV-4penton基因克隆與分析 由圖7可知，克隆菌液在717 bp處出現(xiàn)特異性的擴增條帶，與目的基因預期大小相符，將其命名為GZ-FAdV-4 penton-X。經(jīng)測序后獲得長度為717 bp的基因序列，上傳至GenBank中進行核苷酸同源性比對，結(jié)果如圖8所示，GZ-FAdV-4 penton-X與國內(nèi)外禽腺病毒A、B、D、E基因型的同源性為71.4%～75.3%，與C型禽腺病毒血清4型屬于同一分支，且與國內(nèi)C型禽腺病毒血清4型參考株的同源性均高達98%以上，表明GZ-FAdV-4 penton-X分離株為C型禽腺病毒血清4型。

圖7 FAdV-4 penton基因的PCR鑒定

圖8 GZ-FAdV-4 penton-X系統(tǒng)進化樹

2.4 FWPVTK基因克隆與分析 由圖9可知，克隆菌液在750 bp處出現(xiàn)特異性的擴增條帶，與目的基因預期大小相符，將其命名為GZ-FWPV-TK-B。經(jīng)測序后獲得長度為750 bp的基因序列，上傳至GenBank中進行核苷酸同源性比對，結(jié)果如圖10所示，GZ-FWPV-TK-B與美國株FWPV-SD15-670.2(登錄號：MH734528.1)的同源性最高，達99.49%，與禽痘病毒屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與其他不同屬的痘病毒(如豬痘病毒等)不屬于同一分支，表明親緣關(guān)系較遠。

圖9 FWPV TK基因的PCR鑒定

圖10 GZ-FWPV-TK-B系統(tǒng)進化樹

3 討論

通過對送檢病雞進行細菌分離培養(yǎng)，并進行FWPV、ALV-J、FAdV-4的PCR實驗室檢測，結(jié)果顯示該養(yǎng)雞場存在FWPV、ALV-J和FAdV-4混合感染?；诖饲闆r，應當盡快對養(yǎng)殖場病雞進行緊急淘汰，對健康雞只進行FWPV和FAdV-4疫苗接種，并對整個雞舍進行ALV凈化，同時對養(yǎng)雞場環(huán)境徹底消毒，嚴防引進銷售，阻止擴散，及時止損。

由于近年來病原不斷遷移，基因組不停變異，宿主范圍不斷擴大，ALV宿主范圍已不僅僅局限于家禽，野生鳥類也時有報道[1]。ALV亞群眾多，病毒傳播快，因此其快速檢測方法和亞群鑒定就應運而出，如具有高度敏感性的分型方法PCR-RFLP，能快速、敏感、特異地對樣品中的病毒進行檢測與分型[2]。還有其他一系列分子生物學方法如環(huán)介導等溫擴增、斑點雜交、基因芯片等[3-4]，都可以對ALV進行特異性地快速檢測，但由于價格、適用性等原因，沒有普遍應用于市場。ALV屬于C型反轉(zhuǎn)錄病毒，其env基因編碼的gp85囊膜糖蛋白與宿主的易感性病毒中和反應密切相關(guān)，決定著亞群特異性，但由于存在高變區(qū)，極易發(fā)生變異，因此gp85基因的變異常常代表著ALV毒株的流行變異。本試驗采用PCR檢測及ALV-Jgp85基因克隆、測序分析，結(jié)果顯示，該分離株與國內(nèi)外J亞群參考株同源性為93.8%～99.7%，而與國內(nèi)外其他亞群A、B、C、D、E同源性僅為50.1%～52.0%。與其他亞群超低同源性也與相關(guān)學者何成偉等[5]、林漢卿等[6]報道一致，證實了gp85基因存在高度突變性，其遺傳變異性也可為養(yǎng)殖場引種提供參考。

FAdV-4感染雞引起雞心包積液-肝炎綜合征，從1987年報道流行后，至今已有40多個國家和地區(qū)都有暴發(fā)。自2014年以來，我國山東、河南、江西等地相繼有安卡拉病的暴發(fā)流行，并依次向周邊省份傳播，范圍還在不斷擴大，養(yǎng)禽業(yè)至今遭受其害[7]。目前由于該病臨床易與雞傳染性肝炎混淆，又極易與禽白血病、傳染性法氏囊病、大腸埃希菌病等繼發(fā)感染，因此實驗室以臨床剖檢、病變觀察結(jié)合PCR檢測等對FAdV-4進行臨床快速檢測，提高對病原的檢測效率。五鄰體(Penton)所在頭節(jié)區(qū)能識別細胞表面的病毒受體，在病毒入侵宿主機體的過程中起著很大作用[8]。本試驗將FAdV-4分離株penton基因進行克隆測序后得到717 bp的基因片段，通過同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，其與國內(nèi)外禽腺病毒A、B、D、E基因型的同源性為71.4%～75.3%，與C型禽腺病毒血清4型屬于同一分支，與國內(nèi)C型禽腺病毒血清4型參考株的同源性均高達98%以上，親緣關(guān)系較近。表明該陽性毒株為血清4型禽腺病毒。

本試驗對雞冠皮膚結(jié)痂進行PCR檢測，結(jié)果呈陽性。對目的基因TK進行克隆、測序和基因同源性分析表明，分離株與美國株FWPV-SD15-670.2(登錄號：MH734528.1)的同源性最高，達99.49%。這株美國分離株從野生型梅里亞姆火雞分離得出，經(jīng)研究證實為自然感染過程中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)基因組片段整合進了FWPV基因組內(nèi)[9]。且國內(nèi)也有研究證實，REV整合入FWPV疫苗株和野毒株的現(xiàn)象普遍，可能是由FWPV重組期間REV LTRs之間的同源重組，從FWPV基因組中復制或通過逆轉(zhuǎn)錄病毒切除[10]。因此禽痘病毒在不同國家、地區(qū)間變化依舊復雜，本試驗分離株是否有外源基因植入仍有待進一步研究。

基于細菌分離及PCR檢測，初步判定該病雞為FWPV、ALV-J和FAdV-4混合感染，并進行了FWPVTK、ALV-Jgp85、FAdV-4penton片段的序列分析，但由于混合感染多病毒毒株分離存在一定的難度，且分離方法不一致，因此未進行病毒分離，后期將會報道其病毒的分離情況，以期為豐富該混合感染病例的防控措施提供參考資料。