趙琳娜 ， 唐意念 ， 栗婷婷 ， 高嘉楓 ， 胥輝豪 ， 林珈好 , 林德貴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

紫杉醇(Paclitaxel，TAX)是從紅豆杉樹(shù)皮中提取出的四環(huán)二萜類化合物，是紅豆杉中的主要抗癌活性成分，能夠從整體、器官、細(xì)胞和分子多水平治療乳腺癌[1-2]，已于1992 年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療人卵巢癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

姜黃為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，具有破血行氣、通經(jīng)止痛之功，是重要的活血化瘀類中藥。姜黃的主要多酚類活性成分姜黃素(Curcumin，CUR)具有抑制多種腫瘤的功效，尤其對(duì)于治療乳腺癌發(fā)揮著重要作用[3]。CUR已作為潛在的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)早期階段[4]。另有研究表明，CUR不僅能直接殺傷乳腺癌細(xì)胞，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤多藥耐藥活性，能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)A2780t 紫杉醇耐藥株、MCF7 紫杉醇耐藥株、MNNG/HOS 甲氨蝶呤耐藥株等腫瘤細(xì)胞的耐藥性[5-6]，與其他抗癌藥共同作用時(shí)，可增強(qiáng)其他藥物對(duì)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

TAX和CUR具有協(xié)同治療惡性腫瘤的功效。Gao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，CUR和TAX合用能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤血管生成治療結(jié)腸腫瘤，且二者合用的體內(nèi)外抑癌作用優(yōu)于任一單成分組。除此之外，二者合用可大大降低TAX劑量至10 nmol/L，降低TAX臨床高劑量的細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)。另有研究表明，CUR和TAX合用能夠逆轉(zhuǎn)TAX誘導(dǎo)的EGFR信號(hào)激活，并降低p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)水平，有效逆轉(zhuǎn)TAX多藥耐藥[5]。

犬作為人類的伴侶動(dòng)物，所處生活環(huán)境和接觸的致癌誘因與人類極其相近，犬乳腺腫瘤在獸醫(yī)臨床中也屬常發(fā)病，母犬乳腺腫瘤發(fā)病率約占全部腫瘤性疾病的25%～42%，其中惡性乳腺腫瘤發(fā)病率為50%，是人類乳腺腫瘤惡性率的3倍。本試驗(yàn)探討了TAX、CUR聯(lián)合使用的抗乳腺腫瘤作用，以期為犬乳腺腫瘤的臨床治療提供新的方法，從而推動(dòng)人類和犬乳腺腫瘤研究的比較與共進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠30 只，清潔級(jí)，5 周齡，雌性，體重16～18 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞株 小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系4T1，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。犬乳腺腫瘤細(xì)胞系7364，由本實(shí)驗(yàn)室臨床采集培養(yǎng)并驗(yàn)證所得。

1.3 藥品與試劑 TAX標(biāo)準(zhǔn)品(寶雞市國(guó)康生物科技有限公司，純度為99.5%)；CUR標(biāo)準(zhǔn)品(寶雞市國(guó)康生物科技有限公司，純度為95%)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo東仁化學(xué)科技有限公司)；多普適?TAX注射液(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器 81型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)；LD4-2 離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；IXJ型倒置顯微鏡(Olympus公司)；電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DW-86 W420型-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 使用犬乳腺腫瘤細(xì)胞系7364，制備腫瘤細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至5×104個(gè)/ mL，接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2恒溫濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，吸去孔內(nèi)溶液，分別加入100 μL不同濃度的TAX(0.013、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μmol/L和25.6 μmol/L)、CUR(0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L和256 μmol/L)、TAX+CUR(將濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/L和0.8 μmol/L的TAX培養(yǎng)基溶液，分別與濃度為0.25、0.5、1、2 μmol/L和4 μmol/L的CUR培養(yǎng)基溶液等體積混合，得到30 組不同濃度的TAX和CUR混合培養(yǎng)基溶液)培養(yǎng)基溶液處理細(xì)胞，各組DMSO濃度均為0.8%?？瞻捉M不接種細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸去上清，每孔加入100 μL 5% CCK-8試劑培養(yǎng)基溶液。在培養(yǎng)箱中反應(yīng)2.5 h后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。按照公式(1)計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

(1)

式中對(duì)照孔為DMSO組各孔，空白孔為空白組各孔。

為進(jìn)一步反映兩藥間的相互影響，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，分別按照公式(2)和(3)計(jì)算協(xié)同指數(shù)Q和聯(lián)合指數(shù)CI。

Q=E(AB) / [EA+(1-EA)×EB]

(2)

CI=a/A+ b/B

(3)

公式(2)中E(AB)為兩藥合用的增殖抑制率，EA和EB分別為兩藥單用的增殖抑制率。公式(3)中a 為聯(lián)合給藥時(shí)TAX的半數(shù)抑制濃度(IC50)，b為聯(lián)合給藥時(shí)CUR的IC50，A為T(mén)AX單獨(dú)給藥的IC50，B為CUR單獨(dú)給藥的IC50。當(dāng)CI < 1，兩藥協(xié)同；CI=1，兩藥相加；CI > 1，兩藥拮抗。

1.5.2 體內(nèi)抗腫瘤作用 將小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系4T1的細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1×107個(gè)/mL，在小鼠腹部乳區(qū)皮下接種4T1細(xì)胞，每只200 μL(含細(xì)胞數(shù)2×106個(gè))，接種后每日觀察瘤體生長(zhǎng)狀況和大小，待腫瘤體積長(zhǎng)至100～200 mm3時(shí)開(kāi)始給藥。腫瘤的平均體積(mm3)=最大長(zhǎng)度(mm)×寬度2(mm2)/2。荷瘤小鼠模型建立后，對(duì)小鼠稱重并測(cè)量腫瘤大小，隨機(jī)將15只小鼠分為3組，每組5只。分別設(shè)置為生理鹽水組、TAX組、TAX+CUR組，每隔4 d給藥1次，共給藥4次。生理鹽水組：每只小鼠尾靜脈注射400 μL生理鹽水；TAX組：給藥劑量為T(mén)AX 6 mg/(kg·bw)；TAX+CUR組：給藥劑量為T(mén)AX 6 mg/(kg·bw)和CUR 36 mg/(kg·bw)。給藥后每隔1 d用游標(biāo)卡尺量取并記錄腫瘤的最大長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算腫瘤平均體積。最后1次給藥結(jié)束后第3天處死全部小鼠，并完整剝?nèi)∧[瘤，稱重，按照公式(4)計(jì)算腫瘤的抑瘤率。

抑瘤率/%=(1-試驗(yàn)組腫瘤平均重量/生理鹽水組腫瘤平均重量)×100%

(4)

2 結(jié)果

2.1 TAX對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 結(jié)果見(jiàn)圖1，一定濃度的TAX單體藥物可抑制7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖。隨著TAX濃度的增加，其對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，且較低濃度TAX便可產(chǎn)生較強(qiáng)的增殖抑制作用。由SPSS軟件計(jì)算TAX對(duì)7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞的IC50為0.191 μmol/L。此外，0.8% DMSO濃度對(duì)7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞無(wú)顯著細(xì)胞毒作用。

圖1 不同濃度TAX對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖抑制率曲線

2.2 CUR對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 結(jié)果見(jiàn)圖2，一定濃度的CUR單體藥物可抑制7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖。隨著CUR濃度的增加，其對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)，但較低濃度的CUR幾乎無(wú)增殖抑制作用。由SPSS軟件計(jì)算CUR對(duì)7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞的IC50為53.160 μmol/L。此外，0.8% DMSO濃度對(duì)7364犬乳腺腫瘤細(xì)胞無(wú)顯著細(xì)胞毒作用。

圖2 不同濃度CUR對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖抑制率曲線圖

2.3 TAX和CUR聯(lián)合給藥對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 結(jié)果見(jiàn)表1，0.25、0.5和1 μmol/L的CUR和TAX聯(lián)合時(shí)兩藥具有一定的協(xié)同效應(yīng)。綜合考慮，1 μmol/L CUR和TAX聯(lián)合給藥，且CUR和TAX摩爾比例較高時(shí)，兩者對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同效應(yīng)較好。

表1 不同濃度TAX和CUR聯(lián)合給藥對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率及兩藥間的相互影響

2.4 體內(nèi)抗腫瘤作用 結(jié)果見(jiàn)圖3～6。由圖3可知，治療過(guò)程中及治療結(jié)束時(shí)，TAX+CUR組的腫瘤體積小于TAX組和生理鹽水組，說(shuō)明TAX和CUR聯(lián)用對(duì)小鼠乳腺腫瘤有協(xié)同抑制效果。

圖3 各組皮下移植瘤隨時(shí)間推移體積大小變化趨勢(shì)

本試驗(yàn)對(duì)各組在同一時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積大小的差異進(jìn)行了對(duì)比，由于前5次測(cè)量各組的腫瘤體積大小并無(wú)顯著差異，故結(jié)果只顯示了從第11 天開(kāi)始各組的腫瘤體積大小差異，如圖4所示，TAX+CUR組在第11 天腫瘤體積與生理鹽水組有顯著差異(P<0.05)，治療結(jié)束(第17天)時(shí)，TAX+CUR組與生理鹽水組和TAX組均有極顯著差異(P<0.01)，且TAX組與生理鹽水組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明低劑量TAX單藥無(wú)法發(fā)揮藥效。

圖4 同一時(shí)間點(diǎn)各組間腫瘤體積變化對(duì)比

各組小鼠處死后完整剝離腫瘤的大小和重量對(duì)比結(jié)果如圖5和圖6所示，治療結(jié)束時(shí)TAX+CUR組完整剝離的腫瘤小于TAX組和生理鹽水組，且TAX+CUR組與TAX組的腫瘤重量有顯著性差異(P<0.05)，TAX組與生理鹽水組的腫瘤重量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 各組小鼠完整剝離腫瘤的大小對(duì)比

圖6 各組小鼠完整剝離腫瘤的重量對(duì)比

通過(guò)計(jì)算TAX+CUR組的抑瘤率為17.3%，而TAX組在此劑量下對(duì)小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系4T1的皮下移植瘤無(wú)抑制效果。

3 討論

紫杉醇通過(guò)與β微管蛋白的氨基末端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸位點(diǎn)結(jié)合，可以誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白裝配成微管，同時(shí)抑制微管解聚，穩(wěn)定微管，從而導(dǎo)致微管的排列異常，使細(xì)胞在有絲分裂時(shí)不能正常的形成紡錘體和紡錘絲，抑制細(xì)胞的分裂和增殖，使其停滯在G2/M期，這是紫杉醇抗腫瘤作用的主要機(jī)制[9]。姜黃素與多種化療藥物具有協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)化療療效，還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥抵抗，以及增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。另有研究表明，姜黃素在抑制癌細(xì)胞的同時(shí)能保護(hù)正常細(xì)胞，而且安全性高，高劑量使用時(shí)也幾乎無(wú)毒副作用[10]。在本試驗(yàn)細(xì)胞毒性檢測(cè)中，TAX和CUR單體藥物單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系7364均有增殖抑制作用，其IC50分別為0.191 μmol/L和 53.160 μmol/L。而濃度范圍在0.25～2 μmol/L CUR和0.013～0.4 μmol/L TAX聯(lián)合給藥時(shí)，TAX的IC50與TAX單獨(dú)給藥的IC50相比，濃度顯著降低，說(shuō)明TAX和CUR在一定配比、濃度條件下具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

在動(dòng)物試驗(yàn)中，TAX的給藥劑量為6 mg/(kg·bw)，低于產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中該藥針對(duì)乳腺腫瘤的治療劑量(人：175 mg/m2)和大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的TAX治療小鼠乳腺腫瘤的試驗(yàn)劑量[小鼠：10 mg/(kg·bw)][11-12]，由試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在本試驗(yàn)劑量下，TAX單藥對(duì)荷瘤小鼠未表現(xiàn)出明顯藥效，但同等劑量下，TAX和3 mg/(kg·bw)CUR聯(lián)合給藥時(shí)，產(chǎn)生了明顯的抑瘤作用，說(shuō)明TAX和CUR聯(lián)合用藥可以對(duì)荷瘤小鼠乳腺腫瘤產(chǎn)生治療效果。

TAX和CUR在一定配比、濃度條件下對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系7364具有協(xié)同細(xì)胞毒作用，對(duì)小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系(4T1)皮下移植瘤具有優(yōu)于同劑量單藥的抑瘤效果。