譚慶芻，黃浩洲，林俊芝，仇 敏，李 莞，譚 鵬，樊三虎，韓 麗*，張定堃*

余甘子藥材表面白霜的化學(xué)成分及“析霜”科學(xué)內(nèi)涵初探

譚慶芻1，黃浩洲1，林俊芝2，仇 敏1，李 莞1，譚 鵬3，樊三虎4，韓 麗1*，張定堃1*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，代謝性疾病中醫(yī)藥調(diào)控四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072 3. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川 成都 610041 4. 成都市三勒漿藥業(yè)集團(tuán)，四川 成都 610000

研究余甘子藥材表面白霜的化學(xué)組成及析霜對(duì)其生津作用的影響，以期為余甘子“析霜者佳”的傳統(tǒng)認(rèn)知提供科學(xué)依據(jù)。收集余甘子藥材表面形成的白霜，采用掃描電鏡、能譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀和UPLC-Q-TOF-MS分析余甘子藥材在貯藏過(guò)程中表面形成的白霜的化學(xué)成分；采用電子舌（E-tongue）結(jié)合志愿者的感官評(píng)定，研究藥材表面析霜前后生津作用的變化；采用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)余甘子中化合物的含量和空間分布信息進(jìn)行研究，分析其“析霜”代謝物的可能變化規(guī)律。掃描電鏡觀察表明余甘子藥材表面析出白霜主要由細(xì)小的團(tuán)簇晶體結(jié)構(gòu)組成，能譜儀分析表明白霜主要為有機(jī)物組成，主要含有R-COOH、C-C、C-O等官能團(tuán)；UPLC-Q-TOF-MS研究發(fā)現(xiàn)，白霜的主要成分是小分子有機(jī)酸和多酚，如粘酸、檸檬酸、-(＋)-蘋(píng)果酸和沒(méi)食子酸等。感官評(píng)價(jià)及E-tongue研究發(fā)現(xiàn)，表面析霜后，余甘子藥材濾液的酸味、澀味和苦味均不同程度增加，生津作用更加明顯；質(zhì)譜成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著余甘子的干燥，其內(nèi)部的-(＋)蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸等成分會(huì)發(fā)生表面遷移。余甘子藥材表面白霜主要是小分子有機(jī)酸及多酚類(lèi)物質(zhì)，“析霜”后酸味、澀味和苦味有所增強(qiáng)，有效成分含量增加，生津與健胃消食作用增強(qiáng)。

余甘子；成分變化；析霜；感官評(píng)價(jià)；粘酸；檸檬酸；-(＋)蘋(píng)果酸；沒(méi)食子酸

余甘子L. 是大戟科葉下珠屬熱帶、亞熱帶落葉小喬木，其果實(shí)是中藥余甘子，俗名滇橄欖、油甘子、山油甘、庵摩勒等，常見(jiàn)于中國(guó)南部、印度和部分非洲國(guó)家[1]。余甘子風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值與保健功能顯著，在利咽、降糖、調(diào)節(jié)血脂代謝、預(yù)防牙齦炎等方面作用突出[2-3]，含有豐富的維生素C，被稱(chēng)為“維C之王”，此外，可水解鞣質(zhì)是余甘子中的主要酚類(lèi)物質(zhì)[4]。在中國(guó)西北部少數(shù)民族聚集區(qū)喜食牛羊肉，常將余甘子泡茶飲用，用以消渴解膩；泰國(guó)，印度僧侶在日常生活中也經(jīng)常含服余甘子，用于生津止渴[5]。目前，余甘子在全球17個(gè)國(guó)家的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中使用，特別是中國(guó)藏醫(yī)學(xué)和印度阿育吠陀醫(yī)學(xué)[6]，被聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織指定為全世界推廣種植的3種保健植物之一[7]。

“析霜”是指某些藥材長(zhǎng)期暴露在空氣中時(shí)可在其表面析出化學(xué)成分晶狀物質(zhì)的一種特殊現(xiàn)象[8]。從歷史源流來(lái)看，五味子的“霜”發(fā)現(xiàn)最早，首載于南北朝時(shí)期的《雷公炮炙論》[9]。柿霜在宋代被《本草圖經(jīng)》中記載為“白柿”，柿餅以表面掛白霜者品質(zhì)佳，具有清熱生津止渴的功效[10]。《藥材學(xué)》記載不同產(chǎn)地的牡丹皮中，以銅陵鳳凰山所產(chǎn)的鳳丹皮所具亮星最多，質(zhì)量亦最佳[11]，可見(jiàn)對(duì)某些藥材而言，“析霜”后其品質(zhì)更優(yōu)。余甘子富含有多酚類(lèi)成分，其藥材在貯藏過(guò)程中也會(huì)發(fā)生類(lèi)似析霜現(xiàn)象，藥材在干燥陰涼處存放2～3年后表面會(huì)析出一層白霜（圖1）。藥材流通從業(yè)者認(rèn)為，析霜后的余甘子藥材品質(zhì)更優(yōu)，有“析霜者佳”的說(shuō)法。部分有經(jīng)驗(yàn)的藥工會(huì)依據(jù)余甘子表面析霜的程度來(lái)判斷余甘子的品質(zhì)，但尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報(bào)道。目前，對(duì)于余甘子藥材表面的白霜構(gòu)成并不明確，其“析霜”現(xiàn)象與藥材品質(zhì)的關(guān)聯(lián)尚無(wú)科學(xué)依據(jù)。

圖1 余甘子藥材圖

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究主要采用掃描電鏡（SEM）及能譜儀（EDS）觀察余甘子表面白霜的微觀結(jié)構(gòu)及元素組成，采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對(duì)余甘子表面白霜結(jié)構(gòu)官能團(tuán)進(jìn)行鑒別，采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)霜中主要化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒別，采用電子舌（E-tongue）及志愿者口嘗法對(duì)析霜后余甘子味道及生津作用評(píng)價(jià)，采用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)余甘子中化合物的含量和空間分布信息進(jìn)行研究，分析其“析霜”的代謝物可能變化規(guī)律。旨在揭示余甘子表面白霜的化學(xué)成分，探討白霜形成與余甘子品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步解釋余甘子傳統(tǒng)認(rèn)知“析霜者佳”的科學(xué)內(nèi)涵，為余甘子品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1. 材料

FEI Insepect F50型掃描電鏡（美國(guó)賽默飛公司），EDAX Octane Super能譜儀（美國(guó)依達(dá)克斯有限公司），Vanquish型超高效液相色譜聯(lián)用Q-Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司），SA402B系列智能味覺(jué)分析系統(tǒng)（日本INSENT公司），傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛Nicolet），SYNAPT XS高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）。BSA224S型萬(wàn)分之一分析天平和BT25S型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司），Milli-Q型超純水儀（美國(guó)Millipore公司），冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

余甘子藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院許潤(rùn)春副教授鑒定為大戟科植物余甘子L.的干燥成熟果實(shí)，樣品信息見(jiàn)表1。檸檬酸、粘酸、-(＋)-蘋(píng)果酸、沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB210116、CHB210105、CHB210228、CHB201131，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），鞣花酸和柯里拉京對(duì)照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq21010403、whq21040907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），水為超純水，甲醇、甲酸為色譜級(jí)，溴化鉀，其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息

Table 1 Sample information

樣品編號(hào)批號(hào)產(chǎn)地采收時(shí)間備注 S1180301云南2018-09析霜 S2180401四川2018-07析霜 S3181209廣西2018-05析霜 S4180301云南2018-09未析霜 S5180401四川2018-07未析霜 S6181209廣西2018-05未析霜

2 方法

2.1 白霜的收集

選取各批次中表面析霜的余甘子藥材，用硬毛刷小心刷下藥材表面白霜，并按照各批次編號(hào)。

2.2 SEM-EDS檢測(cè)

取干燥余甘子表面白霜用導(dǎo)電膠粘貼于載物臺(tái)上，把樣品粉末均勻分布于導(dǎo)電膠表面，采用真空鍍膜法在4 Pa以下高真空、電流20 mA條件下噴鍍鉑金屬2 min使樣品導(dǎo)電。儀器的加速電壓為15.0 kV，工作距離為10.3 mm。用SEM在5000、10 000倍下觀察樣品。

2.3 FT-IR分析

取溴化鉀于瑪瑙研缽中，在紅外烤燈下研磨成細(xì)粉；轉(zhuǎn)移至壓片模具中，將模具置于壓片機(jī)中壓實(shí)，得半透明薄片，即溴化鉀空白片。取3份余甘子霜S1、S2、S3樣品粉末（過(guò)六號(hào)篩）適量，與溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨，壓片制成樣品片，先將溴化鉀空白片置于紅外光譜儀中，掃描，得空白背景片的一維紅外光譜。再將樣品片置于紅外光譜儀中，掃描得到樣品片的一維紅外光譜。

2.4. UPLC-Q-TOF-MS主要色譜峰的分析及鑒定

2.4.1 色譜條件 Thermo Scientific Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脫（0～1 min，2%B；1～2 min，2%～5%B；2～4 min，5%～7%B；4～6 min，7%～24%B；6～10 min，24%～42%B；10～12 min，42%～54%B；12～15 min，54%～76%B；15～18 min，76%～100%B），體積流量為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI），正、負(fù)離子模式檢測(cè)，噴霧電壓為3.0 kV，離子源溫度為350 ℃，鞘氣體積流量為35 arb，輔助氣體積流量為10 arb，離子傳輸管溫度為320 ℃，離子掃描范圍為/100～1500[12]。

2.4.2 供試品溶液的制備 按“2.1”項(xiàng)收集余甘子藥材表面白霜，精確稱(chēng)量0.1 g白霜置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30 min使溶解，靜置冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取各對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配制含檸檬酸0.235 mg/mL、粘酸0.352 mg/mL、-(＋)蘋(píng)果酸0.245 mg/mL、沒(méi)食子酸0.225 mg/mL、柯里拉京0.221 mg/mL、鞣花酸0.231 mg/mL的混合對(duì)照溶液，置于4 ℃冰箱備用，進(jìn)樣前用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.4.4 數(shù)據(jù)分析 使用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，將二級(jí)碎片實(shí)測(cè)譜圖與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)，及在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)[Mzloud網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)OTCML，MassBank，人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）進(jìn)一步分析和鑒定。

2.5 析霜余甘子與未析霜余甘子E-tongue分析

2.5.1 供試品的制備 取3個(gè)批次表面析霜余甘子與未析霜余甘子，各稱(chēng)量10 g，分別用150 mL溫水沖泡20 s，將余甘子撈出，取濾液為供試品溶液。析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S1～S3，未析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S4～S6。

2.5.2 正、負(fù)極清洗液及參比液的制備 ①正極清洗液：準(zhǔn)確稱(chēng)量7.46 g氯化鉀，用500 mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，然后?zhǔn)確加入300 mL無(wú)水乙醇溶液，邊攪拌邊加入準(zhǔn)確稱(chēng)量的0.56 g氫氧化鉀，溶解完畢后，轉(zhuǎn)移到1000 mL的量瓶，定容。②負(fù)極清洗液：準(zhǔn)確量取300 mL無(wú)水乙醇，與500 mL蒸餾水震蕩混合，然后加入8.3 mL的濃鹽酸，攪拌混合后轉(zhuǎn)移到1000 mL的量瓶，定容。③參比溶液：最后精密稱(chēng)定2.236 5 g氯化鉀和0.045 g酒石酸，用500 mL蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到1000 mL量瓶中，定容。

2.5.3 E-tongue測(cè)試方法 開(kāi)始時(shí)正、負(fù)極分別放入正、負(fù)極清洗液中清洗90 s，接著用參比液清洗2次，各120 s，傳感器在參比液中平衡歸零，達(dá)到平衡條件后，開(kāi)始測(cè)試，測(cè)試時(shí)間30 s；在2組參比液中分別短暫清洗3 s，傳感器插入新的參比液中測(cè)試余味30 s，循環(huán)測(cè)試4次，去掉第1循環(huán)，取后3次平均數(shù)據(jù)作為測(cè)試結(jié)果，每次清洗、平衡和測(cè)試余味的液體均分布在不同樣品杯中[13]。

2.5.4 樣品測(cè)定 將每個(gè)樣品液倒入電子舌測(cè)試專(zhuān)用塑料小杯中，每杯25 mL，每個(gè)樣品倒2杯，按“2.5.3”項(xiàng)方法測(cè)試，記錄傳感器澀味傳感器（AE1）、鮮味傳感器（AAE）、咸味傳感器（CTO）、苦味傳感器（COO）、酸味傳感器（CAO）、甜味傳感器（GL1）的響應(yīng)值，收集3次平行測(cè)定數(shù)據(jù)，求得平均值。

2.6 析霜與未析霜余甘子溶液pH測(cè)定及志愿者風(fēng)味評(píng)價(jià)

2.6.1 pH測(cè)定 取3個(gè)批次表面析霜余甘子與未析霜余甘子，各稱(chēng)量10 g，分別用150 mL溫水沖泡20 s，將余甘子撈出，取濾液為供試品溶液。通過(guò)pH計(jì)分別對(duì)每個(gè)樣品測(cè)定溶液pH值3次取平均值，析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S1～S3，未析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S4～S6。

2.6.2 志愿者的篩選和訓(xùn)練 感官評(píng)定依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15038-2006）和ISO 4121進(jìn)行篩選志愿者條件如下：年齡22～28歲，無(wú)嚴(yán)重過(guò)敏、遺傳病史、無(wú)膽囊炎、無(wú)不良嗜好、無(wú)近期病史。制備0.5、0.8、1.0 mg/mL的鞣酸溶液，規(guī)定澀味分值為2、5、10；制備0.5、1.0、2.0 mg/mL的檸檬酸溶液，規(guī)定酸味分值為2、5、10；制備0.1、0.2、0.3 mg/mL的硫酸奎寧溶液，規(guī)定苦味分值為2、5、10。分別定義為輕微、明顯、劇烈，告知并要求志愿者記住不同樣品的3個(gè)質(zhì)量濃度梯度所對(duì)應(yīng)風(fēng)味分值[14]。

2.6.3 供試品的制備 取3個(gè)批次表面析霜余甘子與未析霜余甘子，各稱(chēng)量10 g，分別用150 mL溫水沖泡20 s, 將余甘子撈出，取濾液為供試品溶液。析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S1～S3，未析霜余甘子溶液標(biāo)號(hào)為S4～S6。

2.6.4 志愿者感官試驗(yàn) 選擇10名訓(xùn)練合格的志愿者進(jìn)行志愿者感官試驗(yàn)，試驗(yàn)前應(yīng)具備以下條件：味覺(jué)敏感，1 d內(nèi)不飲酒、不吸煙，2 h內(nèi)不飲食，可自由飲用水。在每次品嘗之前，小組成員用純凈水漱口，以舌背表面和舌緣為主要感受部位，每份樣品口含10 s后吐出，分別記錄每個(gè)樣品5、20、40、60、80、100、120、140 s各個(gè)時(shí)間段在口腔中感知強(qiáng)度，然后對(duì)每個(gè)樣本的每個(gè)屬性的感知強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，每份樣品評(píng)定結(jié)束后間隔10 min再進(jìn)行下一份樣品的評(píng)定。對(duì)于每個(gè)樣品，感官評(píng)估一式3份進(jìn)行，最后將每個(gè)時(shí)間段的評(píng)分相加得到這個(gè)樣品的感知強(qiáng)度，再將結(jié)果取平均值[15]。

2.7 質(zhì)譜成像分析

2.7.1 樣品制備 將余甘子切成均勻薄片，并在?80 ℃冰箱中冷凍。取出后，覆蓋并壓縮載玻片，然后冷凍干燥，備用。

2.7.2 質(zhì)譜條件及數(shù)據(jù)處理 負(fù)離子掃描，掃描范圍為/100～1500，空間分辨率為120 μm，噴霧電壓為4.5 kV；采樣錐電壓為40 V；噴霧器（氮?dú)鈮毫Γ?.5 MPa；溶劑為甲基甲酸（1000∶1），體積流量為2 μL/min；噴霧器入射角為70°；收集器角度為10°；離子源溫度為150 ℃；采樣電壓為?40 V。數(shù)據(jù)采集軟件為Masslynx V 4.2，數(shù)據(jù)處理軟件為Masslynx HDIV 1.5軟件。

3 結(jié)果

3.1 SEM和EDS分析結(jié)果

3.1.1 SEM形貌觀察 通過(guò)SEM在（×5000，×10 000）下檢查樣品，結(jié)果如圖2所示。能夠觀察到白霜的晶體結(jié)構(gòu)是由多個(gè)不規(guī)則的小團(tuán)簇晶體堆積而成（×5000），小團(tuán)簇晶體的直徑為2～3 μm，在10 000倍下藥材表面白霜結(jié)構(gòu)更加明顯。

3.1.2 EDS元素測(cè)定 通過(guò)SEM在×5000放大倍數(shù)下獲得圖像，結(jié)合EDS對(duì)白霜進(jìn)行表面元素分析，元素分析結(jié)果如表2所示，表面白霜主要由C、O、K元素組成，C元素相對(duì)含量36.87%，O元素相對(duì)含量55.54%，K元素相對(duì)含量為7.59%。

3.2 FT-IR分析結(jié)果

3個(gè)批次的余甘子藥材表面白霜的紅外光譜相似（圖3），在3 424.27～3 444.47、1 724.53～1 725.18、1 628.98～1 632.21、1 452.85、1 239.34、1 060.64、918.13、667.50 cm?1處檢查到主要吸收峰度，其中3 424.27～3 444.47 cm?1可能是-OH拉伸振動(dòng)吸收峰，1724～1725 cm?1為R-COOH振動(dòng)吸收峰，1628～1632 cm?1為C=O或C=C拉伸振動(dòng)吸收峰，1 452.85 cm?1是C-C或C==C骨架振動(dòng)吸收峰，1 060.64 cm?1可能是C-O伸振動(dòng)吸收峰，918.13 cm?1可能是OH彎（面內(nèi)）振動(dòng)吸收峰，667.50 cm?1可能是NH2振動(dòng)吸收峰。

a-果霜結(jié)構(gòu)(×5000) b-果霜結(jié)構(gòu)(×5000) c-果霜結(jié)構(gòu)(×10 000) d-C元素分布圖 e-O元素分布圖 f-K元素分布圖

表2 樣品中各元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Table 2 Quality scores of each element from sample

元素質(zhì)量百分比/%原子百分比/%靜強(qiáng)度原子強(qiáng)度 C36.8745.58405.770.209 7 O55.5451.54550.440.114 6 K7.592.88260.280.065 6

圖3 3批樣品FT-IR光譜圖

3.3 UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

從余甘子表面白霜中鑒定出12個(gè)化合物，詳細(xì)信息如表3所示。由表3信息可知，余甘子表面白霜的化學(xué)組成主要是一些小分子的有機(jī)酸類(lèi)。

3.3.1 有機(jī)酸類(lèi)化合物 在白霜中主要發(fā)現(xiàn)3種有酸類(lèi)成分，主要有粘酸、檸檬酸、-(＋)蘋(píng)果酸，這些有機(jī)小分子酸類(lèi)，主要來(lái)源于植物細(xì)胞呼吸代謝中間體及產(chǎn)物，以化合物1粘酸為例，t＝0.52 min，母離子子峰/209.029 9 [M－H]?，二級(jí)離子碎片/191.020 1，/165.038 8，相對(duì)保留時(shí)間和/比通常與對(duì)照品粘酸一致，通過(guò)比較確定該化合物為粘酸?；衔?，t＝0.58 min，母離子峰/191.019 2 [M－H]?，二級(jí)離子碎片/85.028 5，/102.947 9，相對(duì)保留時(shí)間和/比通常與對(duì)照品檸檬酸一致，通過(guò)比較確定該化合物為檸檬酸?；衔?，t＝0.58 min，母離子峰/133.013 5 [M－H]?，二級(jí)離子碎片/115.002 8，/71.012 8，相對(duì)保留時(shí)間和/比與對(duì)照品-(＋)-蘋(píng)果酸保持一致。

3.3.2 鞣質(zhì)類(lèi)成分 余甘子中含有大量的鞣質(zhì)類(lèi)化合物，分為可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)，可水解鞣質(zhì)會(huì)進(jìn)一步分解為沒(méi)食子鞣質(zhì)和鞣花鞣質(zhì)，在余甘子藥材表面白霜中鑒定出2個(gè)鞣質(zhì)，化合物8，t＝8.26 min，母峰離子/483.078 6 [M－H]?，二級(jí)碎片離子/169.013 7、241.046 2，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)推斷為二沒(méi)食子酰葡萄糖?；衔?，R＝14.6 min，母峰離子/633.074 2 [M－H]?，二級(jí)碎片離子/300.999 2，相對(duì)保留時(shí)間和/比與對(duì)照品柯里拉京一致。

表3 余甘子藥材表面白霜化學(xué)成分分析

Table 3 Analysis of white frosting chemical composition on surface of roots of P. emblica

序號(hào)tR/min名稱(chēng)分子式理論值實(shí)際值誤差(×10?6)二級(jí)碎片離子 10.52粘酸C6H10O8209.030 2209.029 9 [M－H]–?1.4191.020 1, 165.038 8 20.55D-脯氨酸C5H9NO2116.070 6116.070 8 [M＋H]+1.770.055 7 30.56沒(méi)食子酸C7H6O5171.028 7171.028 7 [M＋H]+0127.039 0, 81.034 0 40.57沒(méi)食子酸甲酯C8 H8O5185.044 4185.044 4 [M＋H]+0153.018 2, 126.031 3 50.55粘酸-2-O-沒(méi)食子酸酯C13H14O12363.041 2363.041 3 [M－H]–0.285.028 6, 209.030 0 60.58檸檬酸C6H8O7191.019 7191.019 2 [M－H]–?2.685.028 5, 102.947 9 70.58DL-(＋)-蘋(píng)果酸C4H6O5133.014 2133.013 5 [M－H]–?5.2115.002 8, 71.012 8 88.26二沒(méi)食子酰葡萄糖C20H20O14483.078 0483.078 6 [M－H]–1.2169.013 7, 241.046 2 914.60柯里拉京C27H22O18633.073 3633.074 2 [M－H]–1.4300.999 2 1015.80鞣花酸C14H6O8300.998 9300.999 3 [M－H]–1.3257.008 0 1116.501-(carboxymethyl)cyclohexanecarboxylic acidC9H14O4187.096 4187.096 5 [M－H]–0.5141.091 4, 185.081 5 1217.20槲皮素C15H10O7303.049 9303.050 1 [M＋H]+0.6153.018 3

3.3.3 酚酸類(lèi)化合物 余甘子中酚酸類(lèi)成分主要有沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸酯等，在余甘子藥材表面白霜中鑒定出4個(gè)酚酸類(lèi)成分。化合物3（沒(méi)食子酸），R＝0.56 min，母峰離子/171.028 7 [M＋H]+，二級(jí)碎片離子/127.039 0、81.034 0，相對(duì)保留時(shí)間和/比與對(duì)照品沒(méi)食子酸一致?；衔?（沒(méi)食子酸甲酯），R＝0.57 min，母峰離子/185.044 4 [M＋H]+，二級(jí)碎片離子153.018 2、126.031 3。化合物5（粘酸-2--沒(méi)食子酸酯），R＝0.55 min，母離子峰/363.041 3 [M－H]+，二級(jí)碎片離子/85.028 6、209.030 0，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)推斷為粘酸-2--沒(méi)食子酸酯?；衔?0（鞣花酸），R＝15.8 min，母峰離子/300.999 3 [M－H]–，二級(jí)碎片離子/257.008 0，相對(duì)保留時(shí)間和/比與對(duì)照品鞣花酸一致。

3.4 E-tongue分析結(jié)果

E-tongue通過(guò)傳感器陣列模擬人類(lèi)的味覺(jué)感知，從而提供接近人類(lèi)感官的味覺(jué)結(jié)果[10]。利用α-Astree感知系統(tǒng)分析對(duì)析霜及未析霜樣品的口感進(jìn)行評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，通過(guò)E-tongue系統(tǒng)分析可以發(fā)現(xiàn)析霜樣品的酸味變化最大，明顯增強(qiáng)，澀味和苦味也稍有增強(qiáng)，而余味及豐富度、咸味沒(méi)有明顯變化（圖4）。E-tongue分析說(shuō)明余甘子析霜對(duì)余甘子風(fēng)味影響變化明顯，主要影響在余甘子酸味及澀味。

3.5 pH測(cè)定及志愿者風(fēng)味評(píng)價(jià)結(jié)

3.5.1 pH測(cè)定結(jié)果 分別測(cè)定了析霜余甘子藥材與未析霜余甘子藥材的濾液pH值，表面析霜的余甘子藥材濾液pH值低于未析霜藥材的pH值。表面析霜的余甘子藥材濾液pH值主要集中在3.62～3.96，未析霜的余甘子藥材濾液pH值主要集中在6.31～6.48（圖4），即析霜余甘子藥材的濾液酸性更強(qiáng)。

表4 不同稀釋比下的味覺(jué)信息值(n = 3)

Table 4 Taste information values of different dilution ratios (n = 3)

序號(hào)酸味苦味澀味回味-B回味-A鮮味豐富度咸味 S1?2.291.484.870.726.814.296.85?1.91 S2?1.751.234.000.616.294.006.95?1.83 S3?1.501.053.200.475.494.406.97?1.26 S4?22.316.584.970.002.258.925.93?1.13 S5?19.877.524.71?0.151.388.656.01?1.98 S6?12.595.784.450.112.787.086.42?2.84

a-pH測(cè)定結(jié)果 b-志愿者風(fēng)味評(píng)價(jià)熱圖 c-電子舌分析結(jié)果 d-主成分分析圖

3.5.2 志愿者口嘗實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將口嘗試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，先對(duì)志愿者評(píng)分做Spearman系數(shù)檢驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果中達(dá)到剔除水平的數(shù)據(jù)進(jìn)行循環(huán)剔除。按照“2.6.4”項(xiàng)的方法對(duì)余甘子風(fēng)味評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。利用Hiplot軟件對(duì)志愿者評(píng)分進(jìn)行熱圖分析。紅、黑、綠代表高、中、低3個(gè)豐度，豐度越高代表感官感知能力越強(qiáng)。同一批次的余甘子藥材，析霜者酸味明顯高于未析霜者，澀味也是類(lèi)似規(guī)律，析霜后苦味也略有增強(qiáng)，而生津作用在析霜后也明顯增強(qiáng)（圖4）。采用SIMCA-P軟件（version 14.0，Umea，瑞典）對(duì)供試品進(jìn)行主成分分析，選擇集中法（Ctr）作為標(biāo)度法，結(jié)果表明，主成分分析（principal component analysis，PCA）能充分反映表面析霜余甘子藥材和表面無(wú)霜余甘子藥材的基本特征和主要信息，PCA分析后每批樣品的得分圖如圖4所示。評(píng)分圖顯示，表面析霜的余甘子藥材與表面未析霜的余甘子藥材有明顯區(qū)別，并且表面析霜的余甘子藥材更加分散。

表5 志愿者味覺(jué)評(píng)價(jià)(n = 3)

Table 5 Evaluation of artificial taste (n = 3)

序號(hào)酸味澀味苦味回味-A唾液分泌 S16.839.799.9012.047.81 S211.2013.8210.848.3010.13 S311.4316.248.6010.489.40 S42.5411.444.3310.706.19 S54.5011.713.5511.925.94 S65.7211.705.2411.738.25

3.6 質(zhì)譜成像結(jié)果

比較干燥前后的成分遷移（圖5），可以發(fā)現(xiàn)，干燥前-(＋)-蘋(píng)果酸（/133.013 5 [M－H]–），沒(méi)食子酸（/171.028 7 [M＋H]+）在余甘子中心分布較多，在表層含量較低，主要集中在余甘子內(nèi)部。干燥過(guò)程中，蘋(píng)果酸與沒(méi)食子酸成分隨水分的散失，向余甘子表層發(fā)生遷移，這為儲(chǔ)存過(guò)程的析霜提供了物質(zhì)條件。

a-干燥前DL-(＋)-蘋(píng)果酸質(zhì)譜成像圖 b-干燥后DL-(＋)-蘋(píng)果酸質(zhì)譜成像圖 c-干燥前沒(méi)食子酸質(zhì)譜成像圖 d-干燥后沒(méi)食子酸質(zhì)譜成像圖

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸、蘋(píng)果酸等小分子有機(jī)酸是余甘子藥材表面白霜的主要成分，其形成過(guò)程可能與鮮果干燥過(guò)程中的持續(xù)呼吸代謝密切相關(guān)[16]。在果實(shí)或果實(shí)類(lèi)藥材中，有機(jī)酸的組成和含量通常隨果實(shí)發(fā)育而變化，如蘋(píng)果[17]、柑橘[18]、檸檬[19]等。有機(jī)酸通常在果實(shí)發(fā)育的早期積累，在果實(shí)成熟時(shí)作為呼吸底物，成熟果實(shí)中有機(jī)酸的最終濃度取決于有機(jī)酸生物合成、降解和液泡貯藏的平衡；在果實(shí)采收干燥階段，果實(shí)內(nèi)細(xì)胞尚存活，但表皮細(xì)胞由于直接受到干熱脅迫作用，其呼吸和代謝作用增強(qiáng)，通過(guò)苯丙烷生物途徑大量合成黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物，該過(guò)程導(dǎo)致其內(nèi)部的活性次生代謝物含量增加[20]。而在貯藏過(guò)程中，果實(shí)（藥材）表皮細(xì)胞已經(jīng)死亡，大量活性成分從表皮細(xì)胞中析出，同時(shí)隨著表面微生物對(duì)鞣質(zhì)類(lèi)成分的水解轉(zhuǎn)化等作用[21]，藥材中的代謝物會(huì)發(fā)生遷移和轉(zhuǎn)化，逐漸析出到余甘子藥材表面上。因此，余甘子干燥階段受干熱脅迫作用表面成分含量逐漸增加，而在貯藏階段由于微生物和細(xì)胞內(nèi)成分遷移作用，霜類(lèi)成分如沒(méi)食子酸、檸檬酸等發(fā)生進(jìn)一步富集作用，從而逐漸形成“析霜”現(xiàn)象。此外，在志愿者口嘗實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含服表面析霜樣品時(shí)，唾液分泌次數(shù)及分泌量強(qiáng)于未析霜樣品，生津止渴作用增強(qiáng)。而豐富的有機(jī)酸已被證明對(duì)人類(lèi)健康有益[22]。例如，檸檬酸、蘋(píng)果酸等代謝后堿化可以預(yù)防低水平代謝性酸中毒。除了堿化作用外，有機(jī)酸還可以調(diào)節(jié)大腸中短鏈脂肪酸的生成，并且可能通過(guò)降低結(jié)腸pH值增加礦物質(zhì)的吸收，特別是鈣和鎂離子的吸收[23]。同時(shí)，對(duì)于不同種類(lèi)的藥材而言，“析霜”的成分具有一定差異，如厚樸經(jīng)姜炮制析霜后，厚樸酚及和厚樸酚含量增加[24-25]，綜上所述，余甘子“析霜者佳”的科學(xué)內(nèi)涵主要體現(xiàn)為以下2點(diǎn)：一是干熱脅迫導(dǎo)致的表面細(xì)胞次生代謝物含量增加，如《中國(guó)藥典》指標(biāo)性成分沒(méi)食子酸等在貯藏階段逐步析出形成霜類(lèi)成分，析霜代表有效成分含量的增加；二是霜內(nèi)的有機(jī)酸成分使得余甘子生津作用及健胃消食作用增強(qiáng)，有利于其藥效發(fā)揮。

本實(shí)驗(yàn)研究了余甘子表面白霜的化學(xué)本質(zhì)及其析霜的可能途徑，初步揭示了余甘子“析霜者佳”科學(xué)內(nèi)涵，為余甘子商品規(guī)格劃分和品質(zhì)評(píng)價(jià)及中藥炮制領(lǐng)域析霜類(lèi)藥材的品質(zhì)與機(jī)理等研究提供一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 黃浩洲, 冉飛, 譚慶芻, 等. 藥食同源品種余甘子綜合開(kāi)發(fā)利用策略與思路 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(5): 1034-1042.

[2] Huang H Z, Qiu M, Lin J Z,. Potential effect of tropical fruitsL. for the prevention and management of type 2 diabetic complications: A systematic review of recent advances [J]., 2021, 60(7): 3525-3542.

[3] 黃浩洲, 陳敬財(cái), 張定堃, 等. 余甘子研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(21): 5533-5544.

[4] Avula B, Wang Y H, Wang M,. Simultaneous determination and characterization of tannins and triterpene saponins from the fruits of various species ofand Phyllantususing a UHPLC-UV-MS method: Application to triphala [J]., 2013, 79(2): 181-188.

[5] Yang B R, Liu P Z. Composition and biological activities of hydrolyzable tannins of fruits of[J]., 2014, 62(3): 529-541.

[6] Zhao T J, Sun Q, Marques M,. Anticancer properties of(Indian gooseberry) [J]., 2015, 2015: 950890.

[7] Variya B C, Bakrania A K, Patel S S.officinalis (Amla): A review for its phytochemistry, ethnomedicinal uses and medicinal potentials with respect to molecular mechanisms [J]., 2016, 111: 180-200.

[8] 于大慶, 查良平, 彭華勝. “析霜”類(lèi)藥材的種類(lèi)及其歷史源流 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(12): 2624-2627.

[9] 尚志均集. 雷公炮灸論 [M]. 合肥: 安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 1991: 40.

[10] (明)李時(shí)珍. 本草綱目: 校點(diǎn)本 [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1982: 1239.

[11] 南京藥學(xué)院藥材教研組集體. 藥材學(xué) [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1960: 328.

[12] 羅傳紅, 黃勝杰, 胡琪琪, 等. 去核對(duì)余甘子藥材質(zhì)量的影響 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2021, 27(9): 147-156.

[13] 代悅, 于定榮, 劉穎, 等. 基于智能感官分析技術(shù)探討古代經(jīng)典方法炮制過(guò)程中苦參的氣味和味道變化規(guī)律 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(24): 6410-6416.

[14] Kobayashi Y, Habara M, Ikezazki H,. Advanced taste sensors based on artificial lipids with global selectivity to basic taste qualities and high correlation to sensory scores [J].(), 2010, 10(4): 3411-3443.

[15] 李潘, 韓雪, 林俊芝, 等. 志愿者感官試驗(yàn)在藥物味覺(jué)評(píng)價(jià)的運(yùn)用及發(fā)展研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2017, 52(22): 1971-1975.

[16] Xi W P, Zheng H W, Zhang Q Y,. Profiling taste and aroma compound metabolism during apricot fruit development and ripening [J]., 2016, 17(7): E998.

[17] Saradhuldhat P, Paull R E. Pineapple organic acid metabolism and accumulation during fruit development [J]., 2007, 112(3): 297-303.

[18] Albertini M V, Carcouet E, Pailly O,. Changes in organic acids and sugars during early stages of development of acidic and acidlessfruit [J]., 2006, 54(21): 8335-8339.

[19] 李文云, 羅懌, 鄭乾明, 等. 3個(gè)檸檬品種果實(shí)非可食部分初生代謝物分析 [J]. 中國(guó)南方果樹(shù), 2019, 48(5): 13-16.

[20] 陳浩, 孫進(jìn)華, 王樹(shù)軍, 等. 霜疫霉侵染對(duì)不同荔枝品種果皮苯丙烷類(lèi)代謝的影響 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2021, 42(6): 1694-1699.

[21] 胡夢(mèng), 程玉冰, 張培燕, 等. 百藥煎中轉(zhuǎn)化鞣質(zhì)生成沒(méi)食子酸的最佳菌種組合篩選 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2018, 20(4): 453-457.

[22] Demigné C, Sabboh H, Puel C,. Organic anions and potassium salts in nutrition and metabolism [J]., 2004, 17(2): 249-258.

[23] Sabboh H, Besson C, Tressol J C,. Organic potassium salts or fibers effects on mineral balance and digestive fermentations in rats adapted to an acidogenic diet [J]., 2006, 45(6): 342-348.

[24] 呂玲玲, 謝松, 張凱媛, 等. 厚樸飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(21): 3239-3243.

[25] 鐘凌云. 基于“析霜”特色的江西姜厚樸炮制機(jī)理研究 [A] // 2014年全國(guó)中藥炮制學(xué)術(shù)年會(huì)暨中藥飲片創(chuàng)新發(fā)展論壇及協(xié)同創(chuàng)新聯(lián)盟會(huì)議會(huì)議講義 [C]. 南京: 中國(guó)中藥協(xié)會(huì), 2014: 110-120.

Preliminary study on chemical composition from surface frost of fruits ofand scientific connotation of “frost precipitation”

TAN Qing-chu1, HUANG Hao-zhou1, LIN Jun-zhi2, QIU Min1, LI Wan1, TAN Peng3, FAN San-hu4, HAN Li1, ZHANG Ding-kun1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, China 3. Key Laboratory of Biological Evaluation of TCM Quality of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China 4. Sanajon Pharmaceutical Group, Chengdu 610000, China

To study the chemical composition from the white frost on the surface of the fruits ofand the effect of frost precipitation on its fluid production, in order to provide a scientific basis for the traditional cognition of "frost precipitation is better" of.The white frost formed on the surface of the fruits ofwas collected. The chemical components of the white frost formed on the surface of the fruits ofduring storage were analyzed by scanning electron microscope (SEM), energy dispersive spectroscopy (EDS), fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and UPLC-Q-TOF-MS; Electronic tongue (E-tongue) combined with sensory evaluation of volunteers was used to study the changes of fluid generating effect before and after frost precipitation on the surface of medicinal materials; The content and spatial distribution of compounds inwere studied by mass spectrometry imaging technology, and the possible changes of "frost evolution" metabolites were analyzed.SEM observation showed that the white frost precipitated on the surface of the fruits ofwas mainly composed of fine cluster crystal structure. EDS analysis showed that the frost was mainly composed of organic matter, mainly containing R-COOH, C-C, C-O and other functional groups; UPLC-Q-TOF-MS study found that the main components of white cream were small molecular organic acids and polyphenols, such as mucic acid, citric acid,-(＋) malic acid and gallic acid. Sensory evaluation and E-tongue study found that after surface frosting, the acidity, astringency and bitterness of the filtrate of the fruits ofincreased in varying degrees, and the effect of fluid generation was more obvious; Mass spectrometry imaging results showed that the surface migration of malic acid, gallic acid and other components occurred with the drying of.The white frost on the surface of the fruits ofis mainly small molecular organic acids and polyphenols. After "frost separation", the acidity, astringency and bitterness are enhanced, the content of effective components is increased, and the effects of promoting fluid, stomach and digestion are enhanced.

L; composition change; frosting; sensory evaluation; mucic acid; citric acid;-(＋) malic acid; gallic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)11 - 3487 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.027

2021-10-26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973493）；四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFN0100）；三勒漿藥業(yè)-成都中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2019-YF04-00086-JH）；四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2021MS018）

譚慶芻，男，在讀碩士，從事中藥制劑新技術(shù)研究。E-mail: 2842054278@qq. com

張定堃，男，副教授，從事中藥制劑新技術(shù)與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail: zhangdingkun@cdutcm.edu.cn

韓 麗，女，教授，從事中藥制劑新技術(shù)研究。E-mail: hanliyx@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]