姜德文 吳明凱 張永豪 龍治峰

摘要：目的 運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)靶向野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的潛在活性小分子。方法 選取野生型（WT）和S94A突變型（S94A）Enoyl-ACP還原酶蛋白作為受體，運(yùn)用Autodock vina從Specs和Chemdiv商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選具有抗結(jié)核潛力的雙靶向野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶活性小分子。結(jié)果 與野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶結(jié)合親和力排名前2300的小分子共12個(gè)。結(jié)論：小分子AK-968/12686317和S035-0495是潛在的靶向野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶活性小分子。

關(guān)鍵詞：S94A突變型;Enoyl-ACP還原酶;分子對(duì)接，結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性疾病。2020年全世界結(jié)核病新發(fā)生987萬例，發(fā)病率達(dá)0.127%，死亡率達(dá)0.017%。中國(guó)作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，結(jié)核病新發(fā)生84.2萬例，高居世界第二位，發(fā)病率高達(dá)0.059%，死亡率達(dá)到0.0021%[1～2]。目前針對(duì)結(jié)核病常用的藥物主要有異煙肼、鏈霉素、利福平等。然而，隨著藥物的廣泛運(yùn)用，耐多藥結(jié)核病已經(jīng)是全世界共同面臨的重大公共衛(wèi)生新挑戰(zhàn)，嚴(yán)重阻礙了結(jié)核病的治療和防控[3]。

隨著核心一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼耐藥的發(fā)生，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物減少耐藥的發(fā)生迫在眉睫[4]。異煙肼被認(rèn)為是結(jié)核病化療的基石，探究其抗結(jié)核作用機(jī)制，特別是分子耐藥機(jī)制，將有助于正確選擇抗結(jié)核藥物，并將促進(jìn)新型靶向抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)[5～7]。Enoyl-ACP還原酶（Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase）是異煙肼的作用靶點(diǎn)，當(dāng)氨基酸絲氨酸（S）94突變成甘氨酸（A）后，會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼的耐藥[8～9]。如果設(shè)計(jì)一些同時(shí)抑制野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶的小分子，將較好地緩解Enoyl-ACP還原酶S94A突變引起的結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題。本研究采用分子對(duì)接方法，篩選同時(shí)與野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶具有較好結(jié)合親和力的小分子，為抗結(jié)核分枝桿菌Enoyl-ACP還原酶發(fā)生S94A突變提供一定的參考依據(jù)。

1方法

（1）野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶受體準(zhǔn)備

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別提取野生型S94A Enoyl-ACP還原酶（PDB ID：2B35）和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶（PDB ID：2NV6）蛋白-配體復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，運(yùn)用pymol軟件去掉水分子，運(yùn)用AutoDockTools1.5.6進(jìn)行蛋白準(zhǔn)備，加氫并以配體為核心定義20*20*20的盒子大小為活性位點(diǎn)。

（2）配體準(zhǔn)備

配體小分子選取Specs和Chemdiv商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)的小分子，經(jīng)過優(yōu)化加氫處理后，再用OpenBabel進(jìn)行切割，將小分子sdf格式轉(zhuǎn)成pdbqt格式文件，且每個(gè)小分子以數(shù)據(jù)庫(kù)的名字命名，即獲取準(zhǔn)備好的配體。

（3）分子對(duì)接

運(yùn)用Autodock Vina將準(zhǔn)備好的小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶進(jìn)行分子對(duì)接，通過對(duì)接打分判斷小分子與蛋白的結(jié)合強(qiáng)弱，選取對(duì)接打分排名前2300的小分子進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1 小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶結(jié)合情況

分別選取與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶對(duì)接打分靠前的N084-1026、G194-0411和4296-0065等2300個(gè)小分子進(jìn)行疊合，發(fā)現(xiàn)有12個(gè)小分子是重復(fù)的（見圖1），即提示這12個(gè)小分子同時(shí)與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶有較強(qiáng)的親和力。它們分別為小分子N084-1026、715-0286、AE-848/11829359、4296-0065、2188-1976、AK-778/11278028、G843-0635、G194-0411、4552-4269、T425-1160、AK-968/12686317和S035-0495。

2.2 潛在活性分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶相互作用模式

為了進(jìn)一步找到最具有潛力去抑制野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的小分子，本研究比較了12個(gè)小分子與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的對(duì)接打分結(jié)果，如圖2所示，這些小分子與野生型Enoyl-ACP還原酶的對(duì)接打分在-7.2 kcal/mol ～ -10.0 kcal/mol之間，與突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的對(duì)接打分在-6.8 kcal/mol ～ -9.6 kcal/mol之間。通過統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對(duì)接打分同時(shí)優(yōu)于-9.5 kcal/mol的小分子為AK-968/12686317和S035-0495。

結(jié)合以上對(duì)接打分所得到的結(jié)果，本研究考察了排名靠前的小分子AK-968/12686317和S035-0495分別與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶的相互作用模式（見圖3）。在野生體系中，小分子AK-968/12686317與Enoyl-ACP還原酶的Met98形成兩個(gè)氫鍵，與Try158形成π-π堆積作用;在S94A突變體中，雖然氫鍵消失，但是AK-968/12686317的疏水端與Phe149和Trp222形成強(qiáng)的π-π堆積作用。小分子S035-0495在野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶中，均能形成較強(qiáng)的氫鍵作用。此外，疏水性苯環(huán)插入由Phe149、Tyr158和Ile215組成的空腔中，能夠增強(qiáng)它們之間的作用。

3 結(jié)論

結(jié)核病是一種主要以呼吸道傳播途徑引起的慢性疾病，因其治療周期較長(zhǎng)，會(huì)對(duì)患者造成極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于預(yù)后療效不良、失訪率較高等因素影響，導(dǎo)致結(jié)核病發(fā)病率在近年來呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，尤其以耐藥性結(jié)核病較為多見[10～11]。耐藥性結(jié)核病防治困難重重，尋找靶向抗結(jié)核藥物是臨床亟待解決的關(guān)鍵問題。鑒于以上的需求，本課題以一線抗結(jié)核經(jīng)典藥物異煙肼對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用為切入點(diǎn)，設(shè)計(jì)同時(shí)對(duì)野生型和S94A突變型Enoyl-ACP還原酶都具有抑制作用的小分子來解決結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題。

本研究通過運(yùn)用分子模擬技術(shù)在PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同時(shí)與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶有較強(qiáng)親和力的12個(gè)活性小分子，再選用Autodock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，以考察12個(gè)活性小分子分別與野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶之間的相互作用后，顯示AK-968/12686317和S035-0495

小分子是潛在的野生型和突變型S94A Enoyl-ACP還原酶抑制劑。

綜上所述，為了有效遏制耐藥性結(jié)核病例的發(fā)生，必須積極尋找到相關(guān)靶向藥物，尤其是找到活性小分子靶向作用于耐藥性結(jié)核病的突變靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)的AK-968/12686317和S035-0495可能是較為有效抑制耐藥性結(jié)核的活性小分子。

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