■楊燕云 蔣魯杰 朱曉振 郭占勇 趙 磊 衣悅濤*

（1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.東營海躍水產(chǎn)科技有限公司，山東 東營 257500）

仿刺參（Apostichopus japonicus）是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，是海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱型產(chǎn)業(yè)。但隨著自然資源的過度捕撈和市場需求的不斷增長，仿刺參養(yǎng)殖規(guī)模在過去幾十年中迅速擴(kuò)大，養(yǎng)殖向規(guī)?；图s化方向發(fā)展，降低了刺參免疫系統(tǒng)清除病原菌定植和感染的有效性，使得大量傳染病暴發(fā)。應(yīng)用抗生類藥物控制細(xì)菌性疾病曾一度是國內(nèi)外普遍使用的方法，但由此造成了耐藥菌株產(chǎn)生、生態(tài)系統(tǒng)被破壞等嚴(yán)重后果，因而需要綠色可持續(xù)的防治手段。如今替代抗生素的產(chǎn)品逐漸被研發(fā)出來，包括微生態(tài)制劑、中草藥添加劑、天然活性物質(zhì)、免疫增強劑和益生元以及生物發(fā)酵飼料等。

固態(tài)發(fā)酵飼料作為生物發(fā)酵飼料的一種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中展示了良好的應(yīng)用效果。研究證明發(fā)酵飼料在改善水產(chǎn)動物生長性能、調(diào)節(jié)消化能力、免疫水平和腸道菌群平衡等方面具有積極作用。其作用機理主要包括：①海參飼料原料經(jīng)微生物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后仍存活著一定量的有益微生物，可以與病原菌競爭營養(yǎng)和附著位點，有助于清除病原菌；②經(jīng)發(fā)酵后，飼料中的益生菌與底物作用產(chǎn)生大量活性物質(zhì)，如多肽、酶類等，為機體提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)消化，調(diào)節(jié)免疫力。但是，發(fā)酵飼料仍存在一些亟待解決的問題。在飼料運輸存放過程中，存儲條件不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生益生菌失活現(xiàn)象。

為了彌補以上問題，本研究在發(fā)酵飼料中添加了菊芋全粉益生元。益生元是一類只能被益生菌分解利用，不直接被機體吸收的物質(zhì)，可以促進(jìn)宿主腸道內(nèi)益生菌增殖，彌補發(fā)酵飼料有益微生物易失活的缺陷。菊粉是一種水溶性益生元，在調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物（如魚、蝦等）腸道菌群平衡，改善其免疫系統(tǒng)功能，促進(jìn)生長等方面具有良好效果。菊芋全粉由菊芋塊莖粗加工制得，菊粉含量約60%。相較于菊粉，菊芋全粉具有成本更低、溶出率低等優(yōu)勢，更適合水產(chǎn)養(yǎng)殖使用。因而本研究將菊芋全粉添加到發(fā)酵飼料中制成菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料，以探究其對仿刺參機體的影響，為益生元發(fā)酵飼料在仿刺參健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗所用對照（CT）組飼料為基礎(chǔ)飼料粗粉進(jìn)一步粉碎，過100 目篩后與海泥按6∶4 比例混合得到，基礎(chǔ)飼料粗粉與海泥均進(jìn)行滅菌處理（紫外線滅菌法），基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平如表1所示，CT組飼料主要營養(yǎng)成分為粗蛋白10.36%、粗纖維2.69%、粗脂肪1.06%。發(fā)酵飼料（FF）組飼料的制備步驟如下：在經(jīng)滅菌處理的基礎(chǔ)飼料粗粉中按照質(zhì)量比5%的接種量加入復(fù)合菌劑（菌落總數(shù)為8.75×109CFU/mL），復(fù)合菌劑由酵母菌（2.75×109CFU/mL）、枯草芽孢桿菌（2.95×109CFU/mL）、乳酸菌（3.05×109CFU/mL）按體積比1∶1∶1的比例均勻混合而成，再加入40%～50%的純化水，至飼料捏緊有水滲出松手又可散開的程度為宜。37 ℃條件下固體堆積發(fā)酵72 h，然后40～45 ℃低溫烘干、粉碎、過篩，與海泥按6∶4比例混合，F(xiàn)F組飼料主要營養(yǎng)成分為粗蛋白15.05%、粗纖維1.27%、粗脂肪1.12%。將菊芋全粉按15 g/kg 的比例添加到對照組飼料和發(fā)酵飼料中，得到菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料，即IBF 組和IFF 組飼料。FF組飼料和IFF組飼料的活菌數(shù)分別為1.75×108CFU/g和1.80×108CFU/g。

表1 基礎(chǔ)飼料組成?和營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.2 試驗動物與養(yǎng)殖管理

實驗室所用仿刺參由山東東營海躍水產(chǎn)科技有限公司養(yǎng)殖場提供。正式試驗前，用對照組飼料暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)結(jié)束后選取初始體重[（30.00±0.50）g]相近的240只成參，分成4組，每組設(shè)置6組平行試驗，用仿刺參循環(huán)水養(yǎng)殖平臺進(jìn)行養(yǎng)殖，周期60 d。養(yǎng)殖期間，保持水溫17～20 ℃，pH 8.0～8.1，溶解氧6.5～6.7 mg/L，鹽度27‰～29‰，氨氮含量＜1.0 mg/L，亞硝酸鹽氮含量＜0.1 mg/L。每天16：00 清理糞便后投喂餌料，投喂量為刺參體重的3%，每7 d換全部海水。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能

在正式養(yǎng)殖試驗開始和結(jié)束時分別稱量記錄刺參的初始體重（W0）和最終體重（Wt），養(yǎng)殖過程中記錄進(jìn)食量，并用以下公式計算刺參的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數(shù)（FC）。

式中：t——養(yǎng)殖試驗時間（60 d）；

F——總攝食量（g）。

1.3.2 免疫指標(biāo)測定

培養(yǎng)第60 天，每個水箱隨機抽取3 只刺參，從腹部收集體腔液，加入等量抗凝劑（0.02 mol/L EGTA、0.48 mol/L NaCl、0.019 mol/L KCl、0.068 mol/L Tris-HCl，pH 為7.6）。將3 個抗凝體腔液樣本混合成一個樣本混合物，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存待測。體腔細(xì)胞總數(shù)用血球計數(shù)板計數(shù)。

吞噬活性測定：將100 μL 的體腔液放入96 孔板中，25 ℃貼壁30 min，去掉懸液，然后加入100 μL 0.001 mol/L 中性紅溶液，在25 ℃下孵育30 min。用pH 7.6的PBS洗掉未被吞噬的中性紅，加入100 μL的細(xì)胞裂解液（乙醇∶冰醋酸=1∶1），裂解20 min，用酶標(biāo)儀測定540 nm波長處的吸光度OD值，在此試驗條件下每107個體腔細(xì)胞對應(yīng)的OD值表示吞噬活性。

酚氧化酶（PO）活性測定：首先制備體腔細(xì)胞破碎物上清液（CLS），將體腔液在4 ℃離心10 min（3 000 r/min），收集體腔細(xì)胞，棄去上清液，用PBS重懸細(xì)胞（pH 7.6），超聲細(xì)胞破碎儀冰水浴超聲（每次5 s，間隔10 s，共3次），后繼續(xù)4 ℃離心10 min（5 000 r/min）。取50 μL 制備的CLS 樣品和50 μL 0.1 mg/mL 胰蛋白酶放入96 孔板中，充分混勻，室溫下孵育10 min，加入50 μL 3 mg/mL左旋多巴，室溫下孵育5、10 min，測定492 nm波長處的吸光度OD值。

刺參體腔液樣品中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性采用試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）測定。

1.3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

養(yǎng)殖試驗結(jié)束，從每個水箱中隨機取3只刺參用70%乙醇溶液消毒表面后解剖，取出腸道及內(nèi)容物，剝離呼吸樹，無菌生理鹽水沖洗3次后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存待測。用DNA 提取試劑盒提取刺參腸道總DNA，通過PCR 擴(kuò)增原核核糖體RNA 基因（16S rDNA）的V3～V4 區(qū)，引物為338F 和806R。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測，最后構(gòu)建文庫、上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗、單因素方差分析（one-way ANOVA)，用Duncan’s多重比較法分析組間平均值的差異顯著性，以P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參生長性能的影響（見圖1～圖3）

圖1 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參增重率的影響

由圖1和圖2可知，與對照組（CT）相比，所有試驗組都顯著提高了刺參的增重率和特定生長率（P＜0.05）。其中，菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組的提高效果最明顯，但與菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，發(fā)酵飼料組對增重率和特定生長率也有一定的提高效果。

圖2 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參特定生長率的影響

由圖3 可知，試驗組均顯著降低了飼料系數(shù)（P＜0.05）。說明對飼料進(jìn)行發(fā)酵處理以及在基礎(chǔ)飼料和發(fā)酵飼料中添加菊芋全粉都能提高飼料的利用率，但各試驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參飼料系數(shù)的影響

2.2 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參非特異性免疫的影響

2.2.1 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參體腔細(xì)胞數(shù)目（TCC）的影響（見圖4）

圖4 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參TCC的影響

60 d 的養(yǎng)殖周期結(jié)束后對刺參各項免疫指標(biāo)進(jìn)行測定。由圖4可知，與對照組（1.63×106個細(xì)胞/mL）相比，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組（1.14×107個細(xì)胞/mL）和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組（1.40×107個細(xì)胞/mL）體腔細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.05），發(fā)酵飼料組（2.47×106個細(xì)胞/mL）增加效果不顯著（P＞0.05）。

2.2.2 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參吞噬活性的影響（見圖5）

圖5 菊芋全粉益?生元發(fā)酵飼料對仿刺參吞噬活性的影響

如圖5所示，與體腔細(xì)胞數(shù)量情況類似，相比于對照組，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組對刺參體腔細(xì)胞吞噬活性的提升有顯著效果（P＜0.05），且菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組的吞噬活性最高。

2.2.3 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參酚氧化酶（PO）活性的影響（見圖6）

圖6 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參PO活性的影響

從圖6 可以看出，各試驗組刺參PO 活性較對照組均有所提高，但發(fā)酵飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組效果更顯著（P＜0.05），菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組活性最高，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2.4 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響（見圖7）

圖7 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參SOD活性的影響

由圖7可知，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組對提高刺參SOD 活性有一定作用，但效果不顯著（P＞0.05），發(fā)酵飼料組沒有提高。說明菊芋全粉和發(fā)酵飼料對SOD活性的影響較小。

2.2.5 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參總一氧化氮合酶（T-NOS）活性的影響（見圖8）

如圖8所示，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組T-NOS活性有所提高，但發(fā)酵飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組T-NOS 活性都呈現(xiàn)下降狀態(tài)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參T-NOS活性的影響

2.2.6 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性的影響（見圖9～圖10）

由圖9 和圖10 可知，各試驗組ACP 活性和AKP活性都所提高，其中菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組效果最為顯著（P＜0.05）。其他試驗組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖9 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參ACP活性的影響

圖10 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參AKP活性的影響

2.3 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物的影響

2.3.1 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物α多樣性的影響

60 d的養(yǎng)殖試驗周期結(jié)束后，通過Illumina MiSeq平臺進(jìn)行測序，所得高質(zhì)量序列聚類形成1 034個獨特操作分類學(xué)單元（OTUs，序列標(biāo)識97%）。α多樣性（alpha diversity）是指分析單個樣品中的物種多樣性，包含兩個主要因素：豐富度（richness）和均一性（evenness）。

由圖11～圖13可知，與對照組相比，各試驗組豐富度和多樣性均明顯提高，其中菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組的豐富度和多樣性最高。在均一性上，發(fā)酵飼料組略有降低，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組明顯降低。說明發(fā)酵飼料和在飼料中添加菊芋全粉能顯著改變刺參腸道微生物α多樣性（P＜0.05）。

圖11 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物豐富度的影響

圖13 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物均一性的影響

2.3.2 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物β多樣性的影響

圖12 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物多樣性的影響

Beta多樣性分析通過各樣本序列間的進(jìn)化關(guān)系及豐度信息計算樣本間距離，評價樣本間微生物群落是否具有顯著差異。圖14是基于Bray-Curtis 距離算法的PCoA二維圖，發(fā)酵飼料組和菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組菌群分散程度較接近，且均與對照組有明顯差異，菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組與對照組菌群分散程度相近。

圖14 不同處理組的主坐標(biāo)分析

非度量多維尺度法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）以點與點的距離來反映不同樣品所含腸道微生物群落分散情況的差異程度。由圖15 可知，NMDS 分析進(jìn)一步佐證了PCoA 分析的結(jié)果。說明發(fā)酵飼料和基礎(chǔ)飼料中添加菊芋全粉可以顯著改變刺參腸道菌群的菌落聚集情況（P＜0.05），在發(fā)酵飼料中添加菊芋全粉則影響較小。

圖15 不同處理組的非度量多維尺度分析

2.3.3 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參腸道微生物種類的影響

由1個對照組和3個試驗組全部OTU（基于97%相似性水平劃分）制作的Venn圖如圖16所示，有效OTU總數(shù)為1 034個，4個處理組共有的OTU數(shù)為253個。發(fā)酵飼料組和菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組特有的OTU 數(shù)較多，分別有216 個和200 個，菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組特有OTU 數(shù)量相對少一些。但從各試驗組與對照組共有OTU 數(shù)占各組比例來看，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組較少。

圖16 仿刺參腸道微生物共有OTU分析

圖17～圖18 是仿刺參腸道微生物在門水平和綱水平上的分布圖。在門水平上，各處理組仿刺參腸道微生物主要由變形菌門（1.98%～37.58%，彎曲桿菌綱、α-變形菌綱）、擬桿菌門（0～37.05%，擬桿菌綱）、疣微菌門（0～9.89%，疣微菌綱）、厚壁菌門（0～7.32%，芽孢桿菌綱）等組成。其中，變形菌門和厚壁菌門的相對豐度組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖17 不同處理組仿刺參微生物群落組成（門＞1%）

圖18 不同處理組仿刺參微生物群落組成（綱＞1%）

由圖19可知，在目水平上，豐度排名靠前的依次是紅桿菌、黃桿菌、疣微菌、葡萄球菌、芽孢桿菌和伯克氏菌。其中紅桿菌、葡萄球菌和芽孢桿菌組間差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組黃桿菌豐度提高，試驗組紅桿菌顯著降低（P＜0.05），發(fā)酵飼料組葡萄球菌豐度、芽孢桿菌豐度顯著升高（P＜0.05）。說明發(fā)酵飼料以及菊芋全粉都可以調(diào)節(jié)仿刺參腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，但各試驗組的具體影響有所不同。

圖19 不同處理組仿刺參腸道微生物豐度排序（目＞3%）

3 討論

3.1 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參生長性能的影響

菊芋全粉富含水溶性益生元的菊粉，具有調(diào)節(jié)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)、促進(jìn)腸胃功能、增強免疫力等作用。益生元的作用機制可能是：通過改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)益生菌增殖，降低有害菌比例，促進(jìn)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用從而利于動物的生長；改善腸道結(jié)構(gòu)，增加腸絨毛長度和腸道隱窩深度。進(jìn)而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。有研究表明，仿刺參的生長狀況與其腸道微生物有密切關(guān)系。菊芋全粉中含有約60%的菊粉，微溶于水且成本更低，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用愈加廣泛。發(fā)酵飼料從本質(zhì)上來看，融合了飼料、微生態(tài)制劑及酶制劑，將其應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮的是多種產(chǎn)品的綜合作用。初始飼料經(jīng)發(fā)酵菌種作用，部分大分子蛋白降解成刺參能直接消化吸收的小分子肽、氨基酸等，提高蛋白質(zhì)利用率，發(fā)酵飼料產(chǎn)生的生物活性因子還能提高飼料適口性。在研究中，將菊芋全粉添加到發(fā)酵飼料中，以探究菊芋全粉益生元與發(fā)酵飼料的協(xié)同作用。由結(jié)果可知菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料顯著提高了仿刺參的增重率、特定生長率，且降低了飼料系數(shù)，對生長性能的提高有顯著效果。這與賈晨晨（2019）和孟現(xiàn)堯（2020）的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加適量的菊芋全粉能顯著提高仿刺參和凡納濱對蝦的生長性能，仿刺參的成活率和生長速度得到明顯改善，凡納濱對蝦的特定生長率和增重率都有提升。除菊芋全粉外，還有很多功能性低聚糖是典型的益生元，如低聚木糖、褐藻寡糖等。李君華等（2016）研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.030%～0.075%的低聚木糖（XOS）顯著提高仿刺參幼參的生長性能，最適添加量為0.044%。Xu等（2017）將益生元菊芋全粉和褐藻寡糖按3∶1的比例加入?yún)f(xié)同添加劑，用于刺參養(yǎng)殖，提高了刺參的生長性能和非特異性免疫反應(yīng)，促進(jìn)其健康生長。另外，本研究結(jié)果也與孫興（2015）在研究固態(tài)飼料對刺參的影響時的結(jié)果一致，試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料將刺參增重率提高了18.30%，顯著減小臟壁比，對刺參生長有良好的促進(jìn)作用。王世英（2015）研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵海帶能通過提高產(chǎn)物粗蛋白含量促進(jìn)刺參生長，提高消化酶活性，并且優(yōu)于直接在飼料中添加益生菌。另外還有研究結(jié)果顯示生物發(fā)酵飼料提高了羅氏沼蝦的增重率，降低了鯉魚幼魚的飼料系數(shù)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，高水平發(fā)酵豆粕使得凡納濱對蝦生長性能下降，可能是發(fā)酵豆粕中的抗原蛋白造成的，說明發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用還需要更多的條件優(yōu)化。

3.2 菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參免疫力的影響

仿刺參是一種棘皮動物，缺乏特異性免疫反應(yīng)，除皮膚和黏膜外，非特異性免疫反應(yīng)是保護(hù)刺參免受病原菌感染的第一道防線，分為細(xì)胞免疫和體液免疫。相關(guān)指標(biāo)包括體腔細(xì)胞總數(shù)、吞噬活性及免疫酶（PO、SOD、NOS、ACP 和AKP）活性等?，F(xiàn)有研究表明，益生元能夠增強仿刺參非特異性免疫系統(tǒng)，一些功能性低聚糖益生元具有免疫調(diào)節(jié)功能，能與病原菌細(xì)胞表面或毒素等外源性抗原結(jié)合，減緩抗原吸收，增加抗原效價；還能通過促進(jìn)益生菌增殖提高水產(chǎn)動物體內(nèi)抗體水平，激活巨噬細(xì)胞吞噬活性。

體腔細(xì)胞吞噬是棘皮動物主要的非特異性防御機制，所以體腔細(xì)胞數(shù)量及吞噬活性能在一定程度上反映機體的免疫力。本試驗中菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組的刺參體腔細(xì)胞數(shù)和吞噬活性都有明顯提高，吞噬活性的提高可能與體腔細(xì)胞中與吞噬作用相關(guān)的兩類細(xì)胞：變形細(xì)胞和顆粒細(xì)胞數(shù)量的增加有關(guān)，也可能與體腔液中相關(guān)免疫因子凝集素、調(diào)理素有所聯(lián)系。PO在機體體內(nèi)出現(xiàn)病原體或組織受損時能精密地調(diào)控異物包裹過程中的黑化過程，從而起到防御效果，因而在棘皮動物非特異性免疫中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞壁所含胰蛋白酶、脂多糖、肽聚糖等成分可誘導(dǎo)激活PO 活性。發(fā)酵飼料組和菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組PO 活性顯著增強，說明發(fā)酵飼料中豐富的益生菌及其代謝產(chǎn)物可能激活了酚氧化酶原系統(tǒng)，使PO活性提高。這一結(jié)果，與前人的研究相近。賈晨晨（2019）發(fā)現(xiàn)飼料中添加菊芋全粉可明顯提高仿刺參PO 活性，增強吞噬細(xì)胞吞噬活性，提高體腔細(xì)胞數(shù)量，但不同免疫指標(biāo)對菊芋全粉敏感度不同。司濱（2017）發(fā)現(xiàn)殼寡糖對仿刺參體腔細(xì)胞吞噬活性和呼吸爆發(fā)有顯著提高，這可能是由于殼寡糖與體腔細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)了刺參的免疫反應(yīng)。SOD是一種抗氧化酶，已被證實在棘皮動物體內(nèi)存在，SOD既能直接參與抑制病原菌的過程又能及時清除在吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)時產(chǎn)生的活性氧自由基，進(jìn)而避免機體受到損傷。關(guān)于水產(chǎn)動物組織中SOD 活性受有關(guān)物質(zhì)影響的試驗，所得結(jié)論有較大差異。本試驗中各試驗組對SOD活性的影響不顯著，這是由于SOD 活性過高會減少呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子，降低防御能力，過低又無法發(fā)揮防止自身氧化受損害的作用，應(yīng)當(dāng)保持在一個正常范圍。而菊芋全粉益生元和發(fā)酵飼料產(chǎn)物可能是直接參與抑制自由基，維持了刺參體內(nèi)SOD活性的穩(wěn)定。NOS是非特異性免疫的重要組成部分，病原菌、免疫刺激物等能誘導(dǎo)iNOS 產(chǎn)生大量一氧化氮（NO），再通過反應(yīng)產(chǎn)生不同類型活性氮中間體，殺滅病原生物。菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組NOS活性增強，證實菊芋全粉對提高NOS 活性有一定作用，但發(fā)酵飼料會降低其活性，說明發(fā)酵飼料對機體的部分免疫因子增強效果受飼養(yǎng)動物種類、飼料原料種類、營養(yǎng)水平、養(yǎng)殖環(huán)境等多因素影響。這一結(jié)果與趙麗麗等（2019）和Wang 等（2014）的研究結(jié)果一致。ACP作為吞噬溶酶體的標(biāo)志酶之一，在體腔細(xì)胞進(jìn)行吞噬、包囊反應(yīng)時常伴隨著ACP的釋放，因此可以通過ACP活性高低判斷巨噬細(xì)胞的激活程度，從而評價機體免疫水平。AKP也是溶酶體的標(biāo)志酶之一，可以改變病原菌的表面結(jié)構(gòu)以提高其異己性，起到調(diào)理素的作用，可以作為判斷機體免疫力的重要指標(biāo)。本研究中菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料組ACP 和AKP 活性與對照組相比均有明顯提高。這與前人研究結(jié)果相近。李君華等（2016）在試驗中發(fā)現(xiàn)低聚木糖提高了仿刺參幼參相關(guān)免疫因子的合成，從而提高體腔液中SOD、AKP等免疫酶活性。陳萱等（2015）在異育銀鯽養(yǎng)殖試驗中發(fā)現(xiàn)，用發(fā)酵豆粕代替魚粉顯著提高其AKP活性。

3.3 仿刺參腸道微生物多樣性及組間差異分析

腸道微生物群會通過發(fā)育、營養(yǎng)消化、免疫和抗病等多種途徑影響宿主，已有研究表明腸道微生物在仿刺參生長的各個階段都發(fā)揮著重要的生理作用和防御作用。就豐度而言，主要是細(xì)菌在發(fā)揮作用，因而對仿刺參腸道菌群的研究分析具有重要意義。Song 等（2014）發(fā)現(xiàn)益生元可以通過直接刺激或優(yōu)化共生菌群的組成來激活魚的先天免疫系統(tǒng)。但目前關(guān)于仿刺參腸道微生物的研究較少，我們?yōu)榱颂骄烤沼笕垡嫔桶l(fā)酵飼料對刺參腸道微生物區(qū)系的影響，對其進(jìn)行了16S rDNA測序。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料顯著提高了刺參腸道微生物的豐富度和多樣性，降低了均一性，說明其改變了刺參的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。這與Dimitroglou等（2010）在金頭鯛飼料中添加甘露寡糖的養(yǎng)殖試驗結(jié)果相似。司濱（2017）也發(fā)現(xiàn)殼寡糖能夠增加仿刺參腸壁菌群多樣性和菌落豐度，但潘金露（2016）發(fā)現(xiàn)殼寡糖降低了大菱鲆腸壁菌群的豐富度，說明益生元對水產(chǎn)動物腸道菌群多樣性的作用還受其他因素影響。Beta多樣性方面，發(fā)酵飼料和菊芋全粉益生元基礎(chǔ)飼料組與對照組菌落分散差異顯著，但菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料沒有對刺參腸道菌落聚集情況產(chǎn)生較大影響，同源性更強，說明菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料不會導(dǎo)致刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的異?；?，佐證了其綠色安全性。Yang 等（2015）發(fā)現(xiàn)膳食補充β-葡聚糖顯著改變了刺參腸道微生物的Beta多樣性，但總體來說益生元和發(fā)酵飼料對水產(chǎn)動物的Beta 多樣性影響的研究比較少見。通過對仿刺參腸道微生物種類進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，菊芋全粉益生元和發(fā)酵飼料能顯著改變優(yōu)勢菌群中變形菌門和厚壁菌門豐度。變形菌門是豐度最高的一門，含有多種病原菌，試驗組降低了變形菌門豐度，說明菊芋全粉益生元和發(fā)酵飼料能夠抑制病原菌增殖。厚壁菌門能促進(jìn)多糖發(fā)酵，試驗組厚壁菌門豐度的增加說明其還可以促進(jìn)益生菌增殖。在目水平上，紅桿菌、葡萄球菌和芽孢桿菌各處理組間存在顯著差異。前人研究發(fā)現(xiàn)紅桿菌是一種水生光合細(xì)菌，是一種潛在的益生菌，可能與刺參的生長性能有關(guān)，在體型較大的刺參腸道內(nèi)紅桿菌數(shù)量較多。這一結(jié)論與本研究結(jié)果有所出入，說明影響仿刺參生長性能的因素較為復(fù)雜，還可能與腸道形態(tài)、消化酶活性等因素有關(guān)。各試驗組均提高了芽孢桿菌的豐度，芽孢桿菌對病原菌具有拮抗作用，具有良好的脫氮去磷活性，還能提高外源性消化酶活性。由此可見，菊芋全粉益生元和發(fā)酵飼料確實起到抑制病原菌增殖、提高益生菌豐度的作用。

4 結(jié)論

在本研究中，菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料顯著提高了仿刺參的增重率和特定生長率，降低了飼料系數(shù)。在提高免疫力方面，增加了體腔細(xì)胞總數(shù)、提高了體腔細(xì)胞吞噬活性，同時還提高了PO、ACP、AKP 等相關(guān)免疫酶活性。對仿刺參腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，提高了腸道菌群豐富度和多樣性，對病原菌具有明顯抑制作用，提高益生菌豐度，同時保障了微生物區(qū)系的同源性，沒有造成群落結(jié)構(gòu)異?；＞C上，在發(fā)酵飼料中添加菊芋全粉制備的菊芋全粉益生元發(fā)酵飼料對仿刺參養(yǎng)殖具有一定的正向效果，是一種具有極大潛在應(yīng)用價值的綠色安全飼料。