■肖 雷 頓耀豪 楊 曼 胡 迪 梁運(yùn)祥

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

我國是農(nóng)業(yè)大國，主要農(nóng)作物秸稈資源總量為7.9 億噸/年[1]。秸稈含有反芻動物所需的多種養(yǎng)分，玉米秸稈隨收獲時間的不同，其組成成分存在一定差異[2]，一般而言含粗纖維31%～41%、中性洗滌纖維約80%、酸性洗滌纖維約53%、蛋白質(zhì)3%～5%、脂肪0.5%～1%，為飼料化利用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。然而目前秸稈飼料化利用率不足20%，超過60%被廢棄或直接粉碎還田，有效利用率尚有巨大提升空間[3-4]。此外，秸稈中的主要成分為木質(zhì)纖維素，而木質(zhì)素和半纖維素以酯鍵、醚鍵、糖苷鍵和縮酸等共價鍵連接形成的鑲嵌結(jié)構(gòu)復(fù)合體會對纖維素形成“保護(hù)”屏障，阻礙瘤胃微生物和消化酶對秸稈中纖維組分及其他細(xì)胞內(nèi)容物的利用[5]，導(dǎo)致直接飼喂在瘤胃內(nèi)的降解率不足50%[6-7]，因此研發(fā)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理工藝在提高秸稈飼用價值上十分必要。在反芻動物飼用價值的評估方法中，瘤胃液體外消化[8-9]與半體內(nèi)消化[10-12]是兩種常見的方法，已被廣泛應(yīng)用于學(xué)術(shù)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中。然而這兩種方法瘤胃液取樣繁瑣，造瘺成本高昂，無法滿足大批量的評估需求。而瘤胃液作為體外產(chǎn)氣試驗(yàn)中微生物菌群的來源，一直以來被認(rèn)為是形成數(shù)據(jù)波動和誤差的重要原因，Cantet 等[13]研究表明即使在啟動正式試驗(yàn)前增加瘤胃液的“預(yù)孵育”環(huán)節(jié)，也并不能起到預(yù)期的對瘤胃液進(jìn)行均一化的效果。為了擺脫對瘤胃液的依賴，不少學(xué)者提出用動物糞便代替瘤胃液，Váradyová等[14]以美利奴羊糞便作為接種物發(fā)現(xiàn)糞便的產(chǎn)氣速率和產(chǎn)氣總量低于瘤胃液而不足以勝任，Zicarelli 等[15]卻在羊源糞便上得出相反的結(jié)論，認(rèn)為糞便可以作為瘤胃液的有效替代物。上述研究表明動物糞便作為體外產(chǎn)氣試驗(yàn)的接種物時同樣缺乏穩(wěn)定性。因此本研究提出了用馴化后的厭氧污泥替代瘤胃液的新型體外產(chǎn)氣法，對該方法的操作參數(shù)和條件進(jìn)行了說明和優(yōu)化，然后以此分別評估了兩種處理后的玉米秸稈，并采用二硝基水楊酸（DNS）和高效液相色譜（HPLC）法對結(jié)果進(jìn)行比較分析，為體外評估木質(zhì)纖維原料在反芻動物中的飼用價值提供新的借鑒思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈：來源于江蘇連云港2018 年秋收玉米秸稈，經(jīng)曬干后截短并機(jī)械粉碎，過篩保留尺寸10～40目的秸稈粉，常溫儲藏。

厭氧污泥：來源于某市政污水缺氧池污泥（市政污泥）與某酵母工廠發(fā)酵廢水厭氧池污泥（工廠污泥），取樣后4 ℃保藏，7 d內(nèi)用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秸稈預(yù)處理

秸稈經(jīng)兩種方法（PTⅠ、PTⅡ）預(yù)處理后，一部分直接烘干保存，另一部分用5倍及以上秸稈質(zhì)量的水浸洗后再烘干待用。

1.2.2 酶解糖測定

準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥后的秸稈樣品0.5 g至100 mL瓶中，加入50 mL配置好的含酶緩沖液，50 ℃100 r/min條件下振蕩酶解72 h。每次酶解設(shè)置不加秸稈的空白組以去除纖維素酶帶入糖的影響。將酶解后的樣品稀釋一定倍數(shù)，用DNS 法測定還原糖的含量，或采用HPLC檢測葡萄糖和木糖含量。

含酶緩沖液配置：將纖維素酶與半纖維素酶按4∶1（W/W）比例混合均勻，取7.5 g 混酶加入250 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，緩沖液濃度為0.2 mol/L，pH 為4.8。振蕩30 min使纖維素酶及半纖維素酶溶解后過濾，純化水沖洗殘?jiān)?，收集濾液加水至990 mL，加入10 mL 1%的疊氮化鈉和0.1 g青霉素鈉后混勻。

1.2.3 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)搭建

在體外搭建厭氧消化系統(tǒng)，需要關(guān)注3個部分：厭氧污泥的活性、厭氧消化環(huán)境的穩(wěn)定及CH4數(shù)據(jù)的監(jiān)測。

厭氧污泥由豐富的微生物菌群組成，其活性也與之息息相關(guān)。微晶纖維素作為纖維素標(biāo)準(zhǔn)品，其結(jié)構(gòu)與秸稈的可發(fā)酵成分相似，可以作為馴化底物；此外微晶纖維素的分子式（C6H5O10）確定，可通過Buswell方程計(jì)算出理論產(chǎn)CH4量[16]，單位為mL CH4/g VS（揮發(fā)性固體，volatile solids）。

式中：a——碳的系數(shù)（CaHbOc）；

b——?dú)涞南禂?shù)（CaHbOc）；

c——氧的系數(shù)（CaHbOc）。

因此，微晶纖維素的理論產(chǎn)CH4量為414 mL/g VS，可以通過實(shí)際產(chǎn)氣和理論產(chǎn)氣的差距判斷厭氧污泥的活性。故以微晶纖維素為底物，首先對兩種不同來源的厭氧污泥（市政污水缺氧池污泥與酵母發(fā)酵廢水厭氧池污泥）的厭氧消化活性進(jìn)行篩選，之后對更優(yōu)來源的污泥進(jìn)行多輪馴化，當(dāng)CH4產(chǎn)氣量達(dá)到理論產(chǎn)氣量的80%時，即獲得馴化后的高活性厭氧污泥。

厭氧消化環(huán)境的穩(wěn)定性包括厭氧度、溫度和傳質(zhì)效果。試驗(yàn)開始前，將裝料后的反應(yīng)器依次通過高純氮?dú)庀此㈨斂?，以除掉氧氣和保證啟動時的厭氧度；整個試驗(yàn)周期，反應(yīng)器都置于水浴鍋中以維持恒定溫度；每個反應(yīng)器的頂部都裝有一個攪拌電機(jī)，其連接的攪拌軸具有一定的彎曲角度但無攪拌槳葉，攪拌部件通過“手套箱”的原理與反應(yīng)器相連以此保證密封；攪拌電機(jī)設(shè)置為間歇工作模式。單個反應(yīng)裝置的體積為600 mL，工作體積為400 mL，具體如圖1所示。

圖1 厭氧消化反應(yīng)器

CH4產(chǎn)氣量由全自動甲烷潛力測試系統(tǒng)（RTK BMP）實(shí)時監(jiān)控，其原理是將反應(yīng)器實(shí)時產(chǎn)生的CH4先通過NaOH溶液吸收完畢其中的CO2，然后將剩下的CH4經(jīng)過計(jì)量單元，CH4在計(jì)量單元中形成依次釋放的大小恒定的氣泡，每個氣泡代表準(zhǔn)確標(biāo)定的體積值，通過記錄氣泡數(shù)即可得到CH4氣體體積。該設(shè)備可自動扣除初始純氮?dú)忭斂諏?shù)據(jù)造成的偏高的影響。

綜上所述，厭氧消化系統(tǒng)操作方法為：以微晶纖維素為底物，經(jīng)多輪馴化獲得高活性厭氧污泥；取適量馴化后的厭氧污泥和待測樣品，通過馬弗爐測定VS；取適量微晶纖維素105 ℃烘干至絕干；將5～10 g樣品分裝至反應(yīng)器中，再添加相應(yīng)的厭氧污泥，最后補(bǔ)水至總質(zhì)量為400 g；起始pH 范圍為7.5～8.2；空白對照，分裝等量污泥和水；陽性對照，用5～10 g微晶纖維素替代樣品；給反應(yīng)器裝好攪拌軸，通入高純氮?dú)? min，排空頂部空氣；接通全自動CH4潛力測定儀，設(shè)置攪拌模式為連續(xù)攪拌，待水浴鍋升溫至目標(biāo)溫度，啟動試驗(yàn)；測試過程保持水浴鍋水位與反應(yīng)器中液位基本持平。

?1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)條件優(yōu)化

由于秸稈的均一性較差，會導(dǎo)致CH4產(chǎn)量波動較大，使得組間差異不明顯；而微晶纖維素與纖維素結(jié)構(gòu)類似，其理論產(chǎn)CH4也能計(jì)算得出（414 mL/g VS），常作為CH4潛力測試中的陽性對照[17]。因此，微晶纖維素更適宜于作為厭氧消化條件優(yōu)化試驗(yàn)的發(fā)酵底物。

以微晶纖維素為底物分別對溫度、接種物與底物比例（inoculum to substrate ratio，iSR）（以VS 質(zhì)量比計(jì)）和碳酸氫鈉添加量進(jìn)行單因素優(yōu)化。發(fā)酵初始條件如表1所示，每隔24 h記錄CH4產(chǎn)量。

表1 體外產(chǎn)氣條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)評估玉米秸稈消化性能

以PTⅠ-水洗秸稈、PTⅠ-未水洗秸稈、PTⅡ-水洗秸稈、PTⅡ-未水洗秸稈和未處理秸稈5 種原料為底物進(jìn)行厭氧消化，厭氧消化條件為：55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氫鈉。同時，分別使用DNS法和HPLC法測定未處理和兩種預(yù)處理秸稈（未水洗）的酶解糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧污泥馴化（見圖2）

對酵母發(fā)酵廢水厭氧池污泥（工廠污泥）和市政污水缺氧池污泥（市政污泥）發(fā)酵微晶纖維素產(chǎn)CH4量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示，市政污泥的CH4累積量始終顯著低于工廠污泥（P＜0.05）。并且，隨著不斷地使用微晶纖維素馴化，工廠污泥的累積產(chǎn)CH4量從初始的193.2 mL/g VS提升到六輪次馴化后的363.9 mL/g VS，提高了88.4%。這表明經(jīng)馴化后的厭氧污泥中的菌群已經(jīng)適應(yīng)了以微晶纖維素作為單一碳源進(jìn)行厭氧消化，適合作為后續(xù)條件優(yōu)化的接種物。

圖2 不同來源污泥和馴化次數(shù)對微晶纖維素CH4發(fā)酵的影響

2.2 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)條件優(yōu)化（見圖3）

圖3A 結(jié)果表明55 ℃的高溫厭氧消化相較于35 ℃的中溫厭氧消化CH4產(chǎn)生速率和產(chǎn)量都明顯提高，55 ℃消化時第1天便開始啟動發(fā)酵，而35 ℃消化時第4 天才觀測到CH4的積累，表現(xiàn)出較長的停滯期。如圖3A所示，9 d的厭氧消化周期內(nèi)ISR值為2和3時CH4的累積曲線展現(xiàn)出相同的趨勢，最終CH4總產(chǎn)量無顯著差異（P＞0.05），但與ISR 值為1 相比，CH4產(chǎn)量提高了11.9%，且在前5 d 內(nèi)ISR 值為2 和3 時CH4產(chǎn)率與ISR 值為1 時的CH4產(chǎn)率差距更大，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇的最佳ISR值為2。

圖3B結(jié)果表明不同碳酸氫鈉添加量組（0、2、4 g）之間的CH4產(chǎn)率和產(chǎn)量沒有顯著區(qū)別（P＞0.05），說明堿度在本試驗(yàn)中不是限制因素。

圖3 不同溫度和ISR（A） 及碳酸氫鈉添加量（B）對微晶纖維素CH4發(fā)酵的影響

2.3 預(yù)處理秸稈的體外產(chǎn)氣評價（見圖4）

圖4 水洗前后PTⅠ秸稈（A）和PTⅡ（B）CH4發(fā)酵情況

秸稈預(yù)處理后纖維組分被破壞，微生物對其可降解性增強(qiáng)，必然會反映在厭氧消化的CH4產(chǎn)量上。圖4結(jié)果顯示經(jīng)PTⅠ和PTⅡ處理的秸稈7 d內(nèi)CH4產(chǎn)量和產(chǎn)率較未處理秸稈都明顯提高，PTⅠ-未水洗秸稈7 d的CH4產(chǎn)量為160.8 mL/g VS，較未處理秸稈的CH4產(chǎn)量112.3 mL/g VS提高了43.2%；而PTⅡ-未水洗秸稈7 d 的CH4產(chǎn)量為243.4 mL/g VS，較未處理秸稈的CH4產(chǎn)量159.0 mL/g VS 提高了53.1%。從7 d 的CH4總產(chǎn)量上看，PTⅡ秸稈可消化性較PTⅠ秸稈提高幅度更大，反映出PTⅡ處理較PTⅠ處理有更好的預(yù)處理效果。

圖4B顯示了PTⅡ-水洗秸稈、PTⅡ-未洗秸稈及原料秸稈在厭氧污泥系統(tǒng)中7 d 的產(chǎn)CH4情況，從發(fā)酵第1 天開始無論水洗還是未水洗的PTⅡ秸稈產(chǎn)CH4量始終高于未處理秸稈，說明PTⅡ秸稈更易被厭氧微生物分解利用。秸稈經(jīng)預(yù)處理后木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)打開，會產(chǎn)生有機(jī)酸、低聚糖及其他可溶性成分，水洗后這些易消化產(chǎn)CH4的成分部分流失，木質(zhì)纖維素“濃縮”，可發(fā)酵性降低、產(chǎn)氣量降低，所以水洗秸稈產(chǎn)氣量始終低于未水洗秸稈，以致發(fā)酵7 d 時產(chǎn)CH4量較未水洗秸稈低9.5%。圖4A 顯示的PTⅠ秸稈水洗前后產(chǎn)CH4情況與PTⅡ秸稈水洗前后產(chǎn)CH4趨勢一致，但7 d時產(chǎn)CH4量較未水洗低17%。

2.4 秸稈預(yù)處理效果評估方法對比（見表2）

表2 DNS法、HPLC法及厭氧消化法3種方法比較預(yù)處理效果

表2 展示了DNS 法、HPLC 法和體外產(chǎn)氣法對秸稈預(yù)處理效果的評估結(jié)果，預(yù)處理對秸稈消化率的提升均能在3種方法中得到體現(xiàn)。從提高率上看，3種方法皆顯示出PTⅡ效果優(yōu)于PTⅠ，反應(yīng)出新方法在評估秸稈預(yù)處理效果優(yōu)劣方面與傳統(tǒng)方法具有一致性。此外，通過CH4產(chǎn)量對應(yīng)的葡萄糖當(dāng)量數(shù)據(jù)，可以折算為體外條件下，PTⅠ和PTⅡ處理過的秸稈消化凈能分別約等于0.39 g和0.50 g葡萄糖消化凈能，更加直觀地體現(xiàn)出預(yù)處理環(huán)節(jié)對秸稈價值釋放的必要性。

3 討論

3.1 厭氧污泥采集與馴化

厭氧污泥應(yīng)選擇長期平穩(wěn)運(yùn)行的污水處理廠，以保證微生物菌群的活性與穩(wěn)定。一次性可采集足夠用于大批量試驗(yàn)的接種物，但應(yīng)對污水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)無不良影響（如本次試驗(yàn)單次采集了50 kg，TS約10%的厭氧污泥）。采集池或罐底部污泥，直接裝入可密封的容器，無需專用工具，無需刻意保持全程無氧，常溫儲存，相較于瘤胃液采集更加便捷。

厭氧污泥的活性是厭氧消化過程的關(guān)鍵，而不同來源的厭氧污泥，其微生物菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異[18]，從而影響了木質(zhì)纖維素的降解效果[19]。在馴化試驗(yàn)中，市政污泥的CH4累積量始終顯著低于工廠污泥，可能是因?yàn)榻湍赴l(fā)酵廢水中含有更加豐富的微量元素和更加均衡的營養(yǎng)物質(zhì)，使工廠污泥富集出了性能更加優(yōu)異的厭氧消化菌群。此外，微晶纖維素的理論CH4產(chǎn)量為414 mL/g VS，經(jīng)多輪次馴化后的工廠污泥對微晶纖維素的轉(zhuǎn)化率達(dá)87.7%，與Raposo 等[17]報(bào)道的85%轉(zhuǎn)化率基本相符，表明厭氧污泥的馴化已達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

3.2 體外產(chǎn)氣系統(tǒng)條件優(yōu)化

之前的研究表明，與中溫厭氧消解相比，高溫厭氧消解的反應(yīng)器中含有更多的木質(zhì)纖維素降解微生物，使其產(chǎn)CH4速率更快[20]，但中溫和高溫消化最終CH4總產(chǎn)量基本保持一致。雖然瘤胃溫度在39 ℃左右，遠(yuǎn)低于高溫厭氧消化的55 ℃，但作為一個體外評價方法，在保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定且可靠的前提下，還要綜合考慮獲得數(shù)據(jù)所需要的時間，因此確定以55 ℃作為體外厭氧消化的最佳溫度。

Feng 等[21]觀察到ISR 為1 時，在醋渣的厭氧消化試驗(yàn)過程中CH4產(chǎn)率最高，而Kawai 等[22]在消化廚余垃圾的過程中發(fā)現(xiàn)ISR 為3 時，觀測到最高的CH4產(chǎn)量。本研究和這些學(xué)者研究結(jié)果的差異說明最佳ISR可能會隨著所消化底物類型改變而變化，易消化的廚余垃圾更容易積累VFAs，所以依賴更高的ISR。

不同碳酸氫鈉添加量組對產(chǎn)CH4結(jié)果無顯著影響，可能是所提供的厭氧污泥自身具有一定的pH 緩沖能力，而微晶纖維素作為一類緩釋碳源，在厭氧消化時也不容易降解，中間產(chǎn)物VFAs 的積累沒有造成pH大幅下降至最適范圍之外。

綜上所述，厭氧消化的最優(yōu)條件是：55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氫鈉。

3.3 預(yù)處理秸稈體外產(chǎn)氣系統(tǒng)評價

通常秸稈在瘤胃內(nèi)的停留時間在72 h左右[23]，玉米秸稈NDF 含量70%左右，NDF 體內(nèi)消化率約50%～60%[24]，則推算瘤胃有效消化率為30%～35%[4]，假設(shè)消化部分主要為纖維素和半纖維素，則其產(chǎn)CH4量為120～145 mL。如圖4B 所示，PTⅡ處理秸稈和未處理秸稈3 d 厭氧消化產(chǎn)CH4量分別為202.5 mL/g VS 和132.0 mL/g VS，處理后產(chǎn)CH4量較處理前高53.41%，且產(chǎn)CH4量分別達(dá)到總產(chǎn)CH4量的83.20%和83.02%（以7 d為發(fā)酵終點(diǎn)，PTⅡ處理秸稈和未處理秸稈總產(chǎn)氣量分別為243.4 mL/g VS和159.0 mL/g VS），說明預(yù)處理不僅能增加秸稈產(chǎn)CH4潛力，還可以提高其產(chǎn)氣速率，且3 d厭氧消化產(chǎn)CH4量可以大致預(yù)測瘤胃消化率。

傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣法通常監(jiān)測的數(shù)據(jù)為總產(chǎn)氣體積，將本研究的玉米秸稈原料產(chǎn)甲烷數(shù)據(jù)折算成干基總產(chǎn)氣量（其中CO2含量按40%～50%折算，灰分按干基的10%計(jì)）則為198～237.6 mL/g（干基），與國內(nèi)外其他學(xué)者的數(shù)據(jù)194.9～242 mL/g（干基）相近[25-28]。然而韓肖敏等[29]和冉生斌等[30]分別以閹牛和小尾寒羊作為瘤胃液的采集供體，開展傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣試驗(yàn)用于評估玉米秸稈，2 d累積總產(chǎn)氣量卻分別只達(dá)到152.3 mL/g（干基）和142.9 mL/g（干基），顯著低于其他文獻(xiàn)的范圍。上述來自不同團(tuán)隊(duì)的數(shù)據(jù)差異較大，表明傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣法依賴于新鮮瘤胃液作為接種物，因而受限于供體對象的種類及健康狀態(tài)和取樣過程的設(shè)備及人員的專業(yè)程度，既難以開展大規(guī)模的同批次試驗(yàn)，又往往因不同批次的數(shù)據(jù)波動較大而無法橫向比較。

此外，傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣法普遍會監(jiān)測揮發(fā)酸組成及變化，以期獲得更詳細(xì)的體外消化數(shù)據(jù)。但體外模擬環(huán)境在兩個方面和體內(nèi)條件存在顯著差異：①無法模擬上皮細(xì)胞對揮發(fā)酸的直接吸收；②無法模擬反芻帶來的氧化還原電位周期性的波動。前者可能直接影響參與揮發(fā)酸代謝的菌群結(jié)構(gòu)，而后者則會對整個瘤胃菌群的組成造成擾動。因此，傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣在消化方面的數(shù)據(jù)與體內(nèi)實(shí)際情況可能相去甚遠(yuǎn)，重點(diǎn)關(guān)注產(chǎn)氣數(shù)據(jù)對于粗飼料原料的飼用潛力的評估意義更大。

3.4 秸稈預(yù)處理效果的3種評估方法比較

表2 顯示，3 種方法雖然在秸稈預(yù)處理效果評估都能分清優(yōu)劣，然而相較于原料秸稈，3種方法體現(xiàn)的酶解糖提高率和CH4產(chǎn)量提高率卻大相徑庭。分析可能的原因如下：

①DNS 法測得的還原糖含量與HPLC 法測得的總糖（葡萄糖和木糖）含量差距較大，其中HPLC 法計(jì)算的是葡萄糖和木糖含量之和，略低于實(shí)際酶解糖量；而DNS法測得的還原糖會因酚類（來源于本研究所采用的預(yù)處理過程）等具有還原性羥基的物質(zhì)存在高于實(shí)際酶解糖量，這兩種測糖方法本身就有一定局限性。

②秸稈中還有部分非纖維組分的有機(jī)物（如蠟質(zhì)和蛋白質(zhì)），厭氧消化時能夠貢獻(xiàn)CH4，而酶解糖中并沒有這部分含量，所以表2中3 d厭氧消化CH4產(chǎn)量的葡萄糖當(dāng)量要高于HPLC 法和DNS 法測得的糖含量，因而CH4產(chǎn)量提高率遠(yuǎn)低于酶解糖提高率。

③以原料秸稈3 d厭氧消化CH4產(chǎn)量為121.4 mL/g VS 計(jì)，相當(dāng)于323 mg 葡萄糖，與報(bào)道中秸稈40%～50%消化率（消化降解的木質(zhì)素不產(chǎn)氣）結(jié)果相近[6-7]。而HPLC 法和DNS 法測得的總糖和還原糖含量分別為111.9 mg/g和166.1 mg/g，遠(yuǎn)低于323.0 mg/g的葡萄糖當(dāng)量。即使秸稈中除木質(zhì)纖維素和灰分外所有12%有機(jī)成分優(yōu)先產(chǎn)CH4，HPLC 法和DNS 法的葡萄糖當(dāng)量也不到300 mg/g，則以酶解糖含量估算原料秸稈消化率和消化能結(jié)果會明顯偏低。說明在多菌群協(xié)同作用下，木質(zhì)纖維素的厭氧消化速率遠(yuǎn)高于單一纖維素酶酶解的速率，而多菌群協(xié)同作用促進(jìn)木質(zhì)纖維素消化正是瘤胃中存在的真實(shí)情況。

綜上所述，體外產(chǎn)氣與瘤胃消化過程類似，相當(dāng)于在體外構(gòu)建了一個多菌協(xié)同、菌酶協(xié)作的厭氧體系，并用CH4產(chǎn)氣量表征了VFAs 在瘤胃內(nèi)被直接吸收的情況，因此體外產(chǎn)氣法較酶解法更適合評估秸稈等木質(zhì)纖維素原料的瘤胃消化率。體外消化率與瘤胃真實(shí)消化率差異主要與體外產(chǎn)氣截止時間的選擇有關(guān)，即兩者消化速率不同，兩者產(chǎn)率不一致。但就體外消化3 d 快速產(chǎn)氣階段而言，兩者趨勢應(yīng)當(dāng)是一致的。因此，3 d 體外消化雖不能精確表示真實(shí)消化率，但可以大致反映瘤胃消化情況，足以準(zhǔn)確反映不同秸稈原料瘤胃消化率差距，適用于處理前后秸稈消化率和消化能提升效果評估。同時，相較于傳統(tǒng)的體外產(chǎn)氣試驗(yàn)，本方法擺脫了對新鮮瘤胃液的依賴，重復(fù)性更好，且更易于大批量操作。但需指出的是，傳統(tǒng)體外產(chǎn)氣試驗(yàn)經(jīng)過長年的、廣泛的應(yīng)用，發(fā)展出了一套完整且嚴(yán)格的操作過規(guī)范，而本方法雖然在本研究過程中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的、可重復(fù)的結(jié)果，但在相關(guān)實(shí)施細(xì)節(jié)上還需要更加全面的數(shù)據(jù)支撐，如污泥來源的選擇標(biāo)準(zhǔn)、污泥馴化成功與否的評判指標(biāo)、產(chǎn)氣試驗(yàn)的其他影響因素的分析等。

4 結(jié)論

本研究提出了以3 d厭氧消化產(chǎn)CH4量為指標(biāo)進(jìn)行反芻動物飼用秸稈預(yù)處理效果評估的方法，對厭氧消化條件進(jìn)行優(yōu)化，并對PTⅠ和PTⅡ處理秸稈及未處理秸稈進(jìn)行厭氧消化產(chǎn)CH4量進(jìn)行比較，得到以下結(jié)果：

以微晶纖維素為發(fā)酵底物篩選出多輪馴化后的工廠污泥作為接種物，進(jìn)一步優(yōu)化得到最適厭氧消化條件為55 ℃、ISR=2、不添加碳酸氫鈉，在該條件下能夠穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)3 d內(nèi)纖維原料產(chǎn)氣潛力的充分釋放。

預(yù)處理后秸稈產(chǎn)CH4潛力和產(chǎn)CH4速率都有提高，水洗后產(chǎn)CH4潛力和產(chǎn)CH4速率較水洗前有所降低，PTⅡ處理對體外產(chǎn)氣沒有抑制作用。

PTⅠ和PTⅡ分別可使秸稈厭氧消化3 d 產(chǎn)CH4量提高19.4%和53.4%，據(jù)此可推算每克秸稈經(jīng)PTⅡ處理后瘤胃消化凈能約等于0.50 g葡萄糖消化凈能。

體外產(chǎn)氣過程可大致模擬瘤胃消化情況，以馴化后的厭氧污泥代替新鮮瘤胃液作為接種物進(jìn)行3 d體外厭氧消化產(chǎn)CH4試驗(yàn)，是一種評估反芻動物飼用秸稈預(yù)處理效果的可行方法。并且與傳統(tǒng)的體外消化（瘤胃液發(fā)酵試驗(yàn)）和體內(nèi)消化（瘤胃真實(shí)消化）相比，該方法無需依賴動物模型且穩(wěn)定性好，批次處理量大，易于推廣。但是新方法后續(xù)仍需要更加廣泛而全面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，來形成普遍適用的操作規(guī)范，為科學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)提供新的可選方案。