馬 劍，張宏志，王 愈，梁明祥，邊道剛，馬艷弘,*

（1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；4. 徐州雙信食品有限公司，江蘇 徐州 221744）

菊芋（Helianthus tuberosusL.）俗稱洋姜、鬼子姜、五星草，為菊科（Compositae）向日葵屬（HelianthusL.）多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲，17 世紀(jì)傳入歐洲，后傳入中國(guó)，之后在我國(guó)大面積種植[1]。菊芋全身是寶，其塊莖營(yíng)養(yǎng)豐富，富含菊糖、酚酸、倍半萜內(nèi)酯類化合物等功能成分，具有降血糖、改善腸道微生物環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[2-3]，在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用；其葉片富含黃酮、多酚、菊糖、綠原酸等生物活性物質(zhì)[4-5]，具有抗氧化、殺蟲(chóng)抑菌、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等功效[6-10]。

我國(guó)菊芋資源豐富，有關(guān)菊芋的研究大多圍繞其塊莖進(jìn)行，如制備乳酸菌飲料[11]、菊粉[12]、菊芋濃縮汁[13]等產(chǎn)品，對(duì)于菊芋葉的研究卻相對(duì)較少，造成了菊芋葉資源的極度浪費(fèi)。袁曉艷等[4]報(bào)道了菊芋葉中含有豐富的酚類、黃酮、酚酸類化合物，具有極高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。本文以菊芋葉為原料，采用超聲輔助的方法提取菊芋葉中的多酚[14-15]，并通過(guò)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化菊芋葉多酚的提取工藝[16-17]，同時(shí)對(duì)提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為菊芋的全價(jià)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

菊芋葉：由江蘇碧青園海洋生物科技有限公司提供。

沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純?cè)噭嘿?gòu)自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；羥自由基試劑盒、抗超氧陰離子自由基試劑盒、2×10-4mol/L DPPH 溶液：均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

D-B5 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B 型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE6000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZD-F12 型真空冷凍干燥機(jī)：南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菊芋葉多酚提取工藝流程

新鮮菊芋葉→烘干（60 ℃，24 h）→粉碎、過(guò)篩（80目）→菊芋葉干粉（含水量＜5%）→超聲輔助提取（50%乙醇溶液）→離心（4 000 r/min，20 min）→提取液真空濃縮→AB-8 大孔樹(shù)脂純化→真空冷凍干燥→菊芋葉多酚凍干粉

1.2.2 菊芋葉多酚提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 料液比對(duì)菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，分別以料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），使用50%乙醇溶液于500 W 超聲功率條件下提取50 min，考察料液比對(duì)菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度對(duì)菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，以料液比1∶20（g/mL）于500 W 超聲功率條件下提取50 min，考察乙醇濃度對(duì)菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，使用50%乙醇溶液為提取劑，按照料液比1∶20（g/mL），以500 W 超聲功率分別提取10、20、30、40、50、60 min，考察超聲時(shí)間對(duì)菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率對(duì)菊芋葉多酚得率的影響

以菊芋葉凍干粉為原料，使用50%乙醇溶液為提取劑，按照料液比1∶20（g/mL），在超聲功率分別為200、300、400、500、600、700 W 條件下提取50 min，考察超聲功率對(duì)菊芋葉多酚得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化多酚提取條件。以料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率為自變量，依次用X1、X2、X3、X4表示，并以-1、0、1 分別代表各自的低、中、高水平，以多酚得率Y（mg/g）為響應(yīng)值，確定這4 個(gè)自變量對(duì)菊芋葉多酚得率的影響，同時(shí)得到菊芋葉多酚提取的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 因素及水平編碼表Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.2.4 菊芋葉多酚得率

配制濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5 mL 蒸餾水，1 mL 福林酚顯色劑，3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的碳酸鈉溶液，混勻，在45 ℃水浴鍋中水浴90 min，最后在波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：y=0.005 6x-0.035 3，R2=0.998 2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量，再按照如下公式計(jì)算多酚得率。

式中：C 為比色杯中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為多酚提取液總體積，mL；m 為稱取的菊芋葉質(zhì)量，g。

1.2.5 菊芋葉多酚抗氧化活性檢測(cè)

1.2.5.1 羥自由基（·OH）清除能力

根據(jù)參考姬妍茹等[18]和Shen 等[19]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，根據(jù)羥自由基測(cè)定方法，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，將分光光度計(jì)調(diào)零，同時(shí)以相同濃度的VC 溶液作陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度。·OH 清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 樣品液+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 處的吸光度；Aj為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 樣品液+1 mL 蒸餾水在526 nm 處的吸光度；A0為1 mL 硫酸亞鐵溶液+ 1 mL 水楊酸溶液+1 mL 蒸餾水+1 mL 0.5% H2O2溶液在526 nm 處的吸光度。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基（O2·）清除能力

根據(jù)參考Ding 等[20]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，按照試劑盒說(shuō)明書操作，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，將分光光度計(jì)調(diào)零，同時(shí)以相同濃度的VC 溶液作陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度。超氧陰離子自由基清除能力計(jì)算公式為：

式中：A0為對(duì)照組在520 nm 處的吸光度；Ai為樣品在520 nm 處的吸光度；Aj為標(biāo)準(zhǔn)品在520 nm 處的吸光度；C 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL。

1.2.5.3 DPPH 自由基（DPPH·）清除能力

根據(jù)參考Zhu 等[21]的方法，配制濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液，各取2 mL 于具塞試管中，再加入1 mL 2×10-4moL/L 的DPPH 溶液，搖勻后避光放置30 min。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，將分光光度計(jì)調(diào)零，同時(shí)以相同濃度的VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照，分別測(cè)定550 nm 處的吸光度。

式中：Ai為2 mL 樣品溶液+ 2 mL DPPH 溶液在550 nm 處的吸光度；Aj為2 mL 樣品溶液+ 2 mL 無(wú)水乙醇在550 nm 處的吸光度；A0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 無(wú)水乙醇溶液在550 nm 處的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件作圖，Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，SPSS 2007 軟件計(jì)算菊芋葉多酚IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)菊芋葉多酚提取效果的影響

料液比是決定菊芋葉多酚得率的重要因素之一。由圖1 可知，隨著提取劑用量的增大，多酚得率也相應(yīng)提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）之后多酚得率變化趨于平緩。由于提取劑用量較低時(shí)，菊芋葉中的多酚不能充分溶解；隨著提取劑用量的增大，溶劑對(duì)多酚的溶解逐漸趨于飽和，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時(shí)，多酚得率接近最大值，為35.07 mg/g。與實(shí)際生產(chǎn)相聯(lián)系，選擇最佳料液比為1∶20（g/mL），既有利于菊芋葉多酚的提取，又有利于降低生產(chǎn)成本。

圖1 料液比對(duì)菊芋葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.2 乙醇濃度對(duì)菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖2 可知，當(dāng)乙醇濃度在30%～50%時(shí)，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而升高；當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，菊芋葉多酚得率達(dá)到最高，為20.85 mg/g；之后隨著乙醇濃度的增加，菊芋葉多酚得率逐漸降低，這是由于高濃度乙醇溶液會(huì)使蛋白質(zhì)變性，影響多酚類物質(zhì)的溶出，菊芋葉多酚得率降低。因此確定菊芋葉多酚最佳提取乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對(duì)菊芋葉多酚的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖3 可知，當(dāng)超聲處理時(shí)間在10～50 min 時(shí)，菊芋葉多酚得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高；當(dāng)超聲時(shí)間為50 min 時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值，為50.65 mg/g；當(dāng)超聲時(shí)間大于50 min 時(shí)，菊芋葉多酚得率開(kāi)始降低。由于超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波會(huì)導(dǎo)致提取液溫度升高，使多酚穩(wěn)定性降低，得率減小。故選擇超聲時(shí)間50 min 作為最佳提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)菊芋葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.1.4 超聲功率對(duì)菊芋葉多酚提取效果的影響

由圖4 可知，隨著超聲功率的增大，菊芋葉多酚得率先增大后減小。當(dāng)超聲功率為500 W 時(shí)，菊芋葉多酚得率接近最大值，為34.31 mg/g；超聲功率大于600 W 之后，菊芋葉多酚得率降低。由于隨著超聲功率的增大，熱效應(yīng)也在增強(qiáng)，很容易造成多酚分子結(jié)構(gòu)的破壞，使得菊芋葉多酚得率降低。因此，確定超聲功率500 W 為最佳提取功率。

圖4 超聲功率對(duì)菊芋葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on polyphenol yield of jerusalem artichoke leaves

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取菊芋葉多酚

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，進(jìn)行料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、超聲時(shí)間（X3）、超聲功率（X4）與菊芋葉多酚得率之間的四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的建立與方差分析

使用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 中的響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，以料液比（X1）、乙醇濃度（X2）、超聲時(shí)間（X3）、超聲功率（X4）為自變量，菊芋葉多酚得率（Y）為響應(yīng)值，建立二次多元回歸方程：Y=31.37-0.37X1+0.75X2-0.75X3-0.25X4-3.28X1X2-4.55X1X3+0.27X1X4+0.22X2X3-0.009 75X2X4-0.79X3X4-3.28X12-3.89X22-2.98X32-3.72X42。

對(duì)響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可知，該數(shù)學(xué)模型回歸極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)P=0.577 3＞0.05，不顯著；試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值有著高度的相關(guān)性（R2=0.995 2，R2adj=0.990 3），說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)誤差較小，故可以用于菊芋葉多酚得率的理論推測(cè)。由F 檢驗(yàn)可以判斷得到各個(gè)變量對(duì)菊芋葉多酚得率的影響大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間（X3）＞乙醇濃度（X2）＞料液比（X1）＞超聲功率（X4）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

2.2.3 各因素交互作用分析

等高線可以直觀地反映各因素對(duì)菊芋葉多酚提取效果的交互作用程度，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從表3 和超聲輔助提取菊芋葉多酚的等高線和響應(yīng)面圖（圖5～7）可知，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X3X4、X12、X22、X32、X42對(duì)多酚得率的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），X4對(duì)多酚得率的影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。表明料液比與乙醇濃度、料液比與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與超聲功率之間的交互作用極顯著（P＜0.01）。

圖5 料液比與乙醇濃度的交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ethanol concentration on polyphenol yield

圖6 料液比與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between material-liquid ratio and ultrasonic time on polyphenol yield

圖7 超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on polyphenol yield

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件得到，超聲輔助提取菊芋葉多酚的最佳提取條件為：料液比1∶19.52（g/mL），乙醇濃度51.36%，超聲時(shí)間49.57 min，超聲功率496.70W，在此條件下多酚得率為31.46mg/g。為了操作方便，修正最佳提取條件為：料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度50%，超聲時(shí)間50 min，超聲功率500W，在此條件下，得到菊芋葉多酚得率為31.18mg/g，與模型預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差僅為0.89%，因此證明該模型合理，試驗(yàn)結(jié)果較準(zhǔn)確。

2.3 菊芋葉多酚抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 菊芋葉多酚的羥自由基清除能力

由圖8 可知，菊芋葉多酚具有一定的·OH 清除能力，其對(duì)·OH 的清除率隨著濃度的升高而增大，呈現(xiàn)量效關(guān)系，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)90.39%；相同濃度下菊芋葉多酚對(duì)·OH的清除率略低于VC，菊芋葉多酚和VC 的IC50值分別為0.268 mg/mL 和0.211 mg/mL。

圖8 菊芋葉多酚對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 The removal of hydroxyl free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.2 菊芋葉多酚的抗超氧陰離子自由基能力

由圖9 可知，菊芋葉多酚具有較強(qiáng)的抗O2·能力，當(dāng)菊芋葉多酚濃度從0.2 mg/mL 增大至1.2 mg/mL時(shí)，其抗O2·活力由10.62 U/L 提高到45.66 U/L，同一濃度菊芋葉多酚的抗O2·能力明顯高于VC。與VC 相比，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚的抗O2·能力提高了59.26%?？梢?jiàn)，菊芋葉多酚的抗O2·活力顯著高于VC（P＜0.05）。

圖9 菊芋葉多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.9 The removal of super-oxygen anions radicals (O2·) by jerusalem artichoke leaves polyphenols

2.3.3 菊芋葉多酚的DPPH 自由基清除能力

由圖10 可知，菊芋葉多酚對(duì)DPPH·有很強(qiáng)的清除作用，且其清除能力具有一定的量效關(guān)系，1.2 mg/mL菊芋葉多酚對(duì)DPPH·的清除能力達(dá)93.27%；在同一濃度下，菊芋葉多酚的DPPH·清除能力與VC 的DPPH·清除能力之間無(wú)顯著差異，二者的IC50值分別為0.014 mg/mL 和0.020 mg/mL。

圖10 菊芋葉多酚對(duì)DPPH·的清除作用Fig.10 The removal of DPPH free radicals by jerusalem artichoke leaves polyphenols

3 結(jié)論

本研究以菊芋葉為原料，采用超聲輔助法提取菊芋葉中的多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了菊芋葉多酚的提取工藝，并且測(cè)定其抗氧化能力。結(jié)果表明，各因素對(duì)菊芋葉多酚得率影響的大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間（X3）＞乙醇濃度（X2）＞料液比（X1）＞超聲功率（X4）；菊芋葉多酚的最佳提取工藝條件為：料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度50%，超聲時(shí)間50 min，超聲功率500 W，在此工藝條件下，菊芋葉多酚得率為31.18 mg/g；菊芋葉多酚有較強(qiáng)的抗氧化能力，1.2 mg/mL 菊芋葉多酚的·OH、DPPH·清除率以及抗O2·活力分別達(dá)90.39%、93.27%、45.66 U/L，尤其是其抗O2·能力，與同濃度的VC 相比提高了59.26%?？梢?jiàn)，超聲輔助提取菊芋葉多酚具有得率高、抗氧化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可為菊芋葉的綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。