駱金紅，陳 祥，尚以順，敖 葉，李鵬程

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽 550006)

胚胎附植是哺乳動(dòng)物妊娠建立的關(guān)鍵步驟。盡管已知有許多信號(hào)分子參與胚胎附植過程，但針對胚胎附植前、后子宮角組織的生理機(jī)制變化很大程度上還未知。山羊()胚胎附植屬表面附植，具體過程包括胚胎從透明帶孵出、定位、粘附、滲透4個(gè)具體過程，附植時(shí)胚胎不滲透到子宮基質(zhì)中。研究發(fā)現(xiàn)，母羊排卵受精后第15天，胚胎由管狀孕體延長發(fā)育為纖維狀孕體，第16～17天孕體在子宮角進(jìn)一步延長并以子宮肉阜為粘附位點(diǎn)開始附植，此后孕體滋養(yǎng)層巨雙核細(xì)胞與母體子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞融合，在母體子宮內(nèi)膜與孕體接觸區(qū)域形成三核的母-胎雜交細(xì)胞，雜交細(xì)胞進(jìn)一步與滋養(yǎng)層巨雙核細(xì)胞融合形成多合胞體斑塊，斑塊間相互緊密連接形成子葉，最終形成子葉胎盤。胚胎附植質(zhì)量對后續(xù)妊娠質(zhì)量具有直接影響，妊娠早期胚胎附植的任何問題都將極大地造成早期胚胎丟失或各種妊娠并發(fā)癥的產(chǎn)生，導(dǎo)致妊娠失敗，因此，胚胎的成功附植對繁殖率的提高具有重要意義。

子宮內(nèi)膜和胚胎的同步發(fā)育對于成功植入都至關(guān)重要,涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)事件，包括子宮內(nèi)膜容受性、免疫耐受性的建立等。子宮內(nèi)膜從不適應(yīng)、不接受胚胎附植到接受胚胎可附植狀態(tài)的改變叫做子宮內(nèi)膜容受性的改變，它是激素、生長和轉(zhuǎn)錄因子、脂質(zhì)介質(zhì)和細(xì)胞因子等之間同步和相互作用的結(jié)果。Zhang等為探究薩能奶山羊妊娠早期子宮內(nèi)膜容受性的形成機(jī)制，對妊娠第5和15天的子宮內(nèi)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得810個(gè)DEGs，對DEGs的生物信息學(xué)分析表明，妊娠早期子宮內(nèi)膜的分子變化涉及許多生物學(xué)過程和途徑，尤其是能量代謝和氨基酸代謝，并推測14、3和15可能參與子宮內(nèi)膜的發(fā)育。Song等對處于前接受態(tài)和接受態(tài)的薩能奶山羊母體子宮內(nèi)膜進(jìn)行了miRNA表達(dá)分析，在前接受態(tài)和接受態(tài)分別檢測到847和1 069個(gè)miRNAs，其中632個(gè)在2個(gè)階段都有不同程度表達(dá)，hsa-miR-449a等基因和泛素介導(dǎo)的蛋白水解、細(xì)胞凋亡等途徑可能在子宮內(nèi)膜接受性形成中起重要作用。Xia等對妊娠第17天體內(nèi)受精和體外生產(chǎn)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)DEGs主要通過子宮內(nèi)膜組織上細(xì)胞黏附/遷移和凋亡通路影響胚胎植入,調(diào)控胚胎附植。

本研究對妊娠第15和30天山羊子宮角組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以期篩選山羊胚胎附植前、后子宮角生理變化的相關(guān)重要調(diào)控基因及通路，為揭示山羊胚胎附植階段子宮角組織發(fā)育機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在貴州冊亨海銘巍畜牧業(yè)開發(fā)有限公司選取體重相近((44.76 kg±3.49)kg)、健康的經(jīng)產(chǎn)(2～4胎)努比亞母山羊16只，在同期發(fā)情、人工輸精配種后的第15和30天分別隨機(jī)選取3只羊，頸動(dòng)脈放血處死，每只羊切下子宮角圓筒狀區(qū)段后順向?yàn)?份，分別用錫箔紙包好、標(biāo)記后放入液氮中保存，立即送回實(shí)驗(yàn)室。第15天采樣時(shí)先看子宮角整體形態(tài)，子宮輕度膨大腫脹確定為受孕羊進(jìn)行采樣；本試驗(yàn)第15天采樣時(shí)第3只羊子宮整體較小，無膨大腫脹表現(xiàn)，判定為未孕羊舍棄，屠宰第4只受孕羊采集補(bǔ)齊3個(gè)重復(fù)。

1.2 RNA文庫制備與子宮角組織Illumina測序

從妊娠第15、30天兩個(gè)時(shí)期樣品中隨機(jī)各選取3份子宮角組織進(jìn)行RNA-Seq測序。按照制造商說明書，使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從子宮角組織中提取RNA，使用NanoPhotometer分光光度計(jì)(IMPLEN, CA, USA)檢測樣品純度，Qubit3.0 Flurometer(Life Technologies, CA, USA)檢測RNA樣品濃度，安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies, CA, USA)檢測RNA樣品的完整性和濃度。RNA樣品的A260/A280在1.9～2.1之間，RNA完整性(RIN)數(shù)值范圍為8.6～10.0，對檢測合格的mRNA選用帶有Oligo(dT)的磁珠進(jìn)行富集純化。

整個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫的制備和測序在Annoroad Gene Technology Corporation(中國，北京)進(jìn)行。使用New England Biolabs Next、Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)，按照制造商的說明書構(gòu)建整個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫。使用BioAnalyzer 2100 system和定量PCR(qPCR)(Kapa Biosystems，Woburn，MA，USA)對文庫進(jìn)行質(zhì)量控制和定量。質(zhì)量合格的文庫用Illumina HiSeq2500(Illumina，San Diego，CA，USA)進(jìn)行單個(gè)樣品測序，并產(chǎn)生150 bp的配對末端讀數(shù)。

1.3 差異表達(dá)基因及GO分析

通過去除接頭污染的reads、低質(zhì)量的reads、含N比例大于5%的reads，clean Q30 bases rate(%)判斷堿基質(zhì)量，得到高質(zhì)量的clean reads，再進(jìn)行后續(xù)分析。使用Bowtie2(版本2.2.5)和具有默認(rèn)參數(shù)的Tophat2(版本2.1.0)軟件將所有樣品的clean reads映射到Capra_hircus_ARS1參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10731?genome_assembly_id=281266, USDA ARS)，以確定表達(dá)水平已鑒定的基因。使用Cufflinks軟件(版本2.2.1)將來自每個(gè)樣品的映射讀數(shù)組裝成轉(zhuǎn)錄物以構(gòu)建、鑒定、估計(jì)TopHat比對結(jié)果的豐度，并使用FPKM(每百萬fragments中比對到某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目)量化組裝的轉(zhuǎn)錄物的豐度。設(shè)定|logFold change|≥1和q<0.05的基因作為顯著差異基因。

選取HISAT軟件對過濾后的測序序列進(jìn)行比對，并進(jìn)行基因組定位分析，結(jié)合基因本體(Gene Ontology，GO)數(shù)據(jù)庫對篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋及富集分析。

1.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq分析的可靠性，以-基因?yàn)閮?nèi)參基因，隨機(jī)選取了21、3、、、19A1、等6個(gè)基因(3個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào))進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。依據(jù)GenBank 中收錄的山羊21、3、、、19A1、基因序列及其mRNA序列，利用NCBI Primer-BLAST在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)特異性熒光引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物信息

提取D15和D30子宮角組織總RNA，隨機(jī)選取6個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR，每個(gè)基因3個(gè)生物學(xué)復(fù)孔。使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒(ThermoFisher，美國)將來自6個(gè)樣品的一部分(0.5 μg)DNase I處理的總RNA轉(zhuǎn)化為單鏈cDNA。將cDNA模板用CFX 96 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，Singapore)和SYBR Premix ExTaq TM(TaKaRa)擴(kuò)增。qPCR試驗(yàn)采用20 μL的反應(yīng)體系：10 μL的2×T5 Fast qPCR Mix(1×)，正向和反向引物各0.8 μL(0.4 μmol·L)，0.4 μL 的50×ROX Reference Dye I(1×)，1 μL的cDNA，7 μL的雙蒸水。使用以下程序擴(kuò)增模板：95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)30 s，最后72 ℃持續(xù)20 s。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)2方法計(jì)算qRT-PCR所檢測的DEGs在不同組織中的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為：△△Ct=(Ct-Ct)-(Ct-Ct)，最后qRT-PCR和RNA-Seq數(shù)據(jù)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 高表達(dá)基因篩選

將Illummina對D15和D30組織測序得到的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對，設(shè)定FPKM≥0.5，表2列出了表達(dá)量最高的10個(gè)基因，其中在D15時(shí)FPKM最高的3個(gè)基因分別為、4X、，在D30時(shí)FPKM最高的3個(gè)基因分別為4X、、1A1。

表2 轉(zhuǎn)錄組D15、D30中表達(dá)量最高的10個(gè)基因

2.2 差異表達(dá)基因篩選及GO分析

數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果設(shè)定參數(shù)：FPKM≥0.5，|logFold change|≥1和q<0.05，共篩選出2 000個(gè)差異表達(dá)基因(表3)，其中上調(diào)基因620個(gè)，下調(diào)基因1 380個(gè)，表4列出了上調(diào)和下調(diào)的前10個(gè)高差異基因及其功能。應(yīng)用DAVID v6.8對獲得的2 000個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能聚類分析，共分為3大類52組(圖1)，其中細(xì)胞組分17組(32.69%，17/52)，生物過程23組(44.23%，23/52)，分子功能12組(23.08%，12/52)，獲得細(xì)胞連接與增殖，生物粘附與調(diào)節(jié)，分子活性與轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生物途徑。

表3 D15、D30組間比較差異表達(dá)基因數(shù)目

表4 轉(zhuǎn)錄組D15和D30(D15 vs.D30)中的前10個(gè)上、下調(diào)基因及其功能

餅狀圖數(shù)字表示基因富集數(shù)

2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

6個(gè)基因在D15和D30子宮角中表達(dá)變化趨勢與RNA-Seq結(jié)果一致(圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

3 討 論

胚胎附植是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，努比亞山羊胚胎附植前后子宮角組織的變化及作用機(jī)理仍不明確。RNA-Seq是能對某一組織或器官在一定狀態(tài)下獲取所有轉(zhuǎn)錄本的技術(shù)，具有檢測范圍廣、通量高、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本試驗(yàn)選用Illumina 技術(shù)對胚胎與子宮建立聯(lián)系前(D15)、后(D30)的子宮角組織進(jìn)行測序，共篩選出7個(gè)與胚胎附植相關(guān)的基因。隨機(jī)選取6個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，各DEGs表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，說明RNA-Seq結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(matrix Gla protein)是一種維生素K依賴性細(xì)胞外基質(zhì)分泌性蛋白，分子結(jié)構(gòu)中有5個(gè)γ谷氨?；鶜埢肿恿繛?2 ku，在胚胎組織和癌細(xì)胞中富集，主要通過纖連蛋白中特定結(jié)合的位點(diǎn)增強(qiáng)纖連蛋白上的細(xì)胞附著，增加細(xì)胞-纖連蛋白的相互作用。Correia等研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)可能與細(xì)胞遷移、分化有關(guān)，可能以某種方式參與了發(fā)育中雞胚動(dòng)脈和靜脈樹的重塑，可作為哺乳動(dòng)物早期妊娠診斷的關(guān)鍵參考蛋白。本試驗(yàn)中，在D15子宮角組織中高表達(dá)，此時(shí)孕體與子宮肉阜開始粘附，MGP與纖連蛋白結(jié)合并增強(qiáng)纖連蛋白上細(xì)胞附著和擴(kuò)散，細(xì)胞-纖連蛋白相互作用強(qiáng)烈，子宮角組織血管重塑活躍。

是Transgelins家族中的3個(gè)亞型之一，分子量為22 ku，屬于與肌動(dòng)蛋白相關(guān)的調(diào)寧蛋白家族，分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是氨基序列的C末端調(diào)寧樣重復(fù)序列和N末端存在單一CH同源性結(jié)構(gòu)域。Transgelins家族作為肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，通過與肌動(dòng)蛋白相互作用重構(gòu)細(xì)胞骨架，定位信號(hào)分子，在多種生物學(xué)功能的調(diào)控中發(fā)揮作用。Burmenskaya等對輸卵管不孕和試管嬰兒成功的子宮內(nèi)膜研究發(fā)現(xiàn)，可作為子宮內(nèi)膜兩種功能狀態(tài)的信息標(biāo)記基因之一。2是Transgelins家族成員之一，2的抑制顯著損害胚胎粘附和植入能力，明顯降低人類滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移能力，李瑞婷也研究發(fā)現(xiàn)，2與山羊胚胎著床有關(guān)，在胚胎粘附階段高表達(dá)，與本試驗(yàn)D30較D15表達(dá)量升降趨勢結(jié)果一致；同時(shí)，D30較D15表達(dá)量降低可能標(biāo)志胚胎附植后與肌動(dòng)蛋白作用減弱，但仍保持一定水平維持妊娠。

妊娠相關(guān)糖蛋白(PAGs)屬于天冬氨酸蛋白酶基因家族，結(jié)構(gòu)上氨基酸序列與組織蛋白酶D、組織蛋白酶E和胃蛋白酶的氨基酸序列有一半以上一致，都具有典型包含酶催化中心的兩個(gè)雙葉型三級(jí)結(jié)構(gòu)。PAGs是由反芻動(dòng)物胎兒胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞合成分泌的一類蛋白質(zhì)，在妊娠過程中具有粘附和保護(hù)胎兒的重要作用，是孕體存活的一個(gè)標(biāo)志，在反芻動(dòng)物妊娠早期血清、尿液和奶中均可檢測到，可用于反芻動(dòng)物的早期妊娠檢測；在奶牛上已建立的bPAG可視化檢測方法，對配種后第30天的奶牛通過血清進(jìn)行妊娠診斷，準(zhǔn)確率達(dá)到91.7%；在綿羊上，趙夢圓認(rèn)為PAG濃度高于42 ng·mL可作為綿羊早期妊娠診斷的閾值標(biāo)準(zhǔn)，Steckeler等發(fā)現(xiàn)，在第42天時(shí)對妊娠母羊的判斷準(zhǔn)確率最高。本試驗(yàn)差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)幅度最大的前10個(gè)基因中有3個(gè)妊娠相關(guān)糖蛋白基因(-3、-8、-12)在子宮角組織中D30相對于D15顯著上調(diào)，提示從胚胎附植到發(fā)育D30期間，PAGs可能持續(xù)增強(qiáng)胚胎粘附牢固度來使妊娠持續(xù)、良好的進(jìn)行，未發(fā)生流產(chǎn)等情況。研究發(fā)現(xiàn)，PAGs表達(dá)、翻譯在胚胎附植前就已經(jīng)開始，與本試驗(yàn)結(jié)果PAGs在D15已經(jīng)開始表達(dá)一致，同時(shí)，也提示PAGs可能在胚胎附植前的準(zhǔn)備中發(fā)揮作用。

生長激素釋放激素受體(GHRHR)屬于G蛋白受體家族，具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，通過與GHRH偶聯(lián)激活腺苷酸環(huán)化酶，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP和Ca，促使生長激素分泌、細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長發(fā)育。在對胚胎時(shí)期雞垂體的研究發(fā)現(xiàn)，mRNA的水平在第8天達(dá)到峰值，在第12天大量表達(dá)，從第16天到第30天高水平表達(dá)。本試驗(yàn)中，在D15水平高于D30，推測在努比亞山羊胚胎發(fā)育過程中，子宮角組織表達(dá)在D30以前就已經(jīng)過了高峰期，但具體的高峰期出現(xiàn)和結(jié)束時(shí)間還需進(jìn)一步細(xì)化確定。

1是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族(IGFBPs)中6個(gè)同源蛋白之一，結(jié)構(gòu)上可分為3個(gè)區(qū)段，N端、C端和L區(qū)，其中N端能與IGF相互作用。在對1與孕早期大鼠子宮內(nèi)膜和孕激素的研究中發(fā)現(xiàn)，1可能在大鼠孕早期子宮內(nèi)膜的蛻膜化、胎盤形成和胚胎生長發(fā)育中發(fā)揮作用，在對狒狒的研究中也發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜腺上皮中1的存在可能調(diào)節(jié)著床過程中滋養(yǎng)層生長和滲透的自分泌和/或旁分泌，而本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，1在努比亞山羊妊娠早期子宮角組織中表達(dá)，因此，推測1在母體對胚胎附植的準(zhǔn)備中發(fā)揮作用，促進(jìn)孕早期子宮內(nèi)膜蛻膜化，引導(dǎo)胎盤形成和胚胎生長。

綜上所述，通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)共獲得妊娠早期努比亞山羊子宮角中與胚胎附植相關(guān)的基因，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)山羊胚胎附植中關(guān)鍵蛋白的作用機(jī)理提供了依據(jù)，也為深入探討山羊胚胎附植發(fā)生機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究篩選獲得的基因、、-3、-8、-12、、1可能在山羊胚胎附植中具有重要作用。