李 靜，程魯光，萬(wàn)九生，陳 超，鄧衛(wèi)東，張正紅，張 志，黎立光

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，昆明 650201；2.公安部昆明警犬基地，昆明 650201；3.公安部警犬技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

昆明犬是我國(guó)自主培育的唯一的國(guó)產(chǎn)工作犬品種，由公安部昆明警犬基地培育，被國(guó)家畜禽品種認(rèn)證為中國(guó)犬類的國(guó)家級(jí)畜禽新品種。昆明犬在治安防范、追蹤、搜毒搜爆等多個(gè)警用領(lǐng)域發(fā)揮著巨大作用，是中國(guó)最優(yōu)秀的工作犬品種之一。昆明犬源自于20世紀(jì)50年代的云南本地狼犬(主體為本地犬和當(dāng)時(shí)軍警用德國(guó)牧羊犬的雜交后代)。經(jīng)過(guò)近70余年的群體繼代選育及基礎(chǔ)群建設(shè)，目前已經(jīng)形成種群數(shù)量穩(wěn)定及遺傳多樣性豐富的狼青、黑背、草黃3個(gè)品系的昆明犬群，現(xiàn)具有25個(gè)核心家系，遍布全國(guó)及東南亞、朝鮮、韓國(guó)、巴基斯坦等國(guó)家。我國(guó)廣泛使用的工作犬品種還有源于歐洲的引進(jìn)品種馬里努阿犬和德國(guó)牧羊犬。馬里努阿犬(簡(jiǎn)稱馬犬)是將進(jìn)口馬利諾斯犬(MALINOIS)的遺傳特性進(jìn)行改良，選育出符合中國(guó)氣候環(huán)境、警用性能優(yōu)越的中系馬里努阿犬，其目前具有18個(gè)核心家系。德國(guó)牧羊犬也是廣泛使用的傳統(tǒng)軍警用犬，因其遺傳和警用性能穩(wěn)定而享譽(yù)世界。根據(jù)警用工作犬體型外貌、警用性能評(píng)定辦法劃分為普通家系和特異性家系。其中警用性能主要有膽量、興奮性、占有性、跟隨性等行為性狀。由于近年來(lái)逐漸重視對(duì)國(guó)產(chǎn)工作犬品種的保種與遺傳資源開發(fā)，因此利用基因組信息挖掘中國(guó)昆明犬與德國(guó)牧羊犬、馬犬等引進(jìn)品種的遺傳關(guān)系及背景至關(guān)重要。

另外，由于家犬是人類親密的伙伴之一，利用它們的認(rèn)知和行為能力的差別，家犬被選擇去完成各種各樣的任務(wù)，如軍警用、導(dǎo)盲、狩獵、放牧和陪伴犬，家犬的進(jìn)化也經(jīng)歷了育種遺傳多樣性瓶頸效應(yīng)，但目前大部分研究集中在控制體型、身高和被毛變化的基因上，在警用工作犬品種人工選擇中行為性狀變化的遺傳機(jī)制研究較少?；蛐酒捎谄鋬r(jià)格實(shí)惠、高效便捷的特性而在動(dòng)物遺傳育種中廣泛使用，Illumina CanineHD Beadchip芯片技術(shù)特有高度多態(tài)性SNPs，為品系內(nèi)關(guān)聯(lián)和拷貝數(shù)變異(CNV)研究提供了充足的SNP密度，具有均勻的基因組覆蓋，可實(shí)現(xiàn)任何家犬品種遺傳變異的檢測(cè)。

本研究利用Illumina CanineHD Beadchip芯片對(duì)昆明犬、馬里努阿犬、德國(guó)牧羊犬共計(jì)24頭3個(gè)品種進(jìn)行分析獲得數(shù)據(jù)，并利用主成分(PCA)、STRUCTURE和鄰接(NJ)樹分析方法檢測(cè)昆明犬的遺傳群體結(jié)構(gòu)，同時(shí)在基因組水平上充分挖掘昆明犬品種形成過(guò)程中可能受到選擇的候選基因，為國(guó)內(nèi)目前警犬品種的遺傳資源保護(hù)和開發(fā)利用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)共選取24頭犬采集全血樣本，對(duì)犬進(jìn)行前肢靜脈采血方法收集。選取樣本為3個(gè)品種犬：其中采集昆明犬16頭，采集馬里努阿犬4頭，采集德國(guó)牧羊犬4頭，樣本的遺傳資源基本信息如表1所示。血液樣本用EDTA抗凝，-80 ℃保存，用于基因組DNA提取。

表1 本試驗(yàn)采集犬的基本遺傳信息

1.2 主要試劑和儀器

血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；EDTA、瓊脂糖、DNA makerDL2000等均購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司。

電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司；離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司；-80 ℃冰箱購(gòu)自海爾公司；核酸質(zhì)量檢測(cè)儀購(gòu)自Thermo公司

1.3 基因組DNA提取、純化與分型

利用血液基因組DNA提取試劑盒從血樣中提取基因組DNA純化后，采用Illumina CanineHD Beadchip芯片進(jìn)行基因分型分析獲得數(shù)據(jù)，用 PLINK軟件對(duì)芯片進(jìn)行軟件處理質(zhì)控。

1.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用PLINK和Frappe軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，對(duì)24個(gè)犬個(gè)體進(jìn)行K=2～5的分析(每個(gè)K 3個(gè)重復(fù))，用PLINK計(jì)算3個(gè)品種犬群體的雜合度和近交系數(shù)，馬爾科夫蒙特卡洛(MCMC)計(jì)算的參數(shù)都將燃盡值設(shè)為20 000次，重復(fù)值設(shè)為30 000次。

1.5 聚類分析

聚類分析之前，用PLINK軟件的indep-pairwise選項(xiàng)進(jìn)行SNP修剪(參數(shù)設(shè)為：25個(gè)SNPs為一個(gè)窗口，5個(gè)SNPs為一個(gè)步長(zhǎng)，R2的閾值定為0.05)。PCA分析使用R語(yǔ)言包(http://www.r-project.org/)來(lái)進(jìn)行主成分分析。

1.6 NJ進(jìn)化樹分析

利用GENEPOP軟件計(jì)算群體之間的兩兩距離，進(jìn)行聚類分析，從而推斷出種群間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。用Treebest軟件、鄰接法(neighbor-joining methods)構(gòu)建個(gè)體NJ進(jìn)化樹。

1.7 滑動(dòng)窗口位點(diǎn)篩選和基因注釋

通過(guò)在常染色體上設(shè)置500 kb的滑動(dòng)窗口，選擇每個(gè)窗口中具有最高最小等位基因頻率(MAF)的SNPs位點(diǎn)，搜尋SNPs所在的基因區(qū)域。如果某個(gè)基因落在這個(gè)選擇區(qū)段內(nèi)，將這個(gè)基因定義為該行為性狀差異的“候選基因”。若候選基因名稱在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有歧義，則按照Ensembl Genome Browser 中所注釋名稱?；蜃⑨屚ㄟ^(guò)R包完成，利用DAVID6.8(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)在線軟件對(duì)選擇出來(lái)的候選基因進(jìn)行基因功能富集分析，分析的內(nèi)容主要為基因功能聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 SNP統(tǒng)計(jì)分析及質(zhì)控結(jié)果

基于芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，最終有86 270個(gè)SNPs被篩選出來(lái)用于分析。SNP功能注釋詳見表2，其中同義突變有782個(gè)，非同義突變有368個(gè)，非同義突變引起翻譯提前終止5個(gè)，共有1 154個(gè)SNPs突變位于外顯子區(qū)。

表2 犬芯片SNP信息統(tǒng)計(jì)

2.2 群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析

基于貝葉斯模型的聚類算法來(lái)檢測(cè)3個(gè)警犬品種基因組群體的分離程度(圖1)，當(dāng)假設(shè)有兩個(gè)祖先群體(K=2)時(shí)，德國(guó)牧羊犬(DM)和其他品種犬完全區(qū)分開來(lái)；當(dāng)K=3時(shí)馬里努阿犬(ML)、昆明犬、德國(guó)牧羊犬可以區(qū)分開來(lái)，但昆明犬黑背品系(KH)中混有25.1%德國(guó)牧羊犬雜合。當(dāng)K=4時(shí)，昆明犬品種中狼青品系(KL)、草黃品系(KC)從昆明犬中分離出來(lái)。昆明犬品種中黑背品系(KH)與其他群體間的親緣關(guān)系很近，其中含有10.2%德國(guó)牧羊犬雜合，含有37.1%狼青品系雜合，含有35.2%的草黃品系雜合。當(dāng)K=5時(shí)昆明犬品種中狼青品系的A1家系(KL01-04)和A2家系(KL05-08)可以分離出來(lái)，昆明犬黑背品系(KH)較難區(qū)分出來(lái)。

每種顏色代表一個(gè)群體，每個(gè)豎線塊代表一個(gè)樣本。橫坐標(biāo)為樣本編號(hào)，縱坐標(biāo)代表在祖先群體中所占的比例

德國(guó)牧羊犬(DM)、昆明犬品種中黑背品系(KH)、草黃品系(KC)和狼青品系(KL)、馬里努阿犬(ML)幾個(gè)群體共24個(gè)個(gè)體進(jìn)行雜合度和近交系數(shù)分析(表3)。群體平均、均小于0.5，說(shuō)明幾個(gè)群體均受到一定程度的選擇。其中德國(guó)牧羊犬(DM)的最小0.247 2，其近交系數(shù)(F)值最高0.036 47。其次是馬犬(ML)的為0.264 4，其近交系數(shù)()值為0.034 16，與德國(guó)牧羊犬差異不大，但高于昆明犬3個(gè)品系群體的值。昆明犬中黑背品系(KH)的平均值最高為0.382 1，近交系數(shù)()值為0.021 88，草黃品系(KC)和狼青品系(KL)的值略低于黑背品系(KH)。

表3 3個(gè)品種犬群體的雜合度和近交系數(shù)

2.3 群體PCA分析

通過(guò)主成分分析(principal components analysis，PCA)的方法估計(jì)了3個(gè)品種犬的群體結(jié)構(gòu)(圖2)。與STRUCTURE 結(jié)果相符，第一、二主成分能將德國(guó)牧羊犬(DM)、馬里努阿犬(ML)、昆明犬清楚地分開(圖2A)，PC1可以解釋原所有變量(所有SNP)總體方差的16.93%，PC2、PC3分別占總變異的12.40%和9.25%。另外，與STRUCTURE分析K=4的結(jié)果相比，PCA 的第一、第三成分已能很好地將昆明犬品種中狼青品系(KL)、草黃品系(KC)、黑背品系(KH)從昆明犬中明顯分離出來(lái)，兩個(gè)主成分(PC1和PC3)黑背品系與狼青品系存在一定程度的混合(圖2B)。

坐標(biāo)軸標(biāo)簽括號(hào)中的數(shù)值代表主成分解釋總體方差的百分比

2.4 NJ-TREE分析

NJ樹結(jié)果如圖3顯示，主要由3大分支組成，分別為德國(guó)牧羊犬(DM)、昆明犬和馬里努阿犬(ML)。昆明犬3個(gè)品系主要在一個(gè)主要分支中，其中昆明犬草黃品系(KC01-04)聚為一支，昆明犬品種中黑背品系(KH01、03、04)聚為一支，昆明犬品種中狼青品系的A1家系(KL01-04)和A2家系(KL05-08)各聚為一支。

圖3 3個(gè)警犬品種群體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.5 受選擇基因的檢測(cè)

為了避免每條染色體的開始/結(jié)束端缺少側(cè)翼標(biāo)記信息，每條染色體開始和結(jié)束端的 SNP 標(biāo)記必須選擇。最后，選擇了昆明犬554個(gè)具有高M(jìn)AF的信息SNPs位點(diǎn)。將這些區(qū)域注釋后，得到22個(gè)在昆明犬品種形成過(guò)程中可能受到選擇的候選基因。用DAVID Bioinformatics Resource.(6.8)對(duì)可能受到選擇的22個(gè)候選基因進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)(表4)，在昆明犬與其他品種分離后，其基因組中有兩個(gè)類別的基因受到了正選擇。第一類是與腺苷酸環(huán)化酶活化g蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路相關(guān)的基因及蛋白，包括腺苷酸環(huán)化酶2(ADCY2)、腺苷酸環(huán)化酶3(ADCY3)、腺苷酸環(huán)化酶8(ADCY8)。另一類是在神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)錐中具有聚合和穩(wěn)定微管的功能，影響軸突和前導(dǎo)突起生長(zhǎng)的相關(guān)基因。其中在腦發(fā)育過(guò)程中，候選基因13調(diào)控神經(jīng)元的遷移、大腦皮層和海馬組織結(jié)構(gòu)的形成，從而影響學(xué)習(xí)與記憶等腦功能。

表4 昆明犬中受正選擇作用基因的功能聚類分析

3 討 論

3.1 3個(gè)警用工作犬品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)

本研究對(duì)3個(gè)中國(guó)主要警犬品種的共計(jì)24個(gè)個(gè)體(其中包含昆明犬狼青、黑背、草黃3種品系)用Illumina CanineHD Beadchip芯片進(jìn)行基因分型，同時(shí)運(yùn)用群體PCA主成分分析、STRUCTURE分析和NJ樹進(jìn)行了群體遺傳分析。其中，昆明犬狼青品系(KL)、黑背品系(KH)、草黃品系(KC)3個(gè)品系有相似的體型和行為，不同的只是毛色。雄性成年個(gè)體體高在65～70 cm之間，而雌性成年個(gè)體體高在60～65 cm之間。狼青品系(KL)全都是黑色、黃色和灰色被毛，而黑背品系(KH)是黑色的背部和黃色的腹部和四肢，草黃品系(KC)主要是黃色被毛，少量黑色被毛。馬里努阿犬(ML)被毛短，全身褐色，頭面部黑色，體型外形勻稱呈方形。德國(guó)牧羊犬(DM)被毛稍長(zhǎng)，基本是黑背黃腹，雄性成年個(gè)體體高在60～65 cm之間，性情溫良，服從命令，警惕性高，被廣泛用于軍警方面(圖4)。

A.昆明犬狼青品系(KL)；B.昆明犬黑背品系(KH)；C.昆明犬草黃品系(KC)；D.馬里努阿犬(ML)；E.德國(guó)牧羊犬(DM)

已有研究表明，家犬是一個(gè)由于人類馴化活動(dòng)和遷徙運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的特殊物種，家犬起源學(xué)說(shuō)也證明現(xiàn)代犬種歷經(jīng)了兩個(gè)馴化階段，既第一次由灰狼到家犬的馴化，以及第二次強(qiáng)力選擇下的品系形成過(guò)程才形成了千差萬(wàn)別的400多個(gè)豐富的家犬品種。本研究結(jié)果表明，當(dāng)假設(shè)有兩個(gè)祖先群體(K=2)時(shí)，德國(guó)牧羊犬(DM)和其他品種犬完全區(qū)分開來(lái)；當(dāng)假設(shè)有3個(gè)群體(K=3)時(shí)，昆明犬(包含狼青品系、草黃品系、黑背品系)與馬里努阿犬(ML)、德國(guó)牧羊犬(DM)可以分離開來(lái)。這也是由于歐洲隨著工業(yè)革命的興起，生產(chǎn)力逐漸剩余，人工選擇開始傾向于由犬幫助人類進(jìn)行警戒、守衛(wèi)活動(dòng)和以聰慧易于服從的大腦偏好為選種選育目標(biāo)進(jìn)而形成多品種的工作犬。根據(jù)本研究結(jié)果，昆明犬存在部分與德國(guó)牧羊犬的雜合成分，表明昆明犬與德國(guó)牧羊犬群體間存在親緣關(guān)系，這與前人對(duì)中國(guó)地方狼犬與德國(guó)牧羊犬毛色的遺傳規(guī)律研究結(jié)果吻合。尤其是昆明犬的黑背品系，是通過(guò)早期與德國(guó)牧羊犬黑背品系雜交選育得來(lái)的。由于昆明犬品種選育中引入了擁有優(yōu)良性狀的品種進(jìn)行雜交，因此昆明犬黑背品系的雜合度高，近郊系數(shù)低，遺傳多樣性豐富。另外兩個(gè)品系與馬犬、德牧的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，可以明顯分離出來(lái)。而馬犬、德牧在長(zhǎng)時(shí)間定向選育中，有效群體數(shù)量逐漸減少，群體遺傳變異水平降低，雜合度降低，近交系數(shù)升高，遺傳多樣性降低。3個(gè)品種警犬平均和均小于0.5，說(shuō)明3個(gè)群體均受到的強(qiáng)烈選擇。草黃品系(KC)和狼青品系(KL)的值略低于黑背品系(KH)，群體遺傳分析能夠區(qū)分群體的生理差異和地理起源，對(duì)應(yīng)本研究中，昆明犬3個(gè)品系聚在一個(gè)分支中，但昆明犬草黃品系(KC)、黑背品系(KH)、狼青品系(KL)均存在一定程度的分化，本結(jié)果對(duì)3個(gè)中國(guó)主要警犬品種的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了說(shuō)明。但本試驗(yàn)樣本數(shù)量偏少，德國(guó)牧羊犬和馬犬兩個(gè)犬種分別選擇4個(gè)有代表性的核心群樣本，對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)說(shuō)明支撐力不足。

3.2 昆明犬品種中受選擇的基因

本試驗(yàn)篩選昆明犬基因組上的選擇信號(hào)，利用基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)了可能受到選擇的重要候選基因。通過(guò)與基因組數(shù)據(jù)信息進(jìn)行比對(duì)和基因注釋共找到了22個(gè)選擇信號(hào)候選基因。通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)，第一類是與參與腺苷酸環(huán)化酶活化g蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的基因及蛋白，包括腺苷酸環(huán)化酶2(2)、腺苷酸環(huán)化酶3(3)、腺苷酸環(huán)化酶8(8)基因。與犬ADCYs同源的基因在人的大腦組織中特異性高表達(dá)。已有研究表明，跨膜腺苷酸環(huán)化酶()參與腦中突觸可塑性、多發(fā)性的形成，如學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)節(jié)。它們合成由G蛋白偶聯(lián)受體活化的細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)。Sanabra和Mengod通過(guò)原位雜交檢查大鼠和小鼠大腦9個(gè)ADCYs亞型的神經(jīng)解剖分布證明了ADCYs在大鼠和小鼠腦的皮質(zhì)、海馬、丘腦核、嗅覺(jué)系統(tǒng)和小腦顆粒層中廣泛分布。

本研究還明確揭示了在昆明犬受選擇基因中的鈣/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶2α(CAMK2A/II)、蛋白激酶(APRKX)和激腺苷酸環(huán)化酶(ADCY3)，這3個(gè)基因均存在于嗅覺(jué)傳導(dǎo)(olfactory transduction)通路中。研究表明，CaMKII能增強(qiáng)控鈉通道的電活性和神經(jīng)元興奮性，ADCY3在大鼠增強(qiáng)突觸可塑性中發(fā)揮重要作用，與恐懼相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶和長(zhǎng)期記憶鞏固有關(guān)，在控制學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制中起著重要作用，對(duì)昆明犬利用嗅覺(jué)進(jìn)行鑒別的科學(xué)意義重大。已有研究表明，CaMKⅡ alpha亞型(CaMKⅡα)是在小鼠腦中特異并且大量表達(dá)，在缺乏3′UTR的小鼠中，mRNA的樹突狀定位表達(dá)被破壞，嗅覺(jué)關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)受到嚴(yán)重?fù)p害。因此揭示了CaMKIIα局部翻譯是作為嗅覺(jué)可塑性的決定因素。Daroles等通過(guò)比較中國(guó)土狗和比格獵犬在慢性應(yīng)激刺激和不應(yīng)激刺激兩種條件下腎上腺皮質(zhì)和垂體的轉(zhuǎn)錄組分析，證明了2、1等基因是通過(guò)控制下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，進(jìn)而影響中國(guó)土狗和比格獵犬經(jīng)受壓力刺激時(shí)表現(xiàn)出不同應(yīng)激反應(yīng)耐受的差異。

另一類候選基因是在神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)錐中具有聚合和穩(wěn)定微管的功能，影響軸突和前導(dǎo)突起的生長(zhǎng)；在腦發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)GF13調(diào)控神經(jīng)元的遷移、大腦皮層和海馬組織結(jié)構(gòu)的形成，從而影響學(xué)習(xí)與記憶等腦功能。在小鼠上的試驗(yàn)證實(shí)，13基因敲除小鼠由于神經(jīng)元遷移遲滯造成大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)分層異常，學(xué)習(xí)記憶能力受到明顯損害。結(jié)合本研究的結(jié)果，上述基因在犬上均未有明確的功能驗(yàn)證，以往的工作犬行為學(xué)研究普遍認(rèn)為犬膽量本質(zhì)上是適應(yīng)和克服恐懼的能力，本研究結(jié)果表明，犬在受選擇過(guò)程中與大腦功能偏好的基因在大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能起到了重要作用。后續(xù)會(huì)繼續(xù)開展警犬受選擇基因的表達(dá)驗(yàn)證和功能研究，探究影響膽量、嗅覺(jué)學(xué)習(xí)等犬的警用行為性狀的大腦遺傳機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究分析了昆明犬的的群體遺傳結(jié)構(gòu)，探討了3種警用工作犬品種的遺傳關(guān)系。同時(shí)得到了22個(gè)在昆明犬品種形成過(guò)程中可能受到選擇的候選基因。本試驗(yàn)挖掘的相關(guān)基因證明了昆明犬受到了強(qiáng)烈的人工選擇進(jìn)而產(chǎn)生了對(duì)影響應(yīng)激反應(yīng)、嗅覺(jué)學(xué)習(xí)記憶性能的調(diào)控。針對(duì)受選擇基因，在后續(xù)應(yīng)通過(guò)功能性驗(yàn)證來(lái)證明上述基因在昆明犬學(xué)習(xí)、記憶方面發(fā)揮的重要作用。本研究為國(guó)內(nèi)警用工作犬的種質(zhì)資源開發(fā)利用提供了重要理論依據(jù)。