張?zhí)礻?，張旭妍，王丹萍，許曉曦,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.教育部乳品重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

茯苓（Poria cocos）是一種我國傳統(tǒng)的中藥材，也是重要的藥食同源功能性食材，具有益脾和胃、寧心安神的功效。它來自于多孔菌科茯苓屬真菌茯苓的干燥菌核，多糖為茯苓的主要化學成分之一[1]，具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等功效[2]。KHAN 等[3]對小鼠的腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，飼喂茯苓的小鼠腸道內(nèi)可產(chǎn)生乳酸、短鏈脂肪酸的菌群以及具有分解多糖、改善肥胖能力的菌群。GAO 等[4]證明了茯苓多糖作為一種益生元可以促進雙歧桿菌的增殖并產(chǎn)生了大量以乙酸為主的短鏈脂肪酸。JIANG 等[5]的研究表明，茯苓提取物可以在動物體內(nèi)促進雙歧桿菌生長，并抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等有害菌的生長。此外，還有一些實驗結果顯示[6]，高劑量的茯苓能顯著提高小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌的水平，并具有良好的腸道菌群調(diào)節(jié)效果，且其藥效和劑量有關，提示茯苓有可能作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑或添加劑，用于腸道菌群調(diào)節(jié)和相關預防治療。

動物雙歧桿菌乳雙歧亞種（Bifidobacterium animalisspp.lactisBB-12，下文簡稱雙歧桿菌BB-12）是迄今為止世界上臨床研究最為充分的雙歧桿菌菌株[7]。研究證明，雙歧桿菌BB-12 能夠改善腸道功能[8?9]、防止腹瀉[10]、并能減少抗生素治療帶來的副作用[11]。在免疫功能方面，臨床研究表明雙歧桿菌BB-12 會提高機體對常見呼吸道感染的抵抗力，同時降低急性呼吸道感染的發(fā)病率。雙歧桿菌BB-12 還可通過其代謝物來防止腸道上皮屏障功能受到破壞[12]。此外，雙歧桿菌BB-12 還有著優(yōu)良的抑菌性。研究表明，雙歧桿菌BB-12 對蠟狀芽孢桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌和糞腸球菌等表現(xiàn)出明顯的抑菌作用[13]。目前，雙歧桿菌BB-12 已在食品、保健等多個領域廣泛應用。

現(xiàn)有文獻中大多將茯苓多糖通過動物實驗或臨床數(shù)據(jù)證實茯苓多糖具有重要的生物活性，通過促進腸道有益菌（雙歧桿菌等）增殖，進而對疾病進行調(diào)控。由于腸道菌群宏基因組測序技術的局限性，目前的體內(nèi)實驗結果僅能反映出體內(nèi)雙歧桿菌等益生菌的豐度和比例上調(diào)，很難從益生菌種的水平或株的水平來證明茯苓多糖對其有明顯的促進作用，并且這些研究結果具體影響的是哪些種類的雙歧桿菌以及產(chǎn)生的具體代謝產(chǎn)物、與免疫等調(diào)控相關的代謝途徑等機理研究尚未見報道。由此，本研究以茯苓多糖為例，基于非靶向代謝組學技術探究動物雙岐桿菌乳雙歧亞種BB-12 發(fā)酵茯苓多糖和葡萄糖代謝產(chǎn)物的差異。擬通過小分子代謝水平解釋茯苓多糖在體內(nèi)分解產(chǎn)生的關鍵產(chǎn)物及其發(fā)揮的生理活性，探究雙歧桿菌與益生元復配的條件下發(fā)揮益生功效的關鍵產(chǎn)物及相關潛在機理，為日后深入研究茯苓多糖的生理活性及雙歧桿菌的益生機制提供新的科學思路和研究模式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 由東北農(nóng)業(yè)大學乳成分功能與營養(yǎng)實驗室保存；MRS 肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；無糖MRS 培養(yǎng)基 上海瑞永生物科技有限公司；茯苓多糖（50%） 西安圣青生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸HPLC 級，賽默飛世爾科技公司。

UHPLC 液相色譜系統(tǒng)、Q-Exactive HF-X 質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技公司；Wonbio-96c 多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5430 R 高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；JXDC-20 氮氣吹掃儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；SBL-10 TD 控溫超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Anaero Pack TM-Anaero 厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱瓦斯化學株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 向無糖MRS 培養(yǎng)基中加入2%的茯苓多糖作為雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵的唯一碳源，然后將MRS 肉湯培養(yǎng)基、加入2%茯苓多糖的無糖MRS 培養(yǎng)基分別裝入5 mL 潔凈試管中，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。

1.2.2 生長曲線的測定與擬合 ?80 ℃保存的動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 使用前均按照2%的比例接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，經(jīng)2 次傳代后，取對數(shù)生長期菌液分別接種至普通MRS 肉湯培養(yǎng)基和加入2%茯苓多糖的無糖MRS培養(yǎng)基中，利用第三代菌種的發(fā)酵液進行實驗。菌種在37 ℃下恒溫厭氧發(fā)酵48 h，每4 h 在波長600 nm處測定一次發(fā)酵液的吸光度及pH，每個樣品做4 個重復。

常用的微生物生長動力學模型有：Gompertz 模型、Logistic 模型、Richards 模型等[14]。本實驗采用Origin Pro 2019 b 軟件中的SGompertz 模型，迭代算法為Levernberg-Marquardt 優(yōu)化算法，表達式如下：

式中，A、xc、k 為參數(shù)[15]，A 為模型所預測的生長最大值；xc為拐點時間，代表在此時生長速率最大；k 為生長速率系數(shù)，曲線在過點（xc，a/e）時擁有最大斜率，即最大的生長速度，為A ×k/e。

1.2.3 發(fā)酵液代謝物前處理 精確移取100 μL 發(fā)酵液至1.5 mL 離心管中，加入400 μL 提取液（甲醇:乙腈=1:1（v:v）），含0.02 mg/mL 的內(nèi)標（L-2-氯苯丙氨酸）；渦旋混勻30 s 后，低溫超聲提取30 min（5 ℃， 40 kHz），將樣品靜置于?20 ℃，30 min；離心15 min（13000 g，4 ℃），移取上清液，氮氣吹干；加入100 μL 復溶液（乙腈:水=1:1）復溶；渦旋混勻30 s，低溫超聲萃取5 min（5 ℃，40 kHz）；離心10 min（13000 g，4 ℃），移取上清液至帶內(nèi)插管的進樣小瓶中進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。另外，每個樣本分別移取20 μL 上清液混合后作為質(zhì)控樣本。

1.2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC HSS T3（ 100 mm×2.1 mm,1.8 μm; Waters, Milford, USA）；流動相A 為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B 為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸），進樣量為2 μL，柱溫為40 ℃，流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序：0~3.5 min，0%~24.5%B；3.5~5.5 min，24.5%~65%B；5.5~7.4 min，65%~100%B；7.4~7.6 min，100%~51.5%B；7.6~7.8 min，51.5%~0%B；7.8~10 min，0%B。

樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。質(zhì)譜條件如下：掃描質(zhì)荷比范圍70~1050，鞘氣流速50 L/min，輔助氣流速13 L/min，加熱溫度425 ℃，毛細管溫度325 ℃，噴霧電壓±3500 V，碰撞能40 eV。

1.2.5 非靶向代謝組學表達量數(shù)據(jù)預處理 根據(jù)樣本或分組內(nèi)缺失值的比例，進行數(shù)據(jù)過濾，去除每一組內(nèi)>20%的缺失值；并用極小值方法對原始數(shù)據(jù)中的缺失值進行模擬填充；數(shù)據(jù)歸一化方法為總和；設置質(zhì)控樣本（Quality Control, QC）中相對標準偏差值≤30%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 26 對數(shù)據(jù)進行顯著性分析等處理，使用Origin Pro 2019 b 對數(shù)據(jù)進行擬合和作圖，利用美吉生物生信云平臺對非靶向代謝組學數(shù)據(jù)進行整合分析。

利用scipy （Python）進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代謝通路富集、相關性分析、聚類分析、Vip 分析；利用ropls （R packages）進行PCA 分析及OPLS-DA 分析，分析數(shù)據(jù)均使用均值中心化方法進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，差異檢驗方法為Student'st-test，除特殊說明外文中置信度均為0.95。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌BB12 代謝茯苓多糖的生長曲線模型及評價

本實驗以葡萄糖為唯一碳源的正常MRS 肉湯培養(yǎng)基作為對照，用以比較雙歧桿菌BB-12 以茯苓多糖為唯一碳源時的生長曲線及發(fā)酵液的pH 變化情況。雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖的組合用Con表示（對照組，下同），雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵茯苓多糖的組合用PPC 表示（實驗組，下同）。雙歧桿菌BB-12 隨時間發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的生長變化狀況及pH 變化如圖1 所示。表1 給出了擬合模型的相關參數(shù)，模型擬合的決定系數(shù)R2均大于0.9，表明模型擬合效果較好。

圖1 雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的生長擬合曲線及pH 變化曲線Fig.1 Growth fitting curve and pH change curve of glucose and polysaccharides ofPoria cocosfermented byBifidobacteriumBB-12

表1 生長動力學方程非線性擬合相關參數(shù)Table 1 Parameters related to nonlinear fitting of growth dynamics equation

結合圖1 和表1 可知，雙歧桿菌BB-12 在以茯苓多糖為碳源的培養(yǎng)基中增殖迅速，細菌進入對數(shù)生長期的時間快于對照組（實驗組xc值小于對照組xc），且進入穩(wěn)定期后期望最大生長數(shù)量大于對照組（實驗組A 值大于對照組）。由此表明，實驗組所添加的茯苓多糖相比對照組可有效增強雙歧桿菌BB-12 的代謝速率，并促進其增殖。

2.2 非靶向代謝組學樣本相關性分析

非靶向代謝組學樣本相關性熱圖如圖2 所示。由圖可知同組內(nèi)樣本相關性較高，即組內(nèi)差異較小，反映樣本之間存在的誤差較小。圖3 分別為正、負離子模式下樣本的PCA 得分圖。R2X（cum）表示累積的差異解釋性，數(shù)值越接近1 說明模型越好。圖中正離子模式PC1 的R2X（cum）為0.709，PC2 的R2X（cum）為0.894，PC1 與PC2 對模型的貢獻率為89.40%；負離子模式PC1 的R2X（cum）為0.756，PC2 的R2X（cum）為0.915，PC1 與PC2 對模型的貢098765獻率為91.50%，主成分對模型貢獻率較高，累積的差異解釋性較好。

圖2 非靶向代謝組學樣本相關性熱圖Fig.2 Correlation heat map of non-targeted metabolomics samples注：圖中的右側和下側為樣本名，圖中每個格子表示兩個樣之間的相關性，不同顏色代表樣本間相關系數(shù)的相對大小，聚類樹枝的長度表示樣本間相對距離的遠近，同一枝上的樣本中比較相似。

圖3 樣本PCA 得分圖Fig.3 PCA score of samples

根據(jù)圖中結果可知，各組樣本在圖中位置分布相對集中，QC 樣本分布效果良好，即組內(nèi)各樣本差異不大，實驗重復性好，隨機誤差較小，且模型對實際樣本分布的解釋性與準確性較好，可進一步對樣本進行差異性分析。

2.3 差異代謝物的篩選與分析

對于不同分組的組間差異比較，采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘回歸模型的判別分析方法（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA），并采用置換檢驗來標識監(jiān)督性學習方法獲得分類不是偶然的。通過這種方式，可以更好地區(qū)分組間差異，提高模型的有效性和解析能力。此外，采用OPLS-DA 模型的VIP>1，P＜0.05 為篩選標準初步篩選出各組的差異代謝物進行下一步分析，并用S-plot 與火山圖對結果分布進行展示。

圖4 與圖5 分別為OPLS-DA 模型建立結果的正離子模式和負離子模式展示圖。結合圖4、圖5及表2 數(shù)據(jù)，可見模型穩(wěn)定可靠且預測能力較好。正、負離子模型的置換檢驗結果Q2（cum）截距值小于0.05，說明本實驗建立的OPLS-DA 模型未發(fā)生過擬合。結合數(shù)據(jù)庫比對，共篩選出101 個陽離子差異代謝物，80 個陰離子差異代謝物。其中，有93 個代謝物顯著下調(diào)，88 個代謝物顯著上調(diào)。圖6 展示了VIP 值前50 的差異代謝物。

表2 模型對X 和Y 矩陣的解釋率及預測能力參數(shù)表Table 2 Parameters of the model's explanatory rate and predictive power for X and Y matrices

圖4 差異代謝物的篩選（陽離子模式）Fig.4 Screening of differential metabolites (positive mode)

圖5 差異代謝物的篩選（陰離子模式）Fig.5 Screening of differential metabolites (negative mode)

圖6 雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵葡萄糖和茯苓多糖的差異代謝物（Top50）Fig.6 Differential metabolites of fermented glucose and polysaccharides ofPoria cocosbyBifidobacteriumBB-12 (Top50)注：左側為代謝物聚類樹狀圖，分支越近，說明樣本內(nèi)所有代謝物的表達模式越接近；每列表示一個樣本，下方為樣本名稱；每行表示一個代謝物，顏色表示該代謝物在該組樣本中相對表達量的大小，顏色梯度與數(shù)值大小的對應關系見梯度色塊。右側為代謝物VIP 條形圖，條形長度表示該代謝物對兩組差異的貢獻值，默認不小于1，值越大表示該代謝物在兩組間差異越大。條形顏色表示代謝物在兩組樣本中差異顯著性，即P_value 值，P_value 越小，-log10（P-value） 越大，顏色越深。右側*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

上述結果顯示，雙歧桿菌BB-12 代謝茯苓多糖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中，上調(diào)最顯著的是一種異喹啉生物堿（Oxoglaucine），報道[16]稱該物質(zhì)具有較強的藥理活性，有抗菌、抗炎、抗癌、修復免疫系統(tǒng)等諸多功能[17]，CHEN 等[18]實驗證明它是一類可有效治療乳腺癌的功能成分。其次上調(diào)的還有丹芝酸、芒柄花素、黃藤素、羥基積雪草酸（Madecassic acid）以及三萜類化合物等成分；羥基積雪草酸是積雪草中有效活性物質(zhì)，已有的報道證明其具有抗氧化、抗抑郁、抗菌、調(diào)節(jié)免疫等生物活性功能[19]，ZHANG 等[20]將CT26 結腸癌細胞注射到小鼠體內(nèi)并用不同劑量的羥基積雪草酸進行治療，發(fā)現(xiàn)羥基積雪草酸在體內(nèi)可通過促使腫瘤細胞凋亡并增強免疫來抑制腫瘤生長；WON 等[21]通過研究其對小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7 的作用發(fā)現(xiàn)，羥基積雪草酸可通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路進而影響腫瘤壞死因子TNF-α、白細胞介素IL-1β、IL-6 等物質(zhì)的分泌，從而在體內(nèi)達到抗炎的效果。黃藤素（Palmatine）同樣具有抗炎、抗菌、提高免疫能力等作用[22]，并且對多種癌細胞系具有抗癌活性[23]，它還可通過誘導胰島素的分泌來達到降低血糖的效果[24]，并降低血液中總膽固醇和甘油三酯含量，提高高密度脂蛋白的含量[25]。TAKAYAMA 等[26]及PARK 等[25]分別通過實驗證實了雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)血脂代謝、治療糖尿病等潛在功效，該代謝物的產(chǎn)生可能是雙歧桿菌發(fā)揮上述功效的原因之一。芒柄花素（Formononetin）是一種異黃酮類化合物，近年來因其抗氧化、抗癌、抗炎等生物學特性而廣受關注[27]。許多研究表明刺芒柄花素具有抑制腫瘤細胞增殖的潛力，如通過多種信號通路誘導腫瘤細胞凋亡等[28?29]，此外，在醫(yī)學領域，這種活性化合物在預防和治療多種疾病方面顯示出潛力，包括肥胖和神經(jīng)神經(jīng)退化性疾病性疾病等[18]。三萜類化合物（（3beta,17alpha,23R）-17,23-Epoxy-3,29-dihydroxy-27-norlanost-8-ene-15,24-dione）是由數(shù)個異戊二烯去掉羥基后首尾相連構成的具有多種生物活性的物質(zhì)，如靈芝三萜有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性等[30]；此外在差異代謝物中差異含量較大的還有丹芝酸E（Ganolucidic acid E）、丹芝酸B（Ganolucidic acid B）和丹芝酸C（Ganolucidic acid C），丹芝酸類也是一種具有較強生理功效的三萜類化合物，有研究證明丹芝酸具有保護肝臟活性[31]和治療HIV-1 的潛在功能[32]；上述分析結果顯示，這些代謝產(chǎn)物可能是茯苓在人體內(nèi)發(fā)揮功效的關鍵因素之一，而腸道內(nèi)的菌群尤其是雙歧桿菌對其代謝可能是該物質(zhì)生成的關鍵前提。

顯著下調(diào)的代謝物有同型胱氨酸、酒石酸、千里光寧堿、膽酸和葡萄糖基胺等。其中，同型胱氨酸和同型半胱氨酸的升高被認為是冠狀動脈、腦動脈和周圍血管發(fā)生動脈粥樣硬化的獨立危險因素[33]。張麗杰等[34]也通過臨床實驗證實口服雙歧桿菌可以降低膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇的含量，對治療動脈粥樣硬化和心腦血管疾病有一定意義。該代謝物的顯著下調(diào)說明茯苓多糖可以更加充分的發(fā)揮雙歧桿菌對這些疾病的預防作用。酒石酸是一種具有肌肉毒性的物質(zhì)，它可以抑制細胞中蘋果酸的生產(chǎn)，而蘋果酸是有氧代謝的重要中間產(chǎn)物；千里光寧堿（Senecionine），是一種有毒的生物堿，可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子的分布從而表達肝臟毒性[35]。這一結果表明，下調(diào)這些代謝產(chǎn)物可能與雙歧桿菌BB-12 發(fā)酵茯苓多糖比發(fā)酵葡萄糖表現(xiàn)出更好的生長性能及減少體內(nèi)炎癥等有關。

2.4 KEGG 差異代謝通路的富集

KEGG 代謝通路圖表示物種代謝的反應、相互作用網(wǎng)絡以及遺傳、環(huán)境信息處理和其他細胞過程等。這些通路不僅提供生化物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化所有可能的代謝途徑，還包含對催化各步反應的酶的全面注解等[36]。

通過與KEGG 數(shù)據(jù)庫比對分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝物共富集到61 條代謝通路，其中，顯著富集17 條（圖7）。富集最顯著的前三個通路為ABC 轉(zhuǎn)運蛋白通路、亞油酸代謝、半乳糖代謝。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ATP—binding cassette transpoter）是一類龐大而古老的跨膜運輸?shù)鞍准易?，在生物體內(nèi)參與多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運積累、有害物質(zhì)解毒、氣孔調(diào)節(jié)、植物防御等生理活動。亞油酸是一種人體必需的不飽和脂肪酸，能降低血液膽固醇，預防動脈粥樣硬化。許多文獻如[37?38]都表明一些雙歧桿菌可以產(chǎn)生亞油酸，RHEE 等[39]的研究也證實雙歧桿菌在預防動脈硬化方面有一定作用。與對照組相比，實驗組中富集到該通路的代謝物均有顯著上調(diào)，這表明茯苓多糖可能促進雙歧桿菌產(chǎn)生亞油酸及相關衍生物，這條通路可能也是雙歧桿菌改善體內(nèi)血脂代謝的潛在機制之一。對半乳糖的代謝是雙歧桿菌較其他微生物所表現(xiàn)出較強的代謝功能之一，該代謝通路的顯著富集也印證了這一點。

圖7 KEGG 差異代謝通路氣泡圖Fig.7 KEGG differential metabolic pathway bubble diagram注：橫坐標為富集率；縱坐標為KEGG 通路。圖中氣泡的大小代表該通路中富集到代謝集中代謝物數(shù)量的多少，氣泡的顏色表示不同富集顯著性P值的大小。

富集因子最高的通路為膽堿能藥物和抗膽堿能藥物途徑（Cholinergic and anticholinergic drugs，Pathway ID：map07220），富集因子達到0.5。該通路中鑒定到了一個關鍵代謝物安普托品（Amprotropine），在該代謝通路中安普托品的前體物質(zhì)是阿托品，阿托品在膽堿能神經(jīng)節(jié)后纖維效應器處，可與遞質(zhì)的乙酰膽堿爭奪受體，主流研究認為乙酰膽堿含量增多與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關。在該條通路中也顯示，這一物質(zhì)是抗帕金森藥物的主要原料之一?，F(xiàn)有的研究結果也報道了雙歧桿菌對帕金森病[40]以及阿爾茲海默癥[41]的治療有促進作用。因此，這條通路可能是雙歧桿菌在腸道內(nèi)發(fā)揮腦-腸軸功效的關鍵通路之一。此外，在該通路中安普托品是治療腸穩(wěn)態(tài)失衡的前體物質(zhì)，該代謝物在實驗組中較對照組顯著上調(diào)，表明茯苓多糖較葡萄糖可以更好地發(fā)揮雙歧桿菌在維持腸穩(wěn)態(tài)中的重要益生功能。

本研究結合OPLS-DA 差異代謝物模型及KEGG差異代謝通路，共篩選出一種三萜類化合物（（3beta,17alpha,23R）-17,23-Epoxy-3,29-dihydroxy-27-norlanost-8-ene-15,24-dione）、芒柄花素、安普托品、同型胱氨酸、酒石酸、丹芝酸E、丹芝酸B、丹芝酸C、異喹啉生物堿、黃藤素、千里光寧堿、羥基積雪草酸共12 種具有相關生理活性的關鍵差異代謝物，并以箱體圖形式（圖8）展現(xiàn)對照組與實驗組之間含量豐度差異。

圖8 12 種關鍵差異代謝物箱體圖Fig.8 Box plot of 12 key differential metabolites

通過對差異代謝物的相關分析發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌BB-12 代謝茯苓多糖產(chǎn)生了許多三萜類、黃酮類物質(zhì)，且這些物質(zhì)大多具有較強的生物活性，如抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)機體免疫等。而這些活性恰好是茯苓多糖在動物實驗和臨床研究中顯示的結果。由此提示，上述代謝產(chǎn)物可能是茯苓發(fā)揮與疾病調(diào)控相關功能的原因之一。此外，通過對差異代謝物的富集得到了幾條重要的代謝通路，這些代謝通路也可能是雙歧桿菌與茯苓多糖在體內(nèi)發(fā)揮相關益生功效的關鍵途徑。

3 結論

本文通過非靶向代謝組學技術，從小分子代謝物層面比較分析了動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12 發(fā)酵茯苓多糖和葡萄糖的代謝產(chǎn)物之間的差異，這些代謝物以及所對應的代謝通路不僅與茯苓多糖和雙歧桿菌的抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫、改善腸道菌群等益生功能密切相關，且與腸道菌群與機體各部位之間如腸-腦軸、腸-肝軸等的平衡與調(diào)節(jié)有關。由此，從科學的角度進一步證實了我國傳統(tǒng)中藥材茯苓多糖發(fā)揮益生功效的部分機制，也為今后探究雙歧桿菌與益生元之間相關性研究建立一種科學有效的模型，并為未來疾病的靶向預防與調(diào)控，以及個性化飲食營養(yǎng)干預奠定了一定的理論基礎。