李 媛 付立業(yè) 孟凡東 張 玲 李 妍 徐 巖

【提 要】 目的 探討CLCA4在乳腺癌患者中的表達(dá)水平，及其與生存預(yù)后的關(guān)系。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取乳腺癌患者的臨床基本資料，R語(yǔ)言ggplot2包分析CLCA4的表達(dá)；survival包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析；卡方檢驗(yàn)分析CLCA4與臨床病理的關(guān)系。結(jié)果 CLCA4在乳腺癌患者中呈低表達(dá)狀態(tài)；CLCA4高表達(dá)的乳腺癌患者具有較好的預(yù)后；CLCA4的表達(dá)水平與乳腺癌患者的T分期和年齡有關(guān)。結(jié)論 CLCA4在乳腺癌患者中低表達(dá)，可為尋找乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)及預(yù)后分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著其診斷及治療方法的不斷進(jìn)步，早期治愈率很高，但其發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的健康及生命[1-3]。不同類型的乳腺癌具有不同的發(fā)病率、死亡率及對(duì)藥物的敏感性。人類基因組文庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)有三種鈣激活氯通道調(diào)節(jié)蛋白(CLCA)分別是CLCA1、CLCA2和CLCA4[4]。人類CLCA基因位于染色體1p31-1p22中[5]。CLCA4基因在多種腫瘤中都具有重要的臨床意義，但目前關(guān)于CLCA4在乳腺癌中的作用及其機(jī)制研究甚少。尋找有效的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，對(duì)提高乳腺癌患者的生存期具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

因此，本研究利用TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了CLCA4在乳腺癌患者中的表達(dá)情況，預(yù)測(cè)其對(duì)乳腺癌患者的生存及預(yù)后能力的影響，并進(jìn)一步探討CLCA4基因的表達(dá)與乳腺癌患者的臨床病理之間的關(guān)系。

資料與方法

1.乳腺癌患者臨床數(shù)據(jù)的收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//portal.gdc.cancer.gov/)中下載乳腺癌患者臨床數(shù)據(jù)，包括乳腺癌患者癌組織標(biāo)本1109例，癌旁組織標(biāo)本113例。其中高表達(dá)組542例，低表達(dá)組540例。在R語(yǔ)言安裝ggplot2包的條件下，分析CLCA4在乳腺癌中的表達(dá)情況，survival包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析[6]。

2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)性檢驗(yàn)，樣本不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)(P<0.05)，選擇Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；log-rank檢驗(yàn)[7]和Cox回歸分析各組的生存時(shí)間分布差異；卡方檢驗(yàn)分析CLCA4與乳腺癌患者臨床病理分期的關(guān)系。P<0.05視為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.CLCA4在乳腺癌患者中的表達(dá)情況

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，CLCA4在乳腺癌患者中呈低表達(dá)狀態(tài)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，如圖1A)。為了進(jìn)一步研究CLCA4在乳腺癌中的作用，將乳腺癌患者進(jìn)行分組分析，結(jié)果顯示，≤51歲的乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于>51歲患者(P<0.0001，如圖1B)；基底細(xì)胞型乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于非基底細(xì)胞型患者(P<0.0001，如圖1C)；ER-乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于ER+患者(P<0.0001，如圖1D)；PR-乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于PR+患者(P<0.0001，如圖1E)；淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對(duì)于CLCA4的表達(dá)無(wú)影響(P=0.1689，如圖1F)；HER2-乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于HER2+患者(P<0.0001，如圖1G)；三陰乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)水平高于非三陰乳腺癌患者(P<0.0001，如圖1H)，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 CLCA4在乳腺癌患者中的表達(dá)

2.乳腺癌患者CLCA4的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響

為了分析CLCA4的表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選取了20年生存期做分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)CLCA4的乳腺癌患者相比低表達(dá)的患者具有更好的預(yù)后，即CLCA4高表達(dá)與乳腺癌患者20年內(nèi)預(yù)后的生存率相關(guān)(P=0.032，如圖2)。

圖2 CLCA4對(duì)乳腺癌患者生存的影響

log-rank檢驗(yàn)結(jié)果提示，乳腺癌患者和正常對(duì)照組的生存時(shí)間分布的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.031；Cox回歸結(jié)果提示，乳腺癌患者和正常對(duì)照組的生存時(shí)間分布的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.70，P=0.032)。

3.CLCA4對(duì)乳腺癌患者的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示AUC=0.912，表明CLCA4對(duì)于乳腺癌的診斷具有一定的臨床價(jià)值。

4.乳腺癌患者中CLCA4基因的表達(dá)與臨床病理分型間的關(guān)系

圖3 CLCA對(duì)乳腺癌診斷的ROC曲線

表1分析了乳腺癌患者中CLCA4的表達(dá)水平與臨床病理分期之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，CLCA4的表達(dá)水平與乳腺癌患者的T分期、年齡有關(guān)，與乳腺癌患者的N分期、M分期不相關(guān)。

表1 CLCA4的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理分期的關(guān)系

討 論

盡管乳腺癌的診斷方法和治療手段不斷進(jìn)步，但乳腺癌仍然是威脅女性健康，導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因。尋找有效的、低成本的預(yù)測(cè)指標(biāo)至關(guān)重要，對(duì)于指導(dǎo)臨床的有效治療意義深遠(yuǎn)。CLCA4作為一種抑癌基因，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的臨床意義，低表達(dá)的CLCA4促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLCA4可以作為口腔癌的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[9]。對(duì)于CLCA4在乳腺癌中的作用研究較少，本研究通過(guò)大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CLCA4在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組織，這與其他腫瘤的文獻(xiàn)報(bào)道一致，可見(jiàn)CLCA4作為抑癌基因，與乳腺癌患者的生存期也顯著相關(guān)，表明CLCA4很可能是乳腺癌的標(biāo)志物并參與了腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，如果早期檢測(cè)該標(biāo)志物，也許可以預(yù)測(cè)患者預(yù)后并作為治療干預(yù)的判斷依據(jù)。

有研究發(fā)現(xiàn)CLCA4在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中發(fā)揮重要作用[10]。參與許多上皮源性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移，對(duì)患者的生存及預(yù)后造成很大影響[11-12]。Hou等[13]研究發(fā)現(xiàn)CLCA4可能在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。臨床分析揭示了CLCA4在膀胱癌中的下調(diào)與膀胱癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。CLCA4的下調(diào)增強(qiáng)了膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力，而CLCA4的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)降低了這些作用[14]。沉默CLCA4表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)[15]。

生存曲線證實(shí)CLCA4基因表達(dá)升高的乳腺癌患者，其生存時(shí)間明顯高于CLCA4基因表達(dá)降低的患者，表明CLCA4的升高對(duì)于乳腺癌具有一定的抑制作用。ROC曲線結(jié)果提示CLCA4對(duì)于乳腺癌的預(yù)測(cè)能力具有較高的準(zhǔn)確性。CLCA4有望成為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的重要手段。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLCA4在乳腺癌組織中低表達(dá)，并且CLCA4的表達(dá)水平與乳腺癌的T分期和年齡存在一定的相關(guān)性。低表達(dá)CLCA4的乳腺癌患者，其生存預(yù)后較差，本文的研究為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后評(píng)價(jià)及靶向藥物的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。