杜燁青，任 發(fā)，李 宇，席華明，王 智，溫 飛，張利坤，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

奶山羊養(yǎng)殖作為陜西傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，是陜西特色農(nóng)業(yè)的重要組成部分。隨著奶山羊養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，優(yōu)質(zhì)飼草短缺等問題日益嚴重，影響奶山羊養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，阻礙了奶山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。雜交構(gòu)樹(Hybrid，HBP)是中科院植物所培育的一種高蛋白、高營養(yǎng)、低成本的新型木本飼料原料，營養(yǎng)豐富，含有多種活性物質(zhì)，能夠有效替代苜蓿等高成本飼草作為奶山羊養(yǎng)殖的主要粗飼料來源。劉玉等研究發(fā)現(xiàn)，雜交構(gòu)樹的最佳刈割高度為1.0～1.5 m左右，這時候全株雜交構(gòu)樹粗蛋白含量為20.5%～23%，木質(zhì)素等粗纖維含量相對較低，用來制作全株雜交構(gòu)樹青貯效果較好。長期飼喂青貯飼料會改變動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，而動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)改變可能會對其精液品質(zhì)產(chǎn)生影響。Ding等研究發(fā)現(xiàn)，將高脂飲食小鼠糞便微生物移植到正常飲食老鼠腸道中，會使老鼠精子密度和精子活力降低；Inatomi等也發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)日糧中添加淀粉芽孢桿菌能夠在一定程度上改善雞精液品質(zhì)，提高精液抗氧化性。

本試驗以奶山羊為研究對象，對照組飼喂苜蓿干草，試驗組飼喂雜交構(gòu)樹青貯飼料，通過檢測奶山羊精液品質(zhì)，利用16S rDNA擴增子測序技術(shù)檢測公羊糞便微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，初步探討了雜交構(gòu)樹青貯飼料對奶山羊糞便微生物群落結(jié)構(gòu)與精液品質(zhì)的影響，為雜交構(gòu)樹青貯飼料的進一步開發(fā)和利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設(shè)計

本試驗于2019年9月21日至12月1日在陜西某奶山羊育種公司奶山羊養(yǎng)殖場進行。試驗期70 d，其中預(yù)飼期10 d，正飼期60 d。選取8月齡左右、體重(34±2.3)kg、健康狀況良好的關(guān)中奶山羊公羊30只，隨機分為2組，每組15只，試驗組以青貯雜交構(gòu)樹飼料+花生秧為粗飼料，對照組以苜蓿干草+花生秧為粗飼料。雜交構(gòu)樹青貯由陜西某飼草公司提供，于2019年7月份，雜交構(gòu)樹高度為1.2 m左右收割，全株粉碎至1～2 cm，制作裹包青貯，每包約重80 kg，試驗所用其他飼料原料均由奶山羊育種公司提供。

1.2 試驗飼糧

試驗采用全混合日糧(TMR)，兩種飼料按照等能等氮原則配制，營養(yǎng)水平參照NRC(2007)設(shè)計，并參照趙明明等的方法計算飼料的代謝能(ME)。飼料配方和營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗羊分欄飼養(yǎng)，每天早7：00和晚18：00各飼喂一次，中午補飼玉米，自由采食，自由飲水，每次飼喂前清理之前的剩料。試驗開始前按規(guī)定對羊舍進行消毒，對試驗羊進行驅(qū)蟲免疫，試驗過程中保證羊舍清潔衛(wèi)生。

1.4 樣本采集及指標檢測

1.4.1 精液樣本采集 試驗結(jié)束前1周分別從試驗組和對照組中選擇體況良好、健康無疾病的公羊進行采精，利用電刺激法采集公羊精液，5 min內(nèi)送回實驗室，放置于37 ℃水浴鍋內(nèi)，利用計算機輔助精子分析(Computer assisted sperm analysis，CASA)檢測公羊精液品質(zhì)。

1.4.2 精液品質(zhì)檢測 取羊精液樣品5 μL左右制片，置于37 ℃恒溫載物臺上，利用CASA檢測精液品質(zhì)，分別記下3個視野下的精子密度、精子活率和精子活力，取其平均值。

1.4.3 糞便樣本采集 隨機選擇試驗組和對照組體況良好、健康無疾病的公羊各5只，于試驗結(jié)束時(第70天)早晨飼喂后約15 min采用部分收糞法采集糞樣，糞便保存于滅菌試管中，-80 ℃貯存待測。

1.4.4 糞樣16S rDNA測序 將采集的糞樣送往諾和致源生物技術(shù)有限公司進行微生物16S rDNA基因測序分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)方差分析，利用GraphPad進行圖表制作，采用檢驗進行顯著性檢。<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交構(gòu)樹青貯飼料對奶山羊精液品質(zhì)的影響

精液品質(zhì)檢測結(jié)果如表2所示，試驗組公羊精液精子密度為31.78×10·mL，顯著高于對照組(22.22 ×10·mL)(<0.05)；試驗組公羊精液量和精子活力比對照組分別高19.39%和5.27%，但差異均不顯著(>0.05)。

表2 雜交構(gòu)樹青貯對公羊精液常規(guī)指標

2.2 組間微生物差異物種分析

組間微生物差異物種分析結(jié)果如圖1所示。在門水平上，奶山羊糞便中的微生物主要有厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)，其中試驗組擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著高于對照組，變形菌門(Proteobacteria)豐度顯著低于對照組(<0.01)；在目水平上，試驗組奶山羊糞便中擬桿菌目(Bacteroidales)顯著高于對照組，氣單胞菌目(Aeromonadales)顯著低于對照組(<0.01)；在科水平上，試驗組奶山羊糞便中理研菌科(Rikenellaceae)顯著高于對照組，琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)顯著低于對照組(<0.01)。

圖1 奶山羊糞便微生物種群結(jié)構(gòu)差異分析

3 討 論

3.1 雜交構(gòu)樹青貯飼料對奶山羊糞便微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

奶山羊腸道內(nèi)存在細菌、真菌、原蟲和古細菌等多種微生物，對山羊的消化吸收、免疫系統(tǒng)發(fā)育、胃腸道功能、繁殖性能、甚至腦部活動都有一定影響。一般情況下，附生在山羊腸道內(nèi)的微生物種類大致相同，但長期飼喂不同飼料會導(dǎo)致其微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，從而影響山羊的生長與發(fā)育。本試驗通過對奶山羊糞便進行16S rDNA基因測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中門水平相對豐度最高的為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。通過進一步檢測分析發(fā)現(xiàn)，飼喂雜交構(gòu)樹青貯飼料能夠增加公羊糞便中擬桿菌綱(Bacteroides)、擬桿菌目(Bacteroidales)和理研菌科(Rikenellaceae)的豐度，減少γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、氣單胞菌目(Aeromonadales)和琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)的豐度，這可能是由于雜交構(gòu)樹在青貯過程中乳桿菌數(shù)量增加，產(chǎn)生乳酸、揮發(fā)性脂肪酸和各種細菌素等物質(zhì)，快速降低了青貯飼料的pH，抑制了有害菌的生長，導(dǎo)致雜交構(gòu)樹青貯飼料中的微生物群落結(jié)構(gòu)改變，提高了飼料品質(zhì)，從而改善奶山羊后腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，維持后腸道健康，為奶山羊的機體健康和生長發(fā)育帶來積極影響。

3.2 雜交構(gòu)樹青貯飼料對奶山羊精液品質(zhì)的影響

在正常情況下，影響畜禽精液品質(zhì)的因素很多，其中遺傳因素對精液品質(zhì)的影響只占10%，其余90%由環(huán)境因素決定，而外部環(huán)境因素包括飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)水平、采精方式等。本試驗利用電刺激法采集8月齡左右的公羊精液，對照組平均精液量為0.98±0.42 mL，試驗組平均精液量為1.17±0.41 mL，差異不顯著，表明與飼喂苜蓿干草相比，雜交構(gòu)樹青貯飼料對奶山羊精液量沒有顯著影響。山羊精子密度一般在30×10～40×10/mL，而本試驗中的精子密度在20×10～30×10/mL，這可能是由于電刺激使公羊副性腺收縮變強，導(dǎo)致收集的精液中精漿變多。精子活力和精子密度有一定關(guān)系，精子活力能夠充分反映精子的授精能力。本試驗中飼喂雜交構(gòu)樹青貯飼料的公羊精液精子密度顯著高于苜蓿干草飼喂組，表明雜交構(gòu)樹青貯飼料能夠在一定程度上改善奶山羊精液品質(zhì)，這可能與奶山羊后腸道微生物群落結(jié)構(gòu)改善和雜交構(gòu)樹的抗氧化能力有關(guān)。

反芻動物腸道健康情況與其腸道微生物的組成和作用密切相關(guān)。腸道微生物具有充當神經(jīng)化學(xué)傳遞載體的能力，調(diào)節(jié)和干預(yù)動物的神經(jīng)或免疫系統(tǒng)，形成“腸道微生物-腸道-腦軸”的作用方式，對其生長發(fā)育、能量代謝以及中樞神經(jīng)信號傳導(dǎo)等都有一定影響。MacFabe研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌()能夠在動物胃腸道中產(chǎn)生多巴胺，實現(xiàn)細菌與宿主之間的雙向通訊，說明腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的改變確實通過某種方式影響著動物的生長發(fā)育和繁殖。本試驗中，飼喂雜交構(gòu)樹青貯飼料能夠顯著減少奶山羊后腸道中的變形菌門和氣單胞菌目的細菌豐度，而變形菌門和氣單胞菌目細菌中存在很多致病菌，這些致病菌雖然沒有引發(fā)疾病，但能給奶山羊腸道健康帶來危害。特別是氣單胞菌屬細菌，其屬于兼性厭氧、葡萄糖代謝呼吸型兼發(fā)酵型細菌，利用糖和有機酸作為碳源，部分氣單胞菌能夠分泌腸毒素，破壞腸道上皮細胞和黏膜結(jié)構(gòu)，引起腸道功能紊亂，影響奶山羊?qū)θ占Z蛋白質(zhì)的消化和吸收，青年公羊?qū)Φ鞍踪|(zhì)的需求量大，如果蛋白攝入不足，很容易影響睪丸發(fā)育，甚至出現(xiàn)無精子等癥狀，從而影響奶山羊精子密度。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物能夠參與飼草中酚類化合物的分解，例如黃酮、黃烷醇等植物中常見的酚類化合物能夠通過微生物被腸道吸收，這些活性物質(zhì)被腸道吸收后通過門靜脈運輸?shù)絼游锲渌M織和器官，發(fā)揮抗菌、抗氧化作用。雜交構(gòu)樹中含有大量黃酮類和酚類化合物，黃酮和酚苷類化合物分子中有較多的羥基，能夠捕獲自由基，提供氫離子，競爭性結(jié)合組織活細胞內(nèi)的活性氧，起到抗氧化的作用，雜交構(gòu)樹青貯飼料中的黃酮類和酚苷類化合物被奶山羊腸道吸收后，能夠通過血液運輸?shù)讲G丸等器官，清除自由基和活性氧，發(fā)揮抗氧化作用，有效保護精子免受氧化應(yīng)激損傷，從而提高羊精子密度和精子活力，改善精液品質(zhì)。

4 結(jié) 論

飼喂雜交構(gòu)樹青貯飼料能夠顯著提高奶山羊糞便中擬桿菌門的豐度，降低變形菌門豐度，改善奶山羊后腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)，維持后腸道健康，促進奶山羊生長發(fā)育，改善繁殖性能，在一定程度上提高奶山羊精液品質(zhì)。