郭文陽，張宗源，潘夢(mèng)詩，周留柱，亓蘭達(dá)，徐宏光，張英濤

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

近年來人們?cè)桨l(fā)重視安全健康的生活環(huán)境，預(yù)防日常生活中各種致病微生物的侵?jǐn)_，以致消毒劑的使用和需求量與日俱增，抗菌消毒技術(shù)也在加速發(fā)展［1］.目前殺菌消毒劑仍然以有機(jī)和無機(jī)殺菌劑為主，其中以金屬納米材料為主要成分的無機(jī)殺菌劑是研究熱點(diǎn)之一［2］.金屬納米材料一般指粒徑尺寸在1～100 nm之間的材料，因其顆粒小，比表面積大，常常表現(xiàn)出獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，不同于普通的金屬物質(zhì)［3-4］.特別是納米銀材料，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和優(yōu)異的抗菌性能，被廣泛應(yīng)用于電子、光學(xué)、生化、航天和醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域［5］.目前納米銀的制備方法主要分為化學(xué)法、物理法和生物法.其中，化學(xué)法是利用還原劑將銀離子還原生成納米銀粒子，因其合成過程迅速，粒徑大小可控，并且可大量制備，成為制備納米銀的主流方法［6-7］.但是化學(xué)法需要用到一些有毒有害的試劑，比如檸檬酸鈉、乙二醇、硼氫化鈉等，往往會(huì)對(duì)環(huán)境安全和人體健康造成一定的威脅，不利于可持續(xù)發(fā)展.物理法主要包括真空氣體冷凝法、高壓磁控濺射法、激光燒蝕法和機(jī)械研磨法，這些方法對(duì)儀器的性能要求都比較高，制備條件苛刻、成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn).目前新興的、符合可持續(xù)發(fā)展的生物法逐漸成為制備納米銀的研究熱點(diǎn).生物法制備納米銀是利用生物中存在的某些物質(zhì)或者在其生長(zhǎng)代謝過程中分泌、轉(zhuǎn)化得到的成分，與金屬鹽溶液反應(yīng)得到金屬納米粒子，其中包括植物類、微生物類、藻類、碳水化合物、生物類聚合物等［4，8］.有研究表明植物類浸提物［9-11］、水果浸提物［12-13］等物質(zhì)都含有許多具有還原性和穩(wěn)定性的化學(xué)成分，可作為還原劑將Ag+轉(zhuǎn)化為納米銀，得到納米銀的粒徑大概在5～60 nm之間，并且這些成分還能對(duì)制備的納米銀粒子形成覆蓋隔離的效果，以減少粒子間的團(tuán)聚［14-15］.浸提法制備納米銀的反應(yīng)過程比較快，但需要用到各種萃取劑和提取液，對(duì)溫度要求比較高，工藝復(fù)雜.而基于微生物介導(dǎo)的方法制備納米銀具有綠色環(huán)保、成本低廉、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，此方法合成的納米銀產(chǎn)品必將具有更大的市場(chǎng)潛力［16］.

納米銀粒子的抗菌性隨粒徑的減小而增強(qiáng)，以納米銀為主要成分的消毒劑一直在被研究和推廣，相對(duì)于酒精、過氧化氫、含氯消毒劑等物質(zhì)，它安全、無刺激性氣味、具有廣譜的殺菌性、藥效持久，并且不易于產(chǎn)生耐藥性.目前報(bào)道的通過一些微生物合成納米銀的研究有很多［18-19］，并取得了相應(yīng)進(jìn)展，但有效制備納米銀的菌種有很大的局限性，并且制備的納米銀粒徑較大，抗菌作用不夠突出.本研究利用已篩選的一種真菌黑曲霉HQ-1，可以簡(jiǎn)易快捷、低成本地制備小粒徑納米銀，并具有良好的抑菌活性，可為納米銀抗菌材料的發(fā)展提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑曲霉菌（Aspergillus niger）：從河南省鄭州市金水區(qū)東風(fēng)渠河道土中篩選得到，經(jīng)AgNO3馴化后將其命名為HQ-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為CGMCC No.22415.

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌：來源于河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司.

AgNO3：分析純，購買自鄭州派尼化學(xué)試劑廠.

PDA和PDB培養(yǎng)基：購買自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，pH 7.2±0.2.

實(shí)驗(yàn)用水全部為去離子水.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將土樣中篩選的菌株用含有AgNO3的PDB培養(yǎng)基，在30℃、180 r/min條件下，馴化培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基中AgNO3的濃度依次為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L（以下mol/L記作M），挑選含5.0 mM AgNO3的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的耐銀菌株，經(jīng)微生物菌種鑒定為黑曲霉菌（見下文2.1）.取馴化篩選得到的黑曲霉HQ-1接種到PDA培養(yǎng)基，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確保菌株的生長(zhǎng)活性.菌株接入100 mL PDB液體培養(yǎng)基，置于30℃、150 r/min的恒溫?fù)u床保持3 d，之后過濾得到菌絲體；然后用無菌蒸餾水清洗4次，除去培養(yǎng)基成分，將濾得的菌絲體加入100 mL無菌蒸餾水中重懸，同樣條件下培養(yǎng)1 d，之后再次過濾得到二次發(fā)酵濾液.取100 mL濾液于250 mL的錐形瓶中，添加1.0 mL的AgNO3溶液（100 mM），放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 d，分別在正常（不做光照處理）和光照的條件下進(jìn)行合成納米銀的實(shí)驗(yàn).同時(shí)取100 mL黑曲霉的二次發(fā)酵濾液，不添加AgNO3溶液，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組.對(duì)制備的納米銀溶液進(jìn)行表征分析，通過溶液的紫外吸收峰強(qiáng)度、電鏡圖、Zeta電位值以及溶液中顆粒的形貌、大小、分布情況等參數(shù)，分析納米銀的生成情況.最后應(yīng)用牛津杯法分析本研究實(shí)驗(yàn)制備的納米銀對(duì)常規(guī)致病菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的抑菌效果.

1.3 樣品性能及表征

對(duì)實(shí)驗(yàn)用的HQ-1菌送到深圳微生太科技有限公司進(jìn)行鑒定，得到HQ-1的基因序列，將序列文件與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與HQ-1序列相似性最大的物種信息.將制備的納米銀溶液混合均勻，用移液器吸取2.5 μL，利用超微量紫外可見分光光度計(jì)（Nanodrop 2000）對(duì)制備的納米銀溶液進(jìn)行紫外掃描檢測(cè)，根據(jù)紫外吸收峰的出峰情況，判斷納米銀的生成效果.溶液中納米銀的形貌特征用鎢燈絲透射電鏡（JEM-1200EX）觀察，制樣觀察流程為：首先對(duì)納米銀溶液樣品做稀釋和超聲處理；然后將封口膜平鋪在玻璃片上，用鑷子把銅網(wǎng)夾放在封口膜上，用移液槍吸取10 μL樣品滴在銅網(wǎng)上，等待10 min之后用小片濾紙將多余液體吸走；最后計(jì)時(shí)60 min，待銅網(wǎng)自然晾干之后放在透射電鏡樣品臺(tái)上觀察.溶液中納米銀粒徑大小和Zeta電位值利用馬爾文激光粒度儀（Zetasizer Nano ZS90）測(cè)量，其步驟為：取約2.0 mg樣品，加至有1.0 mL純水的樣品池中，超聲震蕩5 min，使樣品完全分散，進(jìn)行測(cè)量.納米銀對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果采用牛津杯法，通過觀察抑菌圈大小進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

本研究的整體實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分析流程如圖1所示.

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Flow diagram of experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉HQ-1的鑒定

對(duì)實(shí)驗(yàn)篩選的HQ-1菌序列，在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)得到的結(jié)果，利用MEGA-X軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹，得到結(jié)果如圖2所示.可明確看出，與測(cè)試物種HQ-1序列相似性最大的物種為黑曲霉（Aspergillus nigerATCC 16888），并且根據(jù)NCBI中比對(duì)的結(jié)果，兩者的序列相似性達(dá)到了99.8%，基本可以確定本實(shí)驗(yàn)篩選的HQ-1為黑曲霉菌屬.

圖2HQ-1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 HQ-1 phylogenetic tree

2.2 紫外全波長(zhǎng)掃描（UV-Vis）

眾所周知，納米銀溶液是一種相對(duì)穩(wěn)定的膠體體系，在掃描波長(zhǎng)為410～440 nm之間能出現(xiàn)明顯的特征吸收峰.對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下制備的納米銀溶液，利用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到光譜圖的結(jié)果如圖3、圖4所示.從圖3中可以看出，合成進(jìn)行1 d之后，正常組的反應(yīng)液在420～440 nm波長(zhǎng)之間，并未出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，意味著溶液中未有納米銀生成；然而在同樣的波段間，光照組的反應(yīng)液出現(xiàn)了特別明顯的紫外吸收峰，初步說明溶液中生成了納米銀，這與前人的研究成果相一致［20-21］.另有研究表明，微生物生長(zhǎng)代謝之后的發(fā)酵液中存在還原性酶之類的物質(zhì)，可以使溶液中的金屬離子被還原［22-23］.推測(cè)黑曲霉在發(fā)酵過程中也有還原性的物質(zhì)產(chǎn)生，在光照的條件下，可以使Ag+被還原成小顆粒的銀單質(zhì)形成納米銀溶液，或許這是反應(yīng)液能合成納米銀的主要原因.圖4反映的是光照條件下納米銀溶液反應(yīng)1 d、20 d、40 d的紫外吸收情況，從中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，光照條件下制備納米銀溶液的紫外吸收峰強(qiáng)度并未降低，反而有小幅度的上升，說明溶液中納米銀濃度有所增加；其最大吸收峰的位置沒發(fā)生紅移或藍(lán)移，意味著納米銀粒徑未發(fā)生變化，整體納米銀溶液一直比較穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯聚沉現(xiàn)象.因此，由以上結(jié)果可看出，光照條件下利用黑曲霉HQ-1能快速合成納米銀，并且穩(wěn)定性良好.另外需要指出的是，反應(yīng)溶液的紫外吸收?qǐng)D譜并非光滑的曲線，分析可能是由于黑曲霉HQ-1發(fā)酵液中存在一些蛋白、多糖、脂肪酸之類的物質(zhì)影響了紫外可見分光度計(jì)入射光的平穩(wěn)吸收所導(dǎo)致.對(duì)此，后續(xù)研究將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，盡可能降低發(fā)酵液導(dǎo)致的不利影響.

圖3 納米銀溶液的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution

圖4 光照下納米銀溶液的紫外吸收光譜圖Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of nano-silver solution under light

2.3 透射電子顯微鏡（TEM）觀察

目前制備納米銀的方法多樣，通過不同實(shí)驗(yàn)方法制備的納米銀粒子大小和結(jié)構(gòu)各有不同，比如已報(bào)道的納米銀有球形［24］、管柱形［25-26］、塊狀［27-28］、線形［29］、錐型［30］等形貌，納米銀的形貌特征、尺寸大小與反應(yīng)介質(zhì)和添加AgNO3的濃度有很大關(guān)系［31］.本研究使用分辨率大約為1.0 nm的透射電子顯微鏡對(duì)光照條件下制備的納米銀溶液進(jìn)行觀察，分析反應(yīng)溶液中納米銀的形貌、分散情況，評(píng)估粒徑大小，得到透射電鏡的結(jié)果如圖5所示.

圖5 納米銀溶液的透射電鏡圖Fig.5 TEM image of nano-silver solution

從圖5中可以看出，不管是在200 nm還是50 nm的尺度下觀察，納米銀粒子在溶液中是分散開來的、表面光滑的圓球形顆粒，僅有少量聚集，直觀來看顆粒大小均在20 nm以下.納米銀粒子在反應(yīng)溶液中分布相對(duì)較均勻，沒有出現(xiàn)大量團(tuán)聚的情況，能夠穩(wěn)定存在.

2.4 粒徑大小分析

利用馬爾文激光粒度儀測(cè)量光照條件下制備納米銀的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）粒徑，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，繪制得納米銀顆粒的體積分布如圖6所示.納米銀顆粒尺寸主要集中在10 nm以下，很少部分出現(xiàn)在10～100 nm之間.同樣的，從餅狀圖中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，制備納米銀的粒徑范圍很窄，主要集中在3～10 nm之間，占比高達(dá)93.4%，粒徑大小在10～100 nm之間的納米銀顆粒體積占比約為6.0%，其余大于100 nm的顆粒僅占比0.6%.根據(jù)已知的研究結(jié)果，利用納米銀作為殺菌劑有效成分，其粒徑越小，殺菌效果越好.本實(shí)驗(yàn)制備的納米銀粒徑分布集中，有很大的抗拒優(yōu)勢(shì).另外，在同等條件下，將納米銀粒徑做到10 nm以下的研究成果并不多見，表明利用黑曲霉HQ-1發(fā)酵液制備納米銀粒子的方法，有很大的可行性和研究?jī)r(jià)值.

圖6 納米銀粒子的體積分布圖Fig.6 Volume distribution of nano-silver

2.5 Zeta電位分析

眾所周知，膠體溶液中分散粒子的表面都帶有一定的電荷，彼此間會(huì)相互排斥和吸引，以致最終會(huì)形成一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，使得溶液體系穩(wěn)定存在.Zeta電位可用來評(píng)價(jià)微粒分散體系的物理穩(wěn)定性，是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力強(qiáng)度的度量.一般Zeta電位絕對(duì)值越高，溶液中粒子間的靜電斥力越大，其物理穩(wěn)定性也就越好.基于此，對(duì)光照條件下制備的納米銀溶液測(cè)量Zeta電位值，得到的結(jié)果如圖7所示.從圖7中可以明顯看出，納米銀溶液的Zeta電位值在-50～-20 mV之間，電勢(shì)的峰值體現(xiàn)在-30.5 mV的位置，其電位絕對(duì)值整體高于20 mV，以此說明本方法制備的納米銀粒子在溶液中的靜電斥力較大，分散體系有良好的物理穩(wěn)定性.

圖7 納米銀溶液的Zeta電位圖Fig.7 Zeta potential diagram of nano-silver solution

2.6 納米銀的抑菌性分析

選取實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種常規(guī)致病菌，各自接種后，在37℃、150 r/min恒溫的條件下培養(yǎng)2 d，得到菌懸液，經(jīng)梯度稀釋、涂板、測(cè)定，可知大腸桿菌的濃度為4.0×108CFU/mL，金黃色葡萄球菌的濃度為7.0×108CFU/mL.分別取200 μL菌懸液均勻涂布到LB培養(yǎng)基上，之后在培養(yǎng)基上放置3個(gè)無菌牛津杯，然后各取200 μL在光照條件下制備的納米銀溶液、空白發(fā)酵液和1.0 mM AgNO3溶液做對(duì)比，加入牛津杯中，分析制備的納米銀溶液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果.扣除空白發(fā)酵液的抑菌影響，根據(jù)抑菌圈大小作圖，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示.從圖8中可知，AgNO3和納米銀對(duì)大腸桿菌的抑菌圈平均直徑分別為16.2 mm和14.8 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑分別為16.8 mm和15.3 mm.兩者對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較接近，但整體以AgNO3的抑菌效果略占優(yōu)勢(shì)，此結(jié)果與楊婧等［32］的研究結(jié)論相一致.然而，AgNO3產(chǎn)品在市場(chǎng)上不允許流通，將其作為消毒產(chǎn)品有很大的局限性，所以納米銀在抑菌材料方面有很大的應(yīng)用潛力.已有研究表明：納米銀粒子的粒徑越小，其抗菌作用越強(qiáng)，并且隨著粒徑的減小，其抗菌的類型也更加廣泛，進(jìn)而表現(xiàn)出廣譜的抗菌性［17，33］；納米銀的粒徑越小，比表面積越大，進(jìn)而釋放銀離子的效果越強(qiáng)烈.因此，分析納米銀粒子產(chǎn)生抑菌性的原因可能是：一方面是粒徑較小的納米銀可以透過細(xì)胞膜，阻礙細(xì)胞代謝和分裂，從而加速細(xì)胞的死亡［34］；另一方面是Ag+帶有較強(qiáng)的正電荷，更易于和微生物表面的負(fù)電荷結(jié)合，進(jìn)而溶解細(xì)胞膜、改變細(xì)胞的通透性、抑制細(xì)菌脫氫酶的活性，破壞細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到殺滅微生物的目的［35］.

圖8 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Bacteriostatic test results

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)初步探究了篩選、馴化的黑曲霉HQ-1的發(fā)酵濾液與AgNO3反應(yīng)制備納米銀粒子的情況.經(jīng)過一系列的表征和分析，發(fā)現(xiàn)在光照條件下，黑曲霉HQ-1的發(fā)酵液可與1.0 mM AgNO3快速反應(yīng)制備納米銀粒子；制備的納米銀溶液中有93.4%的粒徑分布很窄，集中在3.0～10.0 nm之間，比文獻(xiàn)報(bào)道的最小粒徑進(jìn)一步降低，且分散性良好；另外，制備的納米銀粒子對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性基本達(dá)到了同樣濃度AgNO3的抗菌效果，且其穩(wěn)定性和市場(chǎng)流通性遠(yuǎn)高于AgNO3，可為抗菌材料的發(fā)展與推廣提供支持.