李 棟，張立攀

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450000）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc），又名棗皮、藥棗、肉棗等，屬山茱萸科山茱萸屬，是我國一種傳統(tǒng)的中藥材，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效.經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山茱萸中含有環(huán)烯醚萜類、多糖、熊果酸、齊墩果酸等多種化學(xué)成分，在降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等方面也有一定作用.

山茱萸在我國分布較為廣泛，其中河南省是山茱萸的主要產(chǎn)區(qū)，重點分布在洛陽、南陽山區(qū)，是河南省優(yōu)勢地方植物資源.這些地區(qū)有將山茱萸作為水果食用的傳統(tǒng)習(xí)慣.2019年1月，國家衛(wèi)生健康委發(fā)文《關(guān)于對黨參等9種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點工作的通知》（國衛(wèi)食品函〔2019〕311號），將山茱萸在河南省按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)（食藥物質(zhì)）開展生產(chǎn)經(jīng)營試點工作.這預(yù)示山茱萸在食品領(lǐng)域有著很大的發(fā)展前景.風(fēng)味是食品的一個重要特性，對山茱萸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究對其今后在食品領(lǐng)域的開發(fā)研究具有現(xiàn)實意義.

全二維氣相色譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）分析是20世紀(jì)90年代初才興起的一種新型的分析技術(shù).它通過調(diào)制器將分離機(jī)理不同而又相互獨立的兩根柱子串聯(lián)起來，較傳統(tǒng)的一維氣相色譜，GC×GC峰容量更大、分離速度更快、靈敏度更高等.使得全二維氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)在食品分析領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用，尤其在分析葡萄酒［1］、白酒［2-4］、牛肉肉味香精［5］、煙草［6］、茶葉［7］等風(fēng)味分析方面有很顯著的優(yōu)勢.

香氣活度值（odor activity value，OAV）可以比較全面地評價風(fēng)味物質(zhì)對氣味貢獻(xiàn)的大小，它同時考慮了化合物含量及香氣閾值兩個因素，但由于計算OAV值需要化合物的絕對含量，而通常分析鑒定出的化合物種類較多，進(jìn)行準(zhǔn)確的定量十分復(fù)雜.劉登勇等［8］提出了相對香氣活度值（relative odor activity value，ROAV）的概念，在不用確定化合物絕對含量的情況下，即可量化評價不同揮發(fā)性物質(zhì)對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，進(jìn)而確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物.ROAV值越大的組分對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)也就越大，且ROAV≥1的組分為所分析樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV＜1的化合物對樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用［9］.

目前已有文獻(xiàn)對茱萸保健酒［10］、利口酒香氣［11］、山茱萸種子提取物成分［12］進(jìn)行分析，也有對山茱萸提取物應(yīng)用于卷煙增香的研究［13］.關(guān)于山茱萸風(fēng)味的研究還比較欠缺，胡勁光等［14］采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合GC-MS法對山茱萸果實的香氣進(jìn)行過分析，本課題組也采用SPME-GC/MS法對山茱萸進(jìn)行過分析［15］，但目前采用GC×GC-TOFMS法對山茱萸揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析的文獻(xiàn)還未見報道.所以本文采用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation and extraction，SDE）法對山茱萸中的揮發(fā)性成分進(jìn)行富集提取，通過GC×GC-TOFMS分析，結(jié)合保留指數(shù)及質(zhì)譜比對進(jìn)行化合物鑒定，并進(jìn)一步采用ROAV法評價化合物對山茱萸風(fēng)味的貢獻(xiàn).對山茱萸揮發(fā)性組分的研究，有助于山茱萸風(fēng)味香精的開發(fā)，擴(kuò)大山茱萸在食品領(lǐng)域應(yīng)用，為產(chǎn)品開發(fā)提供指導(dǎo).

1 材料與儀器

山茱萸，河南省西峽縣；正構(gòu)烷烴C7～C30，Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DF101S水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；SDE裝置（定制），山東莘縣京興玻璃儀器有限公司；FA2004電子天平，上海衡際科學(xué)儀器有限公司；GGT 0620全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，廣州禾信儀器股份有限公司；CTC PAL RTC全自動多功能在線前處理進(jìn)樣平臺，瑞士CTC公司.

2 試驗方法

2.1 同時蒸餾萃取（SDE）

將50 g山茱萸和250 mL水加入500 mL三孔圓底玻璃燒瓶中，置于SDE裝置的一端，130℃油浴加熱，機(jī)械攪拌.50 mL二氯甲烷于100 mL圓底燒瓶中置于SDE裝置的另一端，45℃水浴加熱，磁力攪拌.連續(xù)提取3 h.萃取液加入適量的無水硫酸鈉干燥，Vigrex柱濃縮至5 mL，氮吹至1.5 mL.按如上進(jìn)行兩次平行實驗.

2.2 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）

氣相色譜條件：第一維色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），第二維色譜柱為DB-17（1.1 m×0.18 mm×0.18 μm），進(jìn)樣口溫度為280℃，進(jìn)樣1 μL，不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；柱箱采用程序升溫，起始溫度為40℃，保持3 min，以4℃/min升溫到280℃，保持3 min.調(diào)制柱為HV調(diào)制柱（1.2 m×0.25 mm），調(diào)制周期為5 s，其中解析時間為1 s；N2補(bǔ)償氣為0.15 MPa，同步GC升溫程序，調(diào)制器進(jìn)口比柱箱高30℃，調(diào)制器出口比柱箱高120℃.

飛行時間質(zhì)譜條件：電子轟擊源，電離能70 eV；離子源溫度為230℃，接口溫度為250℃；采集質(zhì)量范圍40～500 amu，采集速度為100譜/s，檢測器電壓為-1800 V；溶劑延遲3 min.

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用全二維數(shù)據(jù)處理工作站軟件Canvas載入數(shù)據(jù)，自動繪制全二維TIC輪廓圖，并對圖中信噪比大于100的峰自動識別，標(biāo)識出的每一個峰點即代表一種化合物，每個化合物由一對保留時間確定，X軸方向為第一維保留時間（min），Y軸方向為第二維保留時間（s）.進(jìn)一步通過對每個化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫比對檢索、結(jié)合保留指數(shù)等信息，對化合物進(jìn)行定性分析；采用峰面積歸一化法計算相對含量.

3 結(jié)果與分析

3.1山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析

采用同時蒸餾萃取法對山茱萸中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行富集，SDE萃取物進(jìn)一步通過GC×GC-TOFMS分析，并對化合物進(jìn)行鑒定，得到山茱萸揮發(fā)性風(fēng)味組分的構(gòu)成.圖1為山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析三維色譜圖.由圖1可以看出，一維色譜柱分析時會有很多共流出的化合物，所以僅靠一維色譜柱的分析，會使得化合物的鑒定十分困難.它們在二維色譜柱上能夠很好地分離.說明全二維氣相色譜分析在分離復(fù)雜化合物時具有更顯著的優(yōu)勢，分離效果更好，從而也會使得鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確.

山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析化合物分析鑒定結(jié)果見表1.

通過對每個化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫比對檢索、結(jié)合保留指數(shù)等信息，選擇正反匹配度均大于700的化合物作為鑒定結(jié)果；采用峰面積歸一化法計算相對含量，共鑒定出包括醛類、酮類、醇類、酯類、飽和烴類、烯烴類、芳香烴類、雜環(huán)類、其他類共計105種化合物，分別為15種、6種、24種、7種、22種、13種、8種、3種和7種.質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的為醇類（32.01%）、醛類（18.23%）和烯烴類（13.82%）.

醇類鑒定出了24種化合物，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（＞1%）的化合物有1-辛烯-3-醇、1-辛醇、反式-氧化芳樟醇、芳樟醇、α-松油醇、桉油烯醇、異桉油烯醇、依蘭-4，10（14）-二烯-1β-醇、.tau.-Muurolol、榧烯醇、α-畢橙茄醇.桉油烯醇、異桉油烯醇、.tau.-Muurolol和榧烯醇常見于植物揮發(fā)油的分析檢測中，.tau.-Muurolol在香椿葉中有被檢測出［16］，α-畢橙茄醇具有清香、青草香，在茶葉香氣分析時被檢測到［17］.

醛類物質(zhì)多具有青香，是對香氣貢獻(xiàn)較大的一類化合物.在山茱萸中鑒定出的醛類物質(zhì)中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%以上的有3-甲基丁醛、戊醛、己醛、辛醛、壬醛、α，4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛和衣蘭烯醛.其中己醛、辛醛均具有青草香氣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.47%、2.09%.衣蘭烯醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.18%，在玫瑰花、楠木葉片精油中均檢測到該物質(zhì)［18-19］.

圖1山茱萸SDE萃取物GC×GC-TOFMS分析三維色譜圖Fig.1 Three-dimensional chromatogram of extracts from Cornus officinalis by SDE of GC×GC-TOFMS analysis

烯烴類共鑒定出13種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占13.82%.其中β-愈創(chuàng)木烯的含量較高，大于3%.鑒定出的烯烴類物質(zhì)中還有檸檬烯、胡椒烯、石竹烯、γ-依蘭油烯、α-依蘭油烯、α-去二氫蓽澄茄烯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.46%、1.39%、0.49%、0.24%、1.50%、0.52%.檸檬烯是一種單萜烯化合物，常見于柑橘類水果的精油中，具有典型的檸檬香氣，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、香料等行業(yè)［20］.檸檬烯、胡椒烯、石竹烯在胡椒精油中都有被檢測出.γ-依蘭油烯、α-依蘭油烯存在于依蘭油中，具有辛香、木香.鑒定出的烯烴類物質(zhì)中很多為萜烯類化合物，是植物中廣泛存在的一種次生代謝產(chǎn)物，是甲戊二羥酸衍生的具有（C5H8）n通式的鏈狀或環(huán)狀的烯烴類衍生物，主要靠植物體內(nèi)的生物合成產(chǎn)生，參與植物香氣的形成，因而在分析植物的揮發(fā)性物質(zhì)時常常被檢測到［21］.

酮類和酯類物質(zhì)鑒定出的化合物數(shù)量相對較少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.57%、4.92%，種類分別為6種、7種.酮類中6，10，14-三甲基-2-十五烷酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為1.93%.

其他化合物的含量均比較低.酯類物質(zhì)中含量最高的化合物為十六酸甲酯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.14%.

雜環(huán)類物質(zhì)共檢測鑒定出3種，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為甲基吡嗪，為3.82%；飽和烷烴共鑒定出22種，占9.22%；其他類化合物共包含7種，總量占到5.5%.

表1山茱萸果實GC×GC-TOFMS分析結(jié)果Tab.1 The analysis results of Cornus officinalis by GC×GC-TOFMS

續(xù)表

續(xù)表

3.2 山茱萸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV分析

通過查閱文獻(xiàn)獲得化合物的氣味閾值［22］，結(jié)合表1中化合物的含量計算山茱萸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV見表2.

表2 山茱萸風(fēng)味物質(zhì)ROAVTab.2 ROAV of the flavor compounds of Cornus officinalis

由表可知，ROAV≥1（由大到?。┑慕M分有（E）-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、壬醛、芳樟醇、庚醛、辛醛、2-十一烯醛、1，2-二氫-1，1，6-三甲基萘、（E）-2-辛烯醛、戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、甲基吡嗪、（E）-2-癸烯醛、1，1-二乙氧基乙烷、反式-氧化芳樟醇，這些化合物是山茱萸的關(guān)鍵風(fēng)味化合物.0.1≤ROAV＜1（由大到?。┑幕衔镉?-辛醇、癸醛、α-松油醇、（E）-6，10-二甲基-5，9-十一碳烯-2-酮、1-壬醇、1-癸醇、對二甲苯、石竹烯、（Z）-2-庚烯醛，這些化合物對山茱萸的風(fēng)味具有重要的修飾作用.

其中3-甲基丁醛和壬醛的ROAV值分別為19.89、11.75，相對較高，說明它們對風(fēng)味的貢獻(xiàn)比較大.通過比較可以看出，1-辛醇的含量是3-甲基丁醛的4倍左右，但3-甲基丁醛對風(fēng)味的貢獻(xiàn)卻遠(yuǎn)超過1-辛醇，這就是兩種化合物氣味閾值差異較大造成的.

山茱萸關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)中醛類占了10種，是貢獻(xiàn)最大的一類化合物.其中，己醛具有青草香以及青蘋果的氣味.辛醛具有青香、柑橘香、脂肪香.戊醛、庚醛和壬醛均具有青香.3-甲基丁醛為支鏈醛，閾值很低，僅為0.002 mg/kg，具有很強(qiáng)的揮發(fā)性，呈現(xiàn)出果香、黑巧克力香.（E）-2-辛烯醛具有油脂香、霉香，（E）-2-壬烯醛具有黃瓜味，（E）-2-癸烯醛具有青香.1-辛烯-3-醇具有典型的蘑菇味.芳樟醇具有清新的花香，是一種常用的香料物質(zhì)，是白蘭花揮發(fā)油中的主要成分［23］.反式-氧化芳樟醇可由芳樟醇氧化得到，也具有甜香、花香氣息，普遍存在于多種天然植物中.雖然在含量上，反式氧化芳樟醇比芳樟醇高，但由于芳樟醇的閾值僅有0.005 3 mg/kg，所以其ROAV值比反式氧化芳樟醇高很多，對山茱萸風(fēng)味有很大貢獻(xiàn).吡嗪具有堅果香，烤香，且香味閾值較低，為0.06 mg/kg，對風(fēng)味影響較大.正是這些化合物氣味之間的相互作用，共同構(gòu)成了山茱萸主體的青甜果香氣息.

α-松油醇具有丁香、松針香的氣息，在哈密瓜中被檢測到［24］.辛醇具有甜味，1-壬醇、1-癸醇分別具有青香、油脂香.石竹烯具有木香氣.它們都對山茱萸的總體風(fēng)味起著一定的作用.

續(xù)表

4 結(jié)論

通過SDE法對山茱萸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取，結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析，共分析鑒定出了105種化合物，其中包括醛類（15種）、酮類（6種）、醇類（24種）、酯類（7種）、飽和烴類（22種）、烯烴類（13種）、芳香烴類（8種）、雜環(huán)類（3種）、其他類（7種）.質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的為醇類（32.01%）、醛類（18.23%）和烯烴類（13.82%）.較本課題組之前的研究結(jié)果，由于使用了GC×GC-TOFMS分析，鑒定出了更多種化合物，在化合物含量和種類上的差異與風(fēng)味富集方法的不同存在一定關(guān)系.但分析結(jié)果顯示含量和種類較多的化合物同樣是醇類、醛類和烯烴類，這與之前的分析結(jié)果一致.

通過ROAV分析，發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)對山茱萸風(fēng)味起著重要的作用，其中比較關(guān)鍵的風(fēng)味化合物有（E）-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、壬醛、庚醛、辛醛、2-十一烯醛、（E）-2-辛烯醛、戊醛、己醛、（E）-2-癸烯醛.此外，醇類中的芳樟醇、1-辛烯-3-醇、反式-氧化芳樟醇也對風(fēng)味有著較大的貢獻(xiàn).計算ROAV時化合物閾值多來源于文獻(xiàn)資料，不同化合物在不同基質(zhì)中呈現(xiàn)出的閾值也存在差異，且有些化合物未能找到閾值，因此會對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響.可以采取氣相色譜嗅聞、電子鼻等分析手段進(jìn)一步確定山茱萸的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，從分子感官角度研究山茱萸風(fēng)味物質(zhì)之間的相互作用，對山茱萸在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考.