班紫妍， 劉長富， 劉夢娜， 宋 敏

兒童支氣管哮喘具有發(fā)病率高、容易反復發(fā)作的特點[1]。支氣管哮喘的病因主要在于氣管等慢性炎性反應導致氣道高反應性，從而引起氣道狹窄或痙攣使氣道出現(xiàn)不完全可逆性氣流受限，進而引發(fā)支氣管哮喘。支氣管哮喘可引起炎性介質等細胞因子水平升高，機體免疫功能異常，支氣管哮喘患兒易于繼發(fā)感染[2]。臨床資料顯示，在支氣管哮喘合并感染患兒中，以肺部感染所占比例最高，而肺部感染可破壞氣道上皮細胞，造成氣道損傷，致使呼吸道管腔變窄，加重氣道高反應性，這也是導致患兒支氣管哮喘反復發(fā)作的主要原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)，T細胞亞群調節(jié)免疫應答的強度，其數(shù)量及功能的異常與感染引起的炎性反應密切相關[4]。有報道稱，在調控T淋巴細胞分化中Notch信號通路發(fā)揮重要的作用[5]。Notch信號通路是高度保守的信號轉導途徑，目前該通路在肺部感染對支氣管哮喘患兒的影響尚無報道。本研究分析肺部感染對支氣管哮喘患兒免疫紊亂的影響并對其相關機制進行初步研究，為臨床防治支氣管哮喘合并肺部感染奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月—2019年2月于四川省內江市中醫(yī)醫(yī)院就診的支氣管哮喘合并肺部感染患兒70例作為感染組，納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016 年版）》相關診斷標準[6]；②肺功能指標第1秒用力呼氣容積（FEV1）占預計值百分比在30%～80%；③肺部感染符合《美國急性病醫(yī)院預防醫(yī)院感染策略綱要（2014更新版）》[7]；④年齡3～10周歲；⑤合并呼吸道病毒感染患兒（包括流感病毒 A 型、流感病毒 B 型、副流感病毒、腺病毒、合胞病毒）。排除標準：①伴隨有血液系統(tǒng)、肝腎功能障礙以及惡性腫瘤的患兒；②就診前2周服用影響免疫功能藥物的患兒；③合并免疫功能缺陷、有呼吸衰竭史患兒；④合并精神疾病的患兒。選擇同期經接受支氣管哮喘治療但并未合并肺部感染的支氣管哮喘患兒84例作為未感染組。另納入65例同期于我院體檢健康兒童作為對照組。所有入組者的監(jiān)護人均簽署知情同意書，研究經醫(yī)院倫理委員會批準展開。

1.2 方法

1.2.1 基本參數(shù)收集 收集入組者性別、年齡、病程、體質量指數(shù)（BMI）、收縮壓等臨床基本參數(shù)，所有受檢者禁食8 h后抽取靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，4℃、3 000 r/min離心15 min，血清通過全自動生化分析儀（美思康 MC6600）檢測其白蛋白（Alb）、血鈣（Ca）、血磷（P）、肌酐（Cr）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（FPG）、尿素（BUN），比濁法檢測尿白蛋白/肌酐（UACR）。

1.2.2 ELISA法檢測血液炎性因子 檢測前禁水禁食8 h，于次日清晨抽取肘靜脈血3～5 mL，常溫放置1 h，2 500 r/min離心15 min，取血清分裝于無菌EP管內，置于-80℃保存，采用ELISA法檢測血清白細胞介素17（IL-17）、轉化生長因子β（TGF-β）和IL-10的水平，試劑盒均采購自北洋百川生物科技有限公司，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 肺功能檢測 采用德國耶格BEI-159肺功能檢測儀進行肺功能檢測，肺功能指標包含用力肺活量（FVC）、FEV1、用力肺活量比值（FEV1/FVC）、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比即一秒率（FEV1%）。

1.2.4 流式細胞術檢測Th17、Treg細胞水平 取患兒空腹靜脈血5 mL放入EDTA抗凝管中，一次加入抗體（FITC抗人IL-17 mAbIgG、FITC 抗人CD25mAb）10 μL，室溫下避光孵育30 min，然后加入200 μL溶血素避光放置15 min，裂解紅細胞。3 000 r/min離心5 min，用PBS重懸后再離心洗滌2次，沉淀底物100 μL的1%多聚甲醛溶液固定，流式細胞儀檢測Treg、Th17細胞水平。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測外周血單核細胞Notch1、Hes1的mRNA表達 治療前后，采集患兒清晨外周血并分離單核細胞，TRIzol試劑提取總RNA，用 DNA/RNA 測量儀測得RNA濃度。取符合要求的RNA樣本，采用qRT-PCR 法擴增 Notch1 mRNA、Hes1 mRNA。按照PrimeScrip反轉錄試劑盒進行反轉錄成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq說明書進行擴增。擴增結束后，產物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳20 min，PUX Mix Marker 作為分子量參照物同時電泳，引物序列為Notch1（上游 5'-ACTGAGCAAGCTTGGCCCAGGACA-3'，下游 5'-TAGCCTCGCCAGAATTGTGA-3'），Hes1 （上游5'-ATGAAGCCGAACAGTTGTGC-3'，下游5'-GTCGTAAACCCGTACGGAGA-3'），以β-actin（上游5'-GCTGATCGACGGATCCATAT-3'，下游 5'-GGGTGATCCGTGGTTCAACT-3'）為內參，在凝膠成像分析儀的紫外光下采集圖像，采用 Gepro 4.2 軟件分析目的基因與同一條帶β-actin的光密度比值。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0，符合正態(tài)分布的計量資料采用平均數(shù)±標準差進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用獨立t檢驗，采用Pearson進行相關性分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料對比

三組入組者年齡、性別、BMI、收縮壓和舒張壓等一般資料及血液生化指標相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），未感染組與感染組患兒病程差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），三組間具有可比性，見表1。

表1 三組入組者一般資料對比Table 1 Clinical data compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.2 肺功能情況對比

感染組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC以及FEV1%明顯低于未感染組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；未感染組FEV1、FVC、FEV1/FVC以及FEV1%明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組肺功能情況比較Table 2 Pulmonary function compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.3 細胞因子的對比

與對照組相比，未感染組和感染組患兒血清IL-17、TGF-β水平明顯升高，血清IL-10水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；感染組變化更明顯，與未感染組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組細胞因子比較Table 3 Serum level of cytokines compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.4 Th17、Treg細胞水平比較

與對照組相比，未感染組和感染組Treg細胞比例明顯降低，Th17細胞比例和Th17/Treg比值明顯升高；感染組變化更明顯，與未感染組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組Th17、Treg細胞水平比較Table 4 Th17/Treg cell compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.5 外周血單核細胞Notch1、Hes1的mRNA表達

感染組患兒Notch1 mRNA、Hes1 mRNA表達水平明顯高于未感染組和對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），未感染組Notch1 mRNA、Hes1 mRNA明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、表5。

表5 三組Notch1 mRNA、Hes1 mRNA表達水平比較Table 5 Expression levels of Notch1 mRNA and Hes1 mRNA compared between children in terms of asthma and pulmonary infection

2.6 相關性分析

對 Notch1 mRNA、Hes1 mRNA與Th17、Treg細胞比例進行相關性分析，結果顯示，Notch1 mRNA、Hes1 mRNA與Th17細胞比例呈明顯正相關關系（r=12.356，P＜0.01），與Treg細胞比例呈明顯負相關（r=-11.458，P＜0.01），見圖2。

3 討論

兒童支氣管哮喘是兒科常見疾病，其病程較長，易發(fā)生并發(fā)癥[8]。支氣管哮喘患兒處于局部炎癥反應時期，肺部黏膜保護機制受到破壞，防御能力減弱，病原菌穿透黏膜屏障易位，從而誘發(fā)感染[9]。即使臨床對于支氣管哮喘患兒肺部感染已經重視并采取預防控制，但該類患兒仍是肺部感染的高發(fā)人群[10]。本研究結果顯示，感染組肺功能指標明顯低于未感染組，說明在這兩種呼吸系統(tǒng)疾病共同作用下，會加重患兒的臨床癥狀，嚴重影響其生活質量。支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展與免疫紊亂密切相關，而病原菌的直接侵害也會影響機體的免疫反應導致異常和慢性的炎癥反應，但肺部感染對支氣管哮喘患兒炎癥-免疫的影響研究較少，因此，從此方面對上述患兒進行研究，以期為臨床的預防和治療工作提供參考。

近年來研究表明，Th17和Treg細胞屬于CD4+T 細胞亞群，二者在生理功能上相互制約，共同參與調節(jié)機體免疫反應[11]。當機體處于穩(wěn)態(tài)時，T細胞趨于向Treg細胞方向分化，維持免疫耐受。當發(fā)生炎性反應或感染時，免疫系統(tǒng)激活，誘導T細胞向 Th17 細胞分化，導致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]。本研究中支氣管哮喘患兒Treg細胞比例均明顯低于對照組，而Th17細胞比例和Th17/Treg比值明顯升高，提示支氣管哮喘加劇Th17和Treg細胞平衡向Th17轉化，從而參與氣道及全身炎性反應。Th17細胞是新發(fā)現(xiàn)的輔助性淋巴細胞亞群，因分泌細胞因子IL-17而命名。IL-17可誘導IL-6、GM-CSF等基因的表達從而增強TNF-α介導的炎性反應，還可通過刺激巨噬細胞釋放促炎因子加劇氣道的炎癥程度[13]，還可趨化中性粒細胞進入肺組織釋放彈力蛋白酶破壞肺組織[14]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染可增加小鼠肺臟Th17水平，且IL-17可以在一定程度評價感染程度[15]。Treg細胞與其他CD4+T細胞不同，是一類具有抑制炎性反應作用的CD4+T細胞，在支氣管哮喘黏膜組織修復過程中發(fā)揮重要作用[16]。其分泌的TGF-β、IL-10等細胞因子可以抑制巨噬細胞、Th細胞釋放促炎因子，從而抑制炎性反應的產生及維持人體的免疫耐受[17]。報道稱，肺部感染患兒血清IL-17水平明顯高于正常人群[18]。本研究通過對穩(wěn)定期支氣管哮喘患兒Th17、Treg T細胞亞群及細胞因子的測定，探討肺部感染對患兒全身系統(tǒng)炎癥的影響，結果顯示，肺部感染患兒IL-17、Th17及Th17/Treg比值均明顯高于未感染患兒，IL-10、TGF-β、Treg均明顯下降，說明肺部感染可導致支氣管哮喘患兒Th17/Treg細胞免疫失衡，從而導致全身炎癥反應加重。

Noth信號通路是T細胞分化、增殖和活化的重要通路，在多種免疫疾病中發(fā)揮重要作用。在成熟的免疫細胞表面均有Noth受體的表達，Notch是一種單次跨膜受體蛋白，通過細胞間相互作用可活化下游靶基因Hes，影響T細胞的生理功能，特別是在Th17/Treg細胞分化中作用最為顯著[19]。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎小鼠Th17細胞及Th17/Treg明顯升高，同時Notch信號通路蛋白表達水平明顯上調[20]。Gurczynski等[21]研究Notch信號通路γ分泌酶抑制劑（GSI）對肺部感染小鼠的炎癥進展發(fā)現(xiàn)，小鼠脾臟Th17/Treg水平趨于平衡，氣道炎癥程度和臨床癥狀明顯減輕。本研究中感染組患兒Notch1 mRNA、Hes1mRNA明顯增高，與該組患兒Th17細胞占優(yōu)勢相一致。進一步分析顯示，Notch1 mRNA、Hes1mRNA的表達與Th17細胞呈正相關，與Treg細胞呈負相關，表明肺部感染可能通過Notch信號通路調節(jié)Th17/Treg免疫平衡參與支氣管哮喘的進展。

綜上所述，肺部感染降低支氣管哮喘患兒肺功能，加重全身炎癥程度，其可能的機制是肺部感染通過增強Notch信號通路促進支氣管哮喘患兒Th17、Treg細胞免疫紊亂。