韓杰　王璐瑤　馮瑞章　梁?jiǎn)⒚鳌×汉汀∥呵佟堄虏?/p>

摘要：【目的】明確檸檬酵素對(duì)小鼠降脂減肥作用及免疫功能的影響，為探究檸檬酵素用于治療肥胖引起的高血壓、糖尿病和心血管疾病提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳許PF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)飼喂H10301型60%高脂高糖飼料35 d構(gòu)建肥胖模型，然后以低劑量（310.0 mg/kg）、中劑量（620.0 mg/kg）、高劑量（1240.0 mg/kg）檸檬酵素及奧利司他（陽(yáng)性對(duì)照，15.6 mg/kg）分別經(jīng)口灌胃肥胖小鼠，持續(xù)給藥42 d，空白對(duì)照組小鼠飼喂普通飼料及灌胃等體積的生理鹽水。給藥期間記錄動(dòng)物體重及攝食量;給藥結(jié)束后計(jì)算小鼠的Lee’s指數(shù)、臟器指數(shù)及脂體比，測(cè)定各處理組小鼠的血脂水平[總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）]及葡萄糖耐量，制作組織切片觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況和病理變化，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞各亞群比例?！窘Y(jié)果】經(jīng)檸檬酵素處理后可有效降低肥胖小鼠的體重、Lee’s指數(shù)和脂體比，其中以檸檬酵素高劑量組的效果最佳，表現(xiàn)為小鼠的體重和Lee’s指數(shù)極顯著低于肥胖模型組小鼠（P<0.01，下同），脂體比顯著低于肥胖模型組小鼠（P<0.05，下同），但對(duì)小鼠的攝食量無(wú)顯著影響（P>0.05，下同）。灌胃檸檬酵素后，肥胖小鼠的肝臟指數(shù)明顯下降，而脾臟、心臟和腎臟的臟器指數(shù)均無(wú)顯著差異;血清中的TC、TG和LDL-C水平較肥胖模型組小鼠呈不同程度的下降趨勢(shì)，HDL-C水平則極顯著升高;檸檬酵素可改善肥胖小鼠肝臟中脂質(zhì)聚積的情況，其葡萄糖耐受能力也得到明顯改善。此外，檸檬酵素能促進(jìn)肥胖小鼠脾臟中CD4比例升高，同時(shí)降低CD8比例，且具有一定的濃度依賴(lài)性，在高劑量檸檬酵素作用下CD4/CD8比值由肥胖模型組小鼠的1.49±0.11上升至3.20±0.42;CD4Foxp3在檸檬酵素介入后顯著降低?！窘Y(jié)論】檸檬酵素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠具有較強(qiáng)的減肥效果，還能改善肥胖小鼠免疫狀態(tài)較差的現(xiàn)象，因此檸檬酵素可作為減肥保健食品在慢性疾病輔助治療中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 小鼠;檸檬酵素;肥胖癥;脂質(zhì)沉積;葡萄糖耐量;淋巴細(xì)胞亞群

中圖分類(lèi)號(hào)： S816.75? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0557-11

Beneficial effects of lemon enzyme on high-fat diet-induced obesity and immune function in mice

HAN Jie WANG Lu-yao FENG Rui-zhang LIANG Qi-ming LIANG Han-qiao WEI Qin ZHANG Yong-bo

（1College of Life Sciences & Food Engineering， Yibin University/Key Lab of Aromatic Plant Resources Exploitation and Utilization in Sichuan Higher Education， Yibin， Sichuan? 644000， China; 2Dean of Biomedical School， Beijing City University， Beijing? 100094， China; 3Yibin Longmao Lemon Plantation Company， Yibin， Sichuan? 644000， China）

Abstract：【Objective】To illustrate the effect of lemon enzyme on reducing fat， weight loss and immune function in mice， so as to provide a theoretical basis for the treatment of hypertension， diabetes and cardiovascular diseases caused by obesity by lemon enzyme. 【Method】 C57BL/6J mice of SPF grade were fed H10301， a 60% high-fat and high sugar diet for 35 days to establish the obesity model. Then， the mice of the fat model group were gavaged with either a low concentration （310.0 mg/kg）， medium concentration （620.0 mg/kg） or high concentration（1240.0 mg/kg） of citrin for 42 days. Orlistat （15.6 mg/kg） was used as a positive control. The mice of the control group were fed with normal diet and normal saline of the same volume. The body weight and food intake were recorded during administration. After administration， the Lee’s index， organ index and lipid body ratio were calculatedand the blood lipid levels [total triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） and glucose tolerance of mice in each treatment group were measured. Tissue sections were prepared to observe the changes in liver lipid deposition and pathological structure and the proportion of lymphocyte subsets in the mouse spleen were detected by flow cytometry.【Result】Fat model groups receiving a lemon enzyme treatmenthad significantly lowered body weight， Lee’s index and fat body ratio， of which the treatment with the high concentration of lemon enzyme produced the best improvements：relative to the control group， the body weight and Lee’s index of mice were notably and significantly lower （P<0.01， the same below） and the fat body ratio was significantly lower （P<0.05， the same below）， with no significant effect on mice food intake （P>0.05， the same below）. After intragastric administration of lemon enzyme， the liver index of obese mice decreased significantly， but there was no significant difference in the organ indices of spleen， heart orkidney. The levels of serum TC， TG and LDL-C were decreased in varying degrees compared with the control group， while the level of serum HDL-C increased significantly. Lemon enzyme reduced lipid accumulation in the liver of obese mice， with an improved glucose tolerance. In addition， lemon enzyme increased the proportion of CD4 in the spleen of obese mice and reduced the proportion of CD8. After treatment with the high concentration lemon enzyme， the ratio of CD4/CD8 changed from 1.49±0.11 to 3.20±0.42 in the obese model group. CD4Foxp3 decreased significantly after lemon enzyme intervention. 【Conclusion】 Lemon enzyme can reduce weight induced by a high-fat diet and improve the poor immune state in obese mice. Therefore， lemon enzyme can be used as a weight loss health food in the adjuvant treatment of chronic diseases.

Key words： mice; lemon enzyme; obesity; lipid accumulation; glucose tolerance; lymphocyte subsets

Foundation items： National Natural Science Foundation（31700025）; Open Fund Project For Development and Utilization of Spice Plant Resources of Sichuan Provincial Key Laboratory（2018XLZ011）

0 引言

【研究意義】肥胖癥是由遺傳、運(yùn)動(dòng)、飲食和環(huán)境等多種因素共同作用而形成。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人類(lèi)生活水平的不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)與生活方式也隨之改變，超重和肥胖的問(wèn)題逐漸突出（Formiguera and Cantón，2004）。目前普遍認(rèn)為，引起肥胖癥的最基本原因是體內(nèi)能量代謝平衡失調(diào)而引起脂肪堆積（鄒大進(jìn)和吳鴻，2006;黃桂麗等，2021）。此外，肥胖可導(dǎo)致機(jī)體白細(xì)胞分布和數(shù)量的改變，造成淋巴細(xì)胞活性下降及免疫系統(tǒng)防御功能降低（劉礪等，2017），進(jìn)而給人類(lèi)健康造成影響。因此，開(kāi)展以天然健康產(chǎn)品為原料的減肥產(chǎn)品對(duì)改善肥胖癥及提高自身免疫具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】食用植物酵素是以植物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得含有特定生物活性成分的可食用新型發(fā)酵健康食品。由于酵素中富含纖維素酶、酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和超氧化物歧化酶等一系列生物活性物質(zhì)，具有抗菌消炎、分解消化及潤(rùn)腸通便等功效，已成為近年來(lái)功能保健食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一（劉加友和王振斌，2016）。戴凌燕等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，糙米酵素有助于降低血脂，提高體內(nèi)消化酶含量，從而起到減肥作用。郭爽（2015）研究表明，敖東酵素可有效抑制大鼠體重增長(zhǎng)和脂肪的積累，具有減肥功效。馬巧靈等（2015）以自制的蘋(píng)果酵素灌胃II型糖尿病小鼠28 d，結(jié)果表明蘋(píng)果酵素能有效抑制II型糖尿病小鼠血糖的增加，且降低血清中血脂（Triglyceride，TG）和總膽固醇（Total cholesterol，TC）的含量，但有關(guān)酵素降糖降脂的作用機(jī)理尚不明確。Garcia-Diaz等（2015）、邵穎等（2018）通過(guò)構(gòu)建大鼠肥胖模型，以大鼠的體重增加量、體脂質(zhì)量及脂肪/體重比為考察指標(biāo)，評(píng)價(jià)酵素對(duì)肥胖大鼠的減肥功效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物酵素可明顯改善肥胖大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)，具有一定的減肥功效。于苗等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，中劑量長(zhǎng)白山果蔬發(fā)酵物不僅能降低肥胖大鼠的體重，還具有降低TG和TC及升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的功效，推測(cè)與發(fā)酵物富含水溶性膳食纖維能起到降血脂的作用且增加大鼠的飽腹感有關(guān)。此外，酵素在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)領(lǐng)域同樣應(yīng)用廣泛，主要集中在農(nóng)作物增產(chǎn)、改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、防治病蟲(chóng)害和修復(fù)土壤等方面（文亞雄和譚石勇，2016），將酵素與飼料相結(jié)合可提高飼養(yǎng)效率和降低成本，且能降低禽畜發(fā)病率（張昕悅等，2018）。趙英和金琳（2015）通過(guò)研究新型玉米酵素專(zhuān)用肥對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)施用酵素肥的玉米根系發(fā)達(dá)、毛細(xì)根系數(shù)量增加，玉米植株生長(zhǎng)發(fā)育良好，其產(chǎn)量顯著提高。文亞雄和譚石勇（2016）研究證實(shí)，使用酵素菌肥料能有效改良土壤結(jié)構(gòu)，保持土壤水分及溫度，促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，且能提高土壤中的有機(jī)質(zhì)含量。萬(wàn)賽羅等（2019）研究表明，在白山羊精料中添加酵素營(yíng)養(yǎng)液能有效增加其增長(zhǎng)速率，加快育肥進(jìn)程，同時(shí)能增加白山羊的體重，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。檸檬[Citrus limon （L.） Burm. F.]屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬常綠小喬木，是繼橙、柑之后第三大柑橘品種。檸檬中富含類(lèi)黃酮、維生素、膳食纖維、香精油、類(lèi)胡蘿卜素和生物堿等成分，在預(yù)防糖尿病、心血管疾病和癌癥等方面具有重要的生理功能（張思等，2016;周淑儀等，2018）。檸檬酸可有效預(yù)防代謝類(lèi)疾病，降低肥胖的風(fēng)險(xiǎn)（González-Molina et al.，2010）。此外，檸檬汁可降低高尿酸小鼠中的血清尿酸水平，即食用檸檬可能對(duì)高尿酸血癥有改善作用（Wang et al.，2017）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)檸檬酵素的研究主要集中在其抗氧化能力等方面（張超等，2017;陽(yáng)剛等，2018），有關(guān)檸檬酵素降血脂的研究至今尚無(wú)相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)研究檸檬酵素對(duì)小鼠降脂減肥作用及淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的影響，了解檸檬酵素對(duì)肥胖及肥胖導(dǎo)致免疫功能失調(diào)的調(diào)控作用，為探究檸檬酵素用于治療肥胖引起的高血壓、糖尿病和心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠[許可證號(hào)SCXK（京）2020-0004]購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，規(guī)格13～15 g。H10301型60%高脂高糖飼料（含蛋白質(zhì)20%、碳水化合物20%、脂肪60%、熱量5.24 kcal/g）和對(duì)照飼料（含蛋白質(zhì)20%、碳水化合物70%、脂肪10%、熱量3.85 kcal/g）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。檸檬酵素（采用乳酸菌和酵母混合發(fā)酵6個(gè)月，批號(hào)201901130）購(gòu)自四川宜賓市龍茂檸檬種植有限公司;CD3、CD4和CD8熒光抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;FoxP3熒光標(biāo)記抗體、固定劑和破膜劑購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司;裂紅液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;油紅染料購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;膽固醇檢測(cè)試劑盒、甘油三酯測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)試盒及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。主要儀器設(shè)備：血糖測(cè)定儀（德國(guó)Merck公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1. 2 動(dòng)物建模、分組及給藥

所有小鼠自由采食和飲水，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，對(duì)照組小鼠繼續(xù)飼喂普通飼料，其他小鼠則飼喂高脂飼料35 d;根據(jù)公式（1）計(jì)算小鼠肥胖度，取肥胖度大于20%的小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，即肥胖模型組，每組10只小鼠。給藥組分別灌胃相應(yīng)劑量檸檬酸酵素，空白對(duì)照組和肥胖模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天各處理組定時(shí)按照10 mL/kg的劑量進(jìn)行灌胃。給藥過(guò)程持續(xù)42 d，每隔4 d檢測(cè)1次動(dòng)物體重（g）變化及攝食量。

肥胖度（%）=（肥胖模型組小鼠體重-對(duì)照組小鼠體重）/對(duì)照組小鼠體重×100 （1）

1. 3 肥胖小鼠試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

1. 3. 1 小鼠體質(zhì)量和攝食量測(cè)定 小鼠自由采食和飲水，給藥期間每天上午9：00記錄小鼠攝食量（g），間隔4 d稱(chēng)量1次小鼠體重（g）。

攝食量=給食量-剩食量? ? （2）

1. 3. 2 臟器指數(shù)和脂肪系數(shù)考察 最后1次灌胃給藥結(jié)束后，各處理組小鼠禁食過(guò)夜，稱(chēng)量小鼠體重（g），游標(biāo)卡尺測(cè)量體長(zhǎng)（鼻尖到肛門(mén)外沿的距離，cm），按照公式（3）計(jì)算Lee’s指數(shù);小鼠進(jìn)行口服糖耐量測(cè)試后，摘眼球采血，按操作標(biāo)準(zhǔn)處死小鼠進(jìn)行解剖，摘取肝臟、心臟、脾臟、腎臟及肺臟，用濾紙吸去臟器表面組織液，稱(chēng)各臟器濕重（mg），按公式（4）計(jì)算臟器指數(shù);取睪丸和雙腎周?chē)?，稱(chēng)量其濕重（mg），按公式（5）計(jì)算脂體比。

1. 3. 3 血清指標(biāo)檢測(cè) 小鼠摘眼球采血，37 ℃水浴30 min，3000 r/min離心15 min，獲得血清用于血清指標(biāo)檢測(cè)。使用全自動(dòng)生物分析儀檢測(cè)血清中的TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。

1. 4 肝臟組織切片

1. 4. 1 肝臟組織切片及H-E染色 處死小鼠后，取肝臟組織在10%多聚甲醛中浸泡固定，對(duì)固定1周后的組織進(jìn)行修塊、流水浸泡過(guò)夜，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制作5 μm的石蠟切片。將石蠟切片放入二甲苯中進(jìn)行脫蠟，放入梯度乙醇中復(fù)水后進(jìn)行H-E染色，再次梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來(lái)。滴加中性樹(shù)脂，蓋玻片封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織的病理變化。

1. 4. 2 油紅染料切片 油紅O染色切片（8 μm）室溫下放置10 min后用于染色。油紅O貯備液與稀釋液按5∶2進(jìn)行混合，定性濾紙過(guò)濾后即配成應(yīng)用液。應(yīng)用液染色13 min 后以37 ℃蒸餾水沖洗約30 s，隨后滴加復(fù)染液染色3 min，用流水沖洗1 min。滴加甘油明膠封片（在封片前應(yīng)先將水性封固劑于60 ℃溫水中加熱至液狀），光學(xué)顯微鏡下觀察組織脂滴的分布情況。

1. 5 葡萄糖耐量試驗(yàn)

試驗(yàn)前小鼠禁食過(guò)夜，按2 g/kg的劑量腹腔注射50%葡萄糖生理鹽水，分別于注射后30、60和90 min使用血糖測(cè)定儀測(cè)定小鼠外周血中的血糖含量（Glucose，mmol/L），并根據(jù)公式（6）計(jì)算糖耐量試驗(yàn)曲線下面積（Area under the curve，AUC），其中G（t）表示t時(shí)間點(diǎn)的血糖含量。

1. 6 脾臟淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

取小鼠新鮮脾臟組織置于不銹鋼網(wǎng)上，加入適量PBS（pH 7.4），注射器柱柄研磨，制備脾臟單細(xì)胞懸液。1500 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，4 ℃孵育15 min。離心棄上清液，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞。每個(gè)樣本取100 μL單細(xì)胞懸液加入至上樣管中，按試劑說(shuō)明加入熒光標(biāo)記抗體CD45、CD3、CD4和CD8，混勻，室溫避光孵育20 min。PBS洗滌1次，加入固定劑，4 ℃孵育過(guò)夜。加入破膜劑，室溫孵育60 min，加入Foxp3單抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次后以200 μL PBS重懸細(xì)胞，流式上機(jī)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞亞群含量。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Flowjo V.0.7分析流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，然后以Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，其中，多組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），兩兩比較則采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 小鼠肥胖模型建立

采用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型，飼喂35 d后模型組小鼠體重與空白對(duì)照組小鼠間存在顯著差異（P<0.05，下同），表明小鼠肥胖模型建立成功，小鼠隨機(jī)分組后每日進(jìn)行灌胃給藥。在整個(gè)給藥周期內(nèi)，不同檸檬酵素劑量組小鼠體重雖逐漸增加，但上升趨勢(shì)明顯低于肥胖模型組小鼠（圖1）。至灌胃給藥結(jié)束時(shí)，檸檬酵素中劑量組小鼠體重顯著低于肥胖模型組小鼠，檸檬酵素高劑量組小鼠體重則極顯著低于肥胖模型組小鼠（P<0.01，下同），表明檸檬酵素在一定劑量使用范圍內(nèi)可有效控制肥胖小鼠的體重變化。

各處理組小鼠的攝食量變化趨勢(shì)如圖2所示。整個(gè)給藥期間，各處理組小鼠每日攝食量差異并不顯著（P>0.05，下同），空白對(duì)照組小鼠的攝食量略低于肥胖模型組及各藥物組小鼠，藥物組小鼠的攝食量有所波動(dòng)，略低于肥胖模型組小鼠，但無(wú)顯著差異。小鼠攝食量未受其體重變化趨勢(shì)的影響，間接表明檸檬酵素可能是通過(guò)改變小鼠食物利用率來(lái)調(diào)控肥胖小鼠體重變化。

2. 2 檸檬酵素對(duì)小鼠Lee’s指數(shù)和脂肪含量的影響

Lee’s指數(shù)是評(píng)價(jià)小鼠肥胖程度的有效指標(biāo)。由圖3可看出，檸檬酵素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠Lee’s指數(shù)較肥胖模型組小鼠均有不同程度的下降趨勢(shì)，表明檸檬酵素可有效改善小鼠的肥胖程度。取小鼠腎周?chē)竞筒G丸周?chē)荆Q(chēng)重并計(jì)算脂體比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肥胖模型組相比，檸檬酵素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的脂肪含量明顯降低，且表現(xiàn)為檸檬酵素濃度越高，脂體比下降程度越明顯。檸檬酵素高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的脂體比仍高于空白對(duì)照組小鼠，推測(cè)是由于給藥周期較短，未能完全逆轉(zhuǎn)造模前期堆積的脂肪含量，導(dǎo)致小鼠的脂體比較空白對(duì)照組仍具有一定差異。

2. 3 檸檬酵素對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)可用于反映動(dòng)物內(nèi)部器官的健康狀態(tài)。由表1可知，與空白對(duì)照組小鼠相比，肥胖模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著增加，說(shuō)明高脂飼料導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪堆積、增生和肥大等問(wèn)題（黃玉軍等，2020）。但灌胃檸檬酵素后，小鼠的肝臟指數(shù)明顯下降，其中檸檬酵素高劑量組與肥胖模型組相比存在極顯著差異;除肝臟外，脾臟、心臟和腎臟的臟器指數(shù)均無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，以檸檬酵素干預(yù)有利于肥胖小鼠肝臟內(nèi)部脂肪代謝功能的恢復(fù)，減輕小鼠肝臟脂肪堆積情況，且未對(duì)其他器官造成明顯損傷。

2. 4 檸檬酵素對(duì)小鼠血脂水平的影響

對(duì)各處理組小鼠的血脂指標(biāo)（TC、TG、HDL-C和LDL-C）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示，肥胖模型組小鼠的TC、TG和LDL-C水平較空白對(duì)照組小鼠呈極顯著升高趨勢(shì)，而HDL-C水平呈極顯著下降趨勢(shì)。灌胃檸檬酵素后，小鼠血清中的TC、TG和LDL-C水平較肥胖模型組小鼠呈不同程度的下降趨勢(shì)，其中TC水平呈極顯著降低;HDL-C水平則極顯著升高，接近于空白對(duì)照組小鼠的水平，表明檸檬酵素可有效改善肥胖小鼠中的血脂異常狀態(tài)。

2. 5 檸檬酵素對(duì)小鼠肝臟組織的影響

采用油紅O染料對(duì)小鼠肝臟組織切片進(jìn)行染色，結(jié)果（圖5）顯示，肥胖模型組小鼠肝臟組織中表現(xiàn)為紅色脂滴區(qū)域較多，而檸檬酵素給藥組和陽(yáng)性對(duì)照組中的紅色脂滴聚集區(qū)域明顯減少，與空白對(duì)照組的相似，表明檸檬酵素可改善肥胖小鼠肝臟中脂滴聚積的情況。H-E染色進(jìn)一步觀察各處理組小鼠肝組織病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬酵素介入后小鼠肝臟中的脂肪空泡區(qū)域明顯減少，小鼠肝臟脂肪化現(xiàn)象得到明顯改善，即檸檬酵素可改善肥胖小鼠的肝組織病理學(xué)變化。

2. 6 檸檬酵素對(duì)小鼠葡萄糖耐量的影響

葡萄糖耐量主要反映人體或動(dòng)物自身對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，正常狀態(tài)下機(jī)體的血糖應(yīng)保持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，具有一定的耐受能力。由圖6-A可知，肥胖模型組及各給藥處理組小鼠的血糖—時(shí)間曲線均在空白對(duì)照組小鼠之上;由圖6-B可知，肥胖模型組小鼠的血糖AUC明顯高于空白對(duì)照組及其他給藥組小鼠。經(jīng)不同劑量的檸檬酵素干預(yù)后，小鼠血糖AUC較肥胖模型組小鼠血糖AUC分別降低9.50%、8.71%和21.67%，其中檸檬酵素高劑量組小鼠血糖AUC極顯著低于肥胖模型組小鼠。

2. 7 檸檬酵素對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的影響

免疫細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞及各種吞噬細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞是發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞又可分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD4）、抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD8）及其他細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg，CD4Foxp3）等。其中，CD4/CD8比值能反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，是衡量機(jī)體免疫水平的重要指標(biāo)。正常情況下，機(jī)體的CD4/CD8比值相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)其比值低于正常范圍時(shí)表明機(jī)體處于低免疫力狀態(tài)。本研究結(jié)果（表2和圖7）表明，肥胖模型組小鼠的CD4/CD8比值較空白對(duì)照組小鼠明顯降低，即小鼠免疫力下降，但經(jīng)檸檬酵素介入治療后能顯著促進(jìn)CD4比例升高，同時(shí)降低CD8比例，且具有一定的劑量依賴(lài)性，在高劑量檸檬酵素作用下CD4/CD8比值由肥胖模型組小鼠的1.49±0.11上升至3.20±0.42，表明檸檬酵素可促進(jìn)免疫功能的正向調(diào)節(jié)。此外，CD4Foxp3具有免疫抑制功能，肥胖小鼠的CD4Foxp3在檸檬酵素介入后顯著降低，表明其負(fù)調(diào)節(jié)功能減弱，免疫狀態(tài)增強(qiáng)。綜上所述，檸檬酵素可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞亞群中的CD4/CD8比值及CD4Foxp3比例，以改善肥胖小鼠機(jī)體的免疫狀態(tài)。

3 討論

奧利司他具有選擇性抑制胃脂肪酶和胰脂肪酶的能力，因其在減肥方面具有積極作用，于1999年獲批在歐美國(guó)家上市（Ahn et al.，2014）。但近年來(lái)的研究表明，長(zhǎng)期服用奧利司他可能會(huì)導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如肝腎損害、胃腸不良反應(yīng)及營(yíng)養(yǎng)不良等（黃秋菊和李玉蘭，2018）。因此，開(kāi)發(fā)一種新型安全無(wú)害的減肥產(chǎn)品仍是目前研究的主要方向。酵素主要來(lái)源于果蔬和中藥等，經(jīng)乳酸菌、酵母菌等益生菌發(fā)酵，是一種富含益生菌、活性酶及功效成分的混合物產(chǎn)品（Okada et al.，2006）。檸檬是一種營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值均較高的水果，長(zhǎng)期食用能預(yù)防心血管硬化及降血脂等（劉義武和王碧，2012），尤其是類(lèi)黃酮中的橙皮苷和圣草枸櫞苷具有較強(qiáng)的降低血脂作用（Miyake et al.，2006），一些水溶性膳食纖維也具有降血脂的功能（劉江，2020）。檸檬酵素在保留檸檬主要有效成分的基礎(chǔ)上，增加了維生素、礦物質(zhì)、多酚和黃酮等次級(jí)代謝產(chǎn)物，可能具備更理想的降脂減肥功效。為此，本研究通過(guò)高脂飲食建立小鼠肥胖模型，但經(jīng)檸檬酵素處理后可有效降低肥胖小鼠的體重、Lee’s指數(shù)和脂體比，其中以檸檬酵素高劑量組的效果最佳，部分指標(biāo)與陽(yáng)性對(duì)照組（奧利司他）一致。肝臟組織的H-E染色和油紅O染色結(jié)果也證實(shí)，檸檬酵素可降低脂質(zhì)成分在肥胖小鼠肝臟中的堆積，改善脂肪細(xì)胞形態(tài)，防止肥胖導(dǎo)致的肝組織病理學(xué)變化，修復(fù)肝臟受損情況。葡萄糖耐量檢測(cè)結(jié)果顯示，肥胖模型組小鼠的血糖穩(wěn)態(tài)受損嚴(yán)重，灌胃檸檬酵素和奧利司他后小鼠各時(shí)間點(diǎn)的血糖含量顯著降低，即肥胖小鼠的葡萄糖耐受能力得到明顯改善。此外，檸檬酵素并未對(duì)肥胖小鼠的攝食量造成顯著影響，推測(cè)檸檬酵素主要通過(guò)調(diào)整小鼠的食物利用率控制其體重。綜上所述，檸檬酵素能降低脂肪在肝臟、腎周及附睪部位的沉積，影響脂質(zhì)在體內(nèi)的代謝以達(dá)到減肥的目的。

在長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)肥胖過(guò)程中，通常伴隨著慢性炎癥的出現(xiàn)，最終影響機(jī)體的免疫功能（Xin et al.，2000）。肥胖對(duì)免疫功能的影響主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）影響淋巴循環(huán)和樹(shù)突細(xì)胞的遷移（Weitman et al.，2013）;（2）引起T淋巴細(xì)胞表面受體種類(lèi)的下調(diào)，限制T細(xì)胞識(shí)別致病性抗原類(lèi)型（van der Weerd et al.，2012）;（3）促使T淋巴細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，使其免疫監(jiān)視作用下降（Weitman et al.，2013）。脾臟是機(jī)體發(fā)揮免疫功能的重要器官，其免疫細(xì)胞比例的變化能反映免疫功能狀態(tài)，除臨床中常用指標(biāo)CD4和CD8外，CD4Foxp3在免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)抑制作用也得到證實(shí)，成為表征免疫狀態(tài)的另一主要指標(biāo)（Weaver and Hatton，2009）。檸檬中的芳香類(lèi)物質(zhì)、類(lèi)黃酮和檸檬酸等多種成分均有可能對(duì)機(jī)體免疫能力造成一定影響（Tripoli et al.，2007）。本研究在考察T細(xì)胞各亞群比例的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)CD4Foxp3比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在連續(xù)經(jīng)口灌胃檸檬酵素40 d后肥胖小鼠中的CD4水平顯著上調(diào)，表明肥胖導(dǎo)致的慢性炎癥刺激已得到改善。CD4Foxp3是一類(lèi)具有顯著抑制作用的T細(xì)胞亞群，能通過(guò)細(xì)胞間接觸、分泌抑制性細(xì)胞因子及下調(diào)APC細(xì)胞的功能，抑制其他細(xì)胞的免疫應(yīng)答（Ferreira et al.，2019）。已有研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪組織中的CD4Foxp3比例較正常小鼠明顯偏低，導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪組織感染炎癥的概率增加及胰島素敏感性降低等。本研究結(jié)果表明，脾臟組織CD4Foxp3比例在肥胖小鼠中的比例明顯上調(diào)，究其原因可能是不同組織器官中CD4Foxp3負(fù)責(zé)功能不同所致，即CD4Foxp3通過(guò)發(fā)揮免疫抑制功能，而調(diào)節(jié)局部自身免疫和炎癥反應(yīng);在外周循環(huán)中CD4Foxp3比例升高則會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降。

4 結(jié)論

檸檬酵素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)肥胖小鼠具有較強(qiáng)的減肥效果，還能改善肥胖小鼠免疫狀態(tài)較差的現(xiàn)象，因此檸檬酵素可作為減肥保健食品在慢性疾病輔助治療中推廣應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）