陳濤林　陳美麗　葛智文　廖寅平　楊雪梅　王熙富　曾宏亮　李明丹　張征　羅軍武

摘要：【目的】評(píng)價(jià)茶組植物新資源元寶山茶（Camellia yungkiangensis var. Yuanbaoshanica）的飲用安全性，為該資源的高效開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳栽獙毶讲栀Y源的鮮葉固定樣和紅茶工藝樣為材料，參照食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)程序，通過(guò)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)和慢性喂養(yǎng)（30 d）亞急性毒性試驗(yàn)對(duì)其毒理學(xué)安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)?！窘Y(jié)果】元寶山茶具有較高的茶多酚、可溶性糖及可可堿含量，但咖啡堿和游離氨基酸含量相對(duì)較低。元寶山茶鮮葉固定樣提取物對(duì)ICR小鼠的半數(shù)致死劑量（LD₅₀）為5.123 g/kg，其紅茶工藝樣提取物對(duì)小鼠的LD₅₀為7.573 g/kg;元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）各劑量組在添加S₉與不加S₉時(shí)均未導(dǎo)致測(cè)試菌株（TA97a、TA98、TA100和TA102）出現(xiàn)致突變作用，即Ames試驗(yàn)結(jié)果呈陰性;在5.00 g/kg劑量（相當(dāng)于人體推薦食用量的144倍）條件下，元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，表明小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。按0.87、1.74和3.47 g/kg的劑量經(jīng)口灌胃紅茶工藝樣提取物給SD大鼠30 d，試驗(yàn)期間各劑量組大鼠的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、攝水、糞便、尿液及各腔道分泌物等均未見(jiàn)異常，也無(wú)大鼠死亡;其體重增重、攝食量、食物利用率、血液指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、臟器濕重及臟/體比值等除個(gè)別指標(biāo)與陰性對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）外，絕大部分指標(biāo)均無(wú)明顯的劑量—反應(yīng)關(guān)系，且均在正常范圍內(nèi)波動(dòng);剖檢觀察及組織病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)元寶山茶對(duì)大鼠產(chǎn)生明顯毒性意義的病理變化?！窘Y(jié)論】元寶山茶屬于典型的高茶多酚、高可溶性糖、高可可堿及低咖啡堿的特異性資源，且具有很高的飲用安全性，按食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)屬于無(wú)毒級(jí)食品，作為代茶飲料植物具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 元寶山茶;茶組植物;毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià);茶多酚;半數(shù)致死劑量（LD₅₀）

中圖分類(lèi)號(hào)： S571.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0299-15

Toxicological safety evaluation of the new resource in Sect. Thea plant—Camellia yungkiangensis var. Yuanbaoshanica

CHEN Tao-lin CHEN Mei-li GE Zhi-wen LIAO Yin-ping YANG Xue-mei WANG Xi-fu ZENG Hong-liang LI Ming-dan ZHANG Zheng LUO Jun-wu

（¹Tea College， Guizhou University， Guiyang? 550025， China;²Key Laboratory of Ministry of Tea Science Education， Hunan Agricultural University， Changsha? 410128， China;³Greening Construction Development Center of Liuzhou， Liuzhou， Guangxi? 545001， China;⁴Agricultural Technology Extension Center of Liuzhou， Liuzhou， Guangxi? 545003， China;⁵Agricultural and Rural Bureau of Rongshui County， Liuzhou， Guangxi? 545300， China;⁶Forestry Research Institute of Liuzhou， Liuzhou， Guangxi 545300， China;⁷Institute of Chinese Medicine， Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha? 410006;⁸Hunan Drug Safety Evaluation Research Center/Key Laboratory of Hunan Province

for Efficacy and Safety Evaluation of New Drugs， Liuyang， Hunan? 410331， China）

Abstract：【Objective】To evaluate the drinking safety of the new resource—Camellia yungkiangensis var. Yuanbaoshanica in Sect. Thea plant， so as to provide scientific basis for the efficient development and utilization of the resource. 【Method】The fresh leaf fixed samples and black tea samples of the resource were used as materials， and the food toxicological safety evaluation program was taken as referenced to evaluate the toxicological safety of the resource through oral acute toxicity test， mouse bone marrow cell micronucleus test， Ames test and 30-day chronic feeding subacute toxicity test. 【Result】The results showed that C. yungkiangensis var. Yuanbaoshanica had high content of tea polyphenols， soluble sugar and theobromine， but relatively low content of caffeine and free amino acids. The median lethal dose （LD₅₀） of the fresh leaf fixed sample extract of C. yungkiangensis var. Yuanbaoshanica to ICR mice was 5.123 g/kg. While the LD₅₀of its black tea sample extract to mice was 7.573 g/kg. The addition of S₉and no S₉in each dose group of C. yungkiangensis var. Yuanbaoshanica （black tea sample extract） did not cause mutagenic effects on the test strain， indicating that the Ames test result was negative. And at a dose of 5.00 g/kg （equivalent to 144 times the recommended dosage of the human body）， C. yungkiangensis var. Yuanbaoshanica （black tea sample extract） had no obvious toxic effect on mouse bone marrow cells， indicating that the results of the mouse bone marrow cell micronucleus test were negative. SD rats were given the tested samples （black tea sample extract） at doses of 0.87， 1.74 and 3.47 g/kg for 30 days through oral gavage. During the experiment， no abnormalities had been found in the mental state， behavioral activity， water intake， feces， urine and secretions of each cavity in each dose group， and no rats died. And the weight gain， food intake， food utilization， hematology index， blood biochemical indicators， wet weight of organs， organ-body ratio， etc. of the rats in each dose group were significantly different （P<0.05） or extremely significantly different （P<0.01） from that of the negative control group， but most of the indicators had no significant dose response relationship， and the values fluctuated within the normal range. Moreover， no pathological changes with significant toxic effects on rats were found through gross anatomical observation and histopathological examination.【Conclusion】C. yungkiangensis var. Yuanbaoshanica is a typical and specific resource with high content of tea polyphenols， soluble sugar， theobromine and low content of caffeine， with high drinking safety. According to the food toxicological safety evaluation standards， it belongs to the non-toxic food， with a prospect as a substitute tea beverage plant.

Key words：Camellia yungkiangensis var. Yuanbaoshanica; Sect. Thea plant; toxicological safety evaluation; tea polyphenols; median lethal dose （LD₅₀）

Foundation items： Science and Technology Project of Guizhou Province（QKHZC〔2021〕General 188）; Science and Technology Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region（Guikegong 1598006-5-3）; Talent Introduction Project of Guizhou University （GDRJHZ〔2019〕No.25）; Hunan Provincial Postgraduate Research Innovation Project（CX2016 B284）

0 引言

【研究意義】食品毒理學(xué)安全性不僅是評(píng)價(jià)食品安全性的重要指標(biāo)，還是認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)食品新資源的前提和基礎(chǔ)（李寧，2007）。元寶山茶（Camellia yungkiangensis H. T. Chang var. Yuanbaoshanica Z. W. Ge，Y. P. Liao et T. L. Chen）是分布在廣西融水縣境內(nèi)元寶山海拔1000 m以上區(qū)域的一種野生茶資源，被當(dāng)?shù)乩习傩辗Q(chēng)為原生茶，其葉片光澤性強(qiáng)，芽葉茸毛較多，在葉片大小、葉形、葉色及育芽力等方面均明顯區(qū)別于當(dāng)?shù)氐钠渌铇?shù)（C. sinensis）資源類(lèi)型，經(jīng)鑒定屬于榕江茶（C. yungkiangensis H. T. Chang）的變種，是茶組植物的又一新資源（陳濤林，2019）。長(zhǎng)期以來(lái)，當(dāng)?shù)乩习傩蘸推髽I(yè)都習(xí)慣將元寶山茶制作成烘青類(lèi)綠茶飲用，其成品茶湯色澤淺綠明亮，有清花香且香氣持久，滋味鮮爽、醇厚、回甘明顯。元寶山茶在品種選育及茶葉深加工等方面具有極高的開(kāi)發(fā)潛力和利用價(jià)值，但至今未見(jiàn)關(guān)于其毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道，嚴(yán)重制約著該資源的開(kāi)發(fā)利用。因此，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)元寶山茶的毒理學(xué)安全性，對(duì)其高效開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多有關(guān)代茶植物毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道，包括沙棘Hippophae rhamnoides L.（胡頹子科Elaeagnaceae）（張小民等，2001）、顯齒蛇葡萄（又名藤茶）Ampelopsis grossedentata （Hand.-Mazz.） W. T. Wang（葡萄科Vitaceae）（周月嬋等，2001）、羅布麻Apocynum venetum L.（夾竹桃科Apocynaceae）（虞穎映和王海明，2006）、肋果茶Sladenia celastrifolia Kurz（肋果茶科Sladeniaceae）（楊衛(wèi)等，2010）、苦茶槭Acer ginnala Maxim. subsp. theiferum （Fang） Fang（槭樹(shù)科Aceraceae）（王海燕等，2011）、肉蓯蓉Herba Cistanche（列當(dāng)科Orobanchaceae肉蓯蓉屬Cistanche）（彭亮等，2011）、杜仲Eucommia ulmoides Oliver（杜仲科Eucommiaceae）（蔡鐵全等，2016）、黃背勾兒茶（又名甜茶）Berchemia flavescens （Wall.） Brongn.（鼠李科Rhamnaceae）（歐春麗等，2017）等。山茶屬（Camellia）植物中用作食品原料的物種相對(duì)較多，最常見(jiàn)的有油茶[C. oleifera Abel.]、茶[C. sinensis （L.） O. Kuntze]及其變種等（王治會(huì)等，2020;王春波等，2021），其毒理安全性研究主要集中在以茶為原料加工的各類(lèi)茶葉產(chǎn)品上，且以黑茶類(lèi)產(chǎn)品最多（鄭子新等，2005;肖文軍等，2007;吳文亮等，2017）;也有少量關(guān)于油茶的安全性毒性研究（賈玉巧等，2005;龍正海等，2007）。除此之外，未見(jiàn)其他山茶屬物種食用安全性毒理研究的相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】同一原料按不同加工工藝制成的不同茶葉產(chǎn)品，因所含成分發(fā)生不同轉(zhuǎn)變，其毒理學(xué)安全性也有可能發(fā)生改變，但至今未見(jiàn)針對(duì)元寶山茶毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以元寶山茶資源的鮮葉固定樣和紅茶工藝樣為材料，參照食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)程序，通過(guò)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)和慢性喂養(yǎng)（30 d）亞急性毒性試驗(yàn)等對(duì)其毒理學(xué)安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為該資源的高效開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

選取元寶山茶的鮮葉固定樣和紅茶工藝樣為受試材料。采集無(wú)病蟲(chóng)害的標(biāo)準(zhǔn)一芽二葉嫩梢，紅茶工藝樣按鮮葉→萎凋→揉捻→發(fā)酵→初烘→攤涼→復(fù)烘→攤涼的工藝進(jìn)行加工;鮮葉固定樣采用蒸青固樣法進(jìn)行固樣，具體操作方法：將采集的新鮮嫩葉置于煮沸的蒸鍋上，利用蒸汽進(jìn)行快速殺青，以葉色變暗、嫩莖折而不斷為宜，時(shí)間90～120 s;將殺青后的鮮葉攤涼至室溫后置于75 ℃烘箱中烘至足干，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取上述紅茶工藝樣6000 g和鮮葉固定樣500 g，以沸水按料液比1∶10（g/v）浸提3次，合并3次浸提的茶湯，真空濃縮后冷凍干燥，得到提取物干粉1786 g（紅茶工藝樣）和192 g（鮮葉固定樣），提取率分別為29.8%（紅茶工藝樣）和38.4%（鮮葉固定樣）。SPF級(jí)ICR小鼠和SD大鼠均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002;飼養(yǎng)于湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心）SPF級(jí)屏障環(huán)境中，光照周期為12 h明暗交替，室溫20.0～26.0 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。鼠飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2014-0010;飲水由純水儀（BIOPURE300型中央供水系統(tǒng)）制備。

1. 2 供試樣品常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定

水分測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8304—2013《茶 水分測(cè)定》，水浸出物含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測(cè)定》，茶多酚含量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》，游離氨基酸總量測(cè)定參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》，黃酮類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定采用三氯化鋁比色法（馬陶陶等，2008;蔣睿等，2018），可溶性糖含量測(cè)定采用硫酸—蒽酮比色法（魏曉明等，2000;王治會(huì)等，2020）。生物堿含量測(cè)定采用HPLC法，色譜柱：ECOSIL C18 4.6×150 mm 5 μm C/N EC181546 S/N 4I7501-11;流動(dòng)相：A相為超純水，B相為N，N-二甲基甲酰胺∶甲醇∶冰醋酸=39.5∶2∶1.5（v/v/v）;檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm;柱溫：30.0 ℃;流速：1 mL/min;進(jìn)樣體積：10 μL;梯度洗脫程序如表1所示。

1. 3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)及動(dòng)物倫理保護(hù)

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）的小鼠急性毒性試驗(yàn)和30 d喂養(yǎng)檢驗(yàn)方法及保健食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)的目的和結(jié)果判定，采用半數(shù)致死量法進(jìn)行元寶山茶（鮮葉固定樣提取物和紅茶工藝樣提取物）的急性毒性試驗(yàn);并以受試樣品日推薦攝入量的100倍作為30 d喂養(yǎng)高劑量組的給樣劑量，綜合小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)最高劑量為5.00 g/kg。動(dòng)物毒性試驗(yàn)經(jīng)湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理（倫理）委員會(huì)審查、批準(zhǔn)后實(shí)施，完全按照國(guó)家相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利法規(guī)執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2015-0016

1. 4 試驗(yàn)分組及劑量設(shè)計(jì)

1. 4. 1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 選用檢疫合格的4～6周齡SPF級(jí)ICR小鼠60只，雌雄各半，禁食不禁水16 h后的體重范圍為17.6～22.3 g，平均體重19.8 g，按性別體重隨機(jī)分為6個(gè)劑量組，每組10只，雌雄各半，各劑量組小鼠分別按12.00、7.90、5.20、3.40、2.30和1.50 g/kg經(jīng)口灌胃元寶山茶（鮮葉固定樣提取物）。同時(shí)選取50只檢疫合格的4～6周齡SPF級(jí)ICR小鼠，按性別體重隨機(jī)分為5個(gè)劑量組，每組10只，雌雄各半，然后按12.00、10.00、8.00、6.00和4.00 g/kg的劑量分別經(jīng)口灌胃元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）。各劑量組均灌胃2次，間隔4 h。

1. 4. 2 Ames試驗(yàn) 采用平板摻入法，選用經(jīng)鑒定符合要求的組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97a、TA98、TA100和TA102菌株進(jìn)行試驗(yàn)，以多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的SD大鼠肝微粒體酶（S₉）作為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)劑量，分別為5000和1000 g/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性誘變劑對(duì)照。樣品配制時(shí)精確稱(chēng)取受試樣品（紅茶工藝樣提取物）1.25 g加DMSO（二甲基亞砜）定容至25.0 mL，其濃度為50 mg/mL，以此為原液;量取5.0 mL原液加DMSO定容至25.0 mL，配制成10 mg/mL的樣品液，高壓滅菌（0.105 MPa，20 min）后以無(wú)菌DMSO補(bǔ)足溶液量備用。試驗(yàn)時(shí)于頂層瓊脂培養(yǎng)基中依次加入0.1 mL受試樣品液、0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液和0.5 mL磷酸鹽緩沖液或S9混合液（代謝活化），混勻后迅速傾入底層瓊脂培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基使之分布均勻，水平放置待冷凝固化后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。

1. 4. 3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 采用間隔24 h的2次經(jīng)口灌胃法，選用檢疫合格的SPF級(jí)ICR小鼠30只（體重范圍24.6～29.2 g），按性別體重隨機(jī)分為3組，每組10只，雌雄各半。元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）劑量設(shè)為5.00 g/kg，相當(dāng)于人體推薦食用量的144倍，以純化水為陰性對(duì)照，40 mg/kg環(huán)磷酰胺為陽(yáng)性對(duì)照。每次灌胃前按劑量設(shè)計(jì)稱(chēng)取相應(yīng)紅茶工藝樣提取物，加純化水配制成0.25 g/mL的受試樣品液，并按20.0 mL/kg的劑量灌胃;環(huán)磷酰胺用生理鹽水配制成4 mg/mL，按10.0 mL/kg腹腔注射給樣。第2次給樣6 h后頸椎脫臼處死小鼠，快速采集兩側(cè)股骨，取骨髓液用大鼠血清稀釋后推片，甲醇固定5 min，姬姆薩染色液染色20 min，純水沖洗，自然干燥后采用雙盲法閱片。

1. 4. 4 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn) 選用檢疫合格的SPF級(jí)SD大鼠80只（體重范圍74.5～88.4 g），按性別體重隨機(jī)分為陰性對(duì)照組和紅茶工藝樣提取物低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。受試樣品低、中、高劑量分別設(shè)為0.87、1.74和3.47 g/kg，相當(dāng)于人體推薦食用量的25、50和100倍。根據(jù)體重變化，試驗(yàn)前稱(chēng)取相應(yīng)受試樣品加純化水配制成0.347 g/mL的受試樣品液（高劑量），按劑量倍數(shù)逐級(jí)稀釋配制成中劑量（0.174 g/mL）和低劑量（0.087 g/mL）受試樣品液，按10.0 mL/kg的劑量灌胃，陰性對(duì)照組灌胃等體積純化水，每天1次，連續(xù)灌胃30 d。

1. 5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1. 5. 1 小鼠急性毒性試驗(yàn) 給樣后4 h內(nèi)仔細(xì)觀察并記錄各劑量組小鼠是否出現(xiàn)毒性反應(yīng)、毒性反應(yīng)癥狀、癥狀出現(xiàn)時(shí)間及死亡情況等，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡情況及其體重變化。于給樣后第14 d頸椎脫臼處死存活的小鼠，進(jìn)行解剖觀察，肉眼檢查是否存在明顯病理變化;并以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)半數(shù)致死劑量（LD₅₀）。

1. 5. 2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 光學(xué)顯微鏡下，每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），微核發(fā)生率以含有微核的PCE千分率計(jì);統(tǒng)計(jì)含200個(gè)PCE視野內(nèi)的成熟紅細(xì)胞數(shù)（RBC），然后計(jì)算PCE/RBC比值。

1. 5. 3 Ames試驗(yàn) 每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行皿，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。若受試樣品的回變菌落數(shù)超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，且存在劑量—反應(yīng)關(guān)系，即判定該受試樣品誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)1次。

1. 5. 4 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)期間所有SD大鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，每天觀察并記錄大鼠的一般表現(xiàn)、行為活動(dòng)及生長(zhǎng)情況，每周稱(chēng)重1次，加食2次，記錄加食量、撒食量和剩余量，計(jì)算攝食量及食物利用率。喂養(yǎng)30 d后禁食不禁水16 h采血，禁食前和禁食后（采血前）稱(chēng)量大鼠體重;按5 mL/kg腹腔注射20%烏來(lái)糖（烏拉坦）麻醉后腹主動(dòng)脈采血，抗凝血采用BC-5000Vet獸用五分類(lèi)血液細(xì)胞分析儀測(cè)定血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞容積（HCT）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血小板（PLT）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）及WBC五分類(lèi);非抗凝血分離血清，以LABOSPECT003型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽紅素（TbiL）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、血糖（Glc）和總膽固醇（TC）。剪斷腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，解剖觀察并稱(chēng)取肝臟、腎臟、脾臟和睪丸的濕重，計(jì)算臟/體比值;取肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、結(jié)腸、卵巢及睪丸等臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)剖檢觀察結(jié)果及血液生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果等判斷是否需要對(duì)受試樣品中、低劑量組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。若無(wú)異常情況，僅對(duì)受試樣品高劑量組和陰性對(duì)照組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查;如果發(fā)現(xiàn)病變則需對(duì)中、低劑量組大鼠相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Levens Test檢驗(yàn)方差齊性，若無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），則以單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)單因素方差分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），運(yùn)用LSD-t或Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析;若方差不齊（P<0.05）則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿(mǎn)足方差齊性后，再以轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;若數(shù)據(jù)進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)方差齊性，則采用Tamhanes T2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 供試樣品的常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

為準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)和了解元寶山茶的化學(xué)成分及含量情況，本研究對(duì)2個(gè)供試樣品的常規(guī)化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，元寶山茶鮮葉固定樣的水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖、黃酮、可可堿、咖啡堿含量分別為（47.37±0.08）%、（31.33±0.44）%、（1.17±0.16）%、（10.96±0.59）%、（0.41±0.02）%、（2.84±0.12）%和（0.39±0.01）%，元寶山茶紅茶工藝樣的水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖、黃酮、可可堿、咖啡堿含量分別為（41.18±0.13）%、（22.08±0.52）%、（1.55±0.18）%、（6.30±0.39）%、（1.35±0.05）%、（3.98±0.20）%和（0.20±0.01）%?？傮w而言，元寶山茶含有較高的茶多酚、可溶性糖及可可堿，但咖啡堿和游離氨基酸含量相對(duì)較低。

2. 2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1 一般臨床觀察 鮮葉固定樣提取物：灌胃當(dāng)天4 h內(nèi)，12.00和7.90 g/kg劑量組小鼠均出現(xiàn)身體蜷縮、活動(dòng)減少及閉眼等臨床癥狀，5.20和3.40 g/kg劑量組有部分小鼠出現(xiàn)身體蜷縮、活動(dòng)減少及閉眼等臨床癥狀，2.30和1.50 g/kg劑量組小鼠行為未見(jiàn)異常;各劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡。灌胃次日，12.00和7.90 g/kg劑量組雌性和雄性小鼠全部死亡，5.20 g/kg劑量組有4只（1只雌性和3只雄性）小鼠死亡，3.40 g/kg劑量組有1只雄性小鼠死亡，2.30和1.50 g/kg劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡。剖檢死亡小鼠，肉眼觀察其胸腔內(nèi)未見(jiàn)積液，也未發(fā)現(xiàn)器官異?，F(xiàn)象。

紅茶工藝樣提取物：灌胃當(dāng)天4 h內(nèi)，12.00、10.00和8.00 g/kg劑量組小鼠出現(xiàn)身體蜷縮、活動(dòng)減少及閉眼等臨床癥狀，6.00 g/kg劑量組部分小鼠呈現(xiàn)身體蜷縮、活動(dòng)減少等現(xiàn)象，4.00 g/kg劑量組小鼠行為未見(jiàn)異常。灌胃次日，12.00 g/kg劑量組有9只（5只雌性和4只雄性）小鼠死亡，10.00 g/kg劑量組也有9只（4只雌性和5只雄性）小鼠死亡，8.00 g/kg劑量組有6只（3只雌性和3只雄性）小鼠死亡，6.00 g/kg劑量組有2只（1只雌性和1只雄性）小鼠死亡，4.00 g/kg劑量組雌性和雄性小鼠均無(wú)死亡;剖檢死亡小鼠，肉眼觀察其胸腔內(nèi)未見(jiàn)積液，也未發(fā)現(xiàn)器官異?，F(xiàn)象。

2. 2. 2 動(dòng)物體重 如表2所示，鮮葉固定樣提取物3.40、2.30和1.50 g/kg劑量組存活小鼠的體重變化均在正常范圍內(nèi)，紅茶工藝樣提取物4.00 g/kg劑量組存活小鼠的體重變化也在正常范圍內(nèi)。

2. 2. 3 剖檢觀察 最后1次觀察結(jié)束后，頸椎脫臼處死所有存活小鼠并進(jìn)行剖檢，肉眼觀察臟器的位置、大小、色澤、粘連、表面和切面質(zhì)地等，均未見(jiàn)積液或腫瘤等異常病變。

2. 2. 4 半數(shù)致死劑量（LD₅₀） 如表3所示，鮮葉固定樣提取物對(duì)小鼠的LD₅₀為5.123 g/kg，其中對(duì)雌性小鼠的LD₅₀為5.842 g/kg、對(duì)雄性小鼠的LD₅₀為4.555 g/kg;紅茶工藝樣提取物對(duì)小鼠的LD₅₀為7.573 g/kg，其中對(duì)雌性小鼠的LD₅₀為7.574 g/kg、對(duì)雄性小鼠的LD₅₀為7.570 g/kg。

2. 3 Ames試驗(yàn)結(jié)果

2. 3. 1 測(cè)試菌株遺傳特性鑒定 TA97a、TA98、TA100和TA102等4株測(cè)試菌株均具有組氨酸缺陷、脂多糖屏障缺陷（Rfa突變）及氨芐青霉素抗性（R因子），TA102菌株還攜帶有四環(huán)素抗性（PAQL因子），TA97a、TA98和TA100菌株則具有uvrB修復(fù)突變（紫外線敏感）。4株測(cè)試菌株的自發(fā)回變率均在正常范圍內(nèi)，表明其符合Ames試驗(yàn)要求。各菌株遺傳特性鑒定結(jié)果詳見(jiàn)表4。

2. 3. 2 Ames試驗(yàn) 如表5所示，受試樣品各劑量組對(duì)TA97a、TA98、TA100和TA102等4株測(cè)試菌株在非活化（?S₉）與活化（+S₉）條件下的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也不存在劑量—反應(yīng)關(guān)系;2次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果均一致。可見(jiàn)，元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）各劑量組在添加S₉與不加S₉時(shí)均未出現(xiàn)致突變作用，Ames試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

2. 4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，受試樣品組小鼠骨髓細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組間存在極顯著差異（P<0.01，下同）;受試樣品組小鼠的PCE/RBC比值未低于陰性對(duì)照組的20%，表明在5.00 g/kg劑量（相當(dāng)于人體推薦食用量的144倍）條件下，元寶山茶（紅茶工藝樣提取物）對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。

2. 5 30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2. 5. 1 一般臨床觀察 試驗(yàn)期間，各處理組SD大鼠的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、攝水、糞便、尿液及各腔道分泌物等均未見(jiàn)異常，也無(wú)大鼠死亡。

2. 5. 2 對(duì)大鼠體重及食物利用率的影響 如表7所示，受試樣品各劑量組雌性大鼠各稱(chēng)重時(shí)間點(diǎn)的體重與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異;低、中劑量組雄性大鼠各稱(chēng)重時(shí)間點(diǎn)的體重與陰性對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異，但高劑量組雄性大鼠在第14 d后其體重極顯著或顯著（P<0.05，下同）低于陰性對(duì)照組。

由圖1可看出，除第1周中、高劑量組雌性大鼠攝食量呈極顯著下降趨勢(shì)，第3周高劑量組雌性大鼠攝食量顯著升高外，其他時(shí)間點(diǎn)的攝食量與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異，且各劑量組雌性大鼠的體重增重和食物利用率與陰性對(duì)照組間也無(wú)顯著差異;對(duì)于雄性大鼠而言，第2周高劑量組的攝食量和體重增重極顯著低于陰性對(duì)照組、食物利用率則顯著低于陰性對(duì)照組，第4周高劑量組的攝食量極顯著低于陰性對(duì)照組、體重增重和食物利用率則顯著低于陰性對(duì)照組。此外，雌性大鼠的總攝食量、體重總增重及總食物利用率與陰性對(duì)照組相比差異均不顯著;高劑量組雄性大鼠的總攝食量及體重總增重極顯著低于陰性對(duì)照組，而低、中劑量組雄性大鼠的總攝食量、體重總增重及總食物利用率與陰性對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異。

2. 5. 3 對(duì)大鼠血液指標(biāo)的影響 如表8所示，除低劑量組雌性大鼠的酸性粒細(xì)胞、中劑量組雌性大鼠的嗜堿性粒細(xì)胞及高劑量組雄性大鼠的紅細(xì)胞、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞壓積與陰性對(duì)照組相比差異顯著或極顯著外，其余各劑量組雌、雄性大鼠的各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)與陰性對(duì)照組間均無(wú)顯著差異。

2. 5. 4 對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 與陰性對(duì)照組相比，除高劑量組雌、雄性大鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著升高，高劑量組雌性大鼠的血清總蛋白含量顯著降低外，其余各劑量組雌、雄性大鼠的各項(xiàng)血清生化指標(biāo)均無(wú)顯著變化（表9）。

2. 5. 5 對(duì)大鼠臟器濕重及臟/體比值的影響 由表10可看出，除高劑量組雄性大鼠禁食后的體重、脾臟濕重及脾/體比值較陰性對(duì)照組極顯著降低，中劑量雄性大鼠禁食后的脾/體比值、高劑量組雄性大鼠禁食后的睪丸/體比值與陰性對(duì)照組間存在顯著差異外;其余各劑量組雌、雄性大鼠禁食后的臟器濕重及臟/體比值與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。

2. 5. 6 剖檢觀察及組織病理學(xué)檢查結(jié)果 剖檢各處理組的大鼠共80只，肉眼觀察大鼠胸腔和腹腔內(nèi)均無(wú)積液、異物及腫瘤，各臟器的解剖學(xué)位置正常，肝臟、脾臟、胃、十二指腸、結(jié)腸、腎臟、睪丸（卵巢）及唾液腺等主要臟器的顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、體積及質(zhì)地等均未見(jiàn)明顯的異常病變。組織病理學(xué)鏡檢發(fā)現(xiàn)：①肝臟：陰性對(duì)照組1F06、1M06和1M07號(hào)大鼠的肝細(xì)胞空泡變性（+），1M06和1M07號(hào)大鼠肝細(xì)胞小灶性壞死，伴有纖維細(xì)胞增生（+），其他大鼠肝臟均未見(jiàn)明顯病理變化;高劑量組4F04、4F10和4M10號(hào)大鼠的肝細(xì)胞空泡變性（+），4F08和4M02號(hào)大鼠肝細(xì)胞小灶性壞死，伴有纖維細(xì)胞增生（+），其他大鼠的肝細(xì)胞索排列有序，肝細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死，肝竇未見(jiàn)淤血等病理變化（圖2）。②腎臟：陰性對(duì)照組及高劑量組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，腎單位形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。③脾臟：陰性對(duì)照組及高劑量組大鼠脾臟的白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)淤血及纖維組織增生（圖4）。④胃：陰性對(duì)照組及高劑量組大鼠的胃黏膜完整，黏膜下層未見(jiàn)水腫、血管充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5）。⑤十二指腸：陰性對(duì)照組及高劑量組大鼠十二指腸黏膜完整，黏膜未見(jiàn)糜爛、潰瘍及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層未見(jiàn)水腫、血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖6）。⑦結(jié)腸：陰性對(duì)照組及高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞，間質(zhì)未見(jiàn)充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖7）。⑧卵巢：陰性對(duì)照組及高劑量組雌性大鼠卵巢各級(jí)卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，未見(jiàn)變性壞死，間質(zhì)未見(jiàn)出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8）。⑨睪丸：陰性對(duì)照組及高劑量組雄性大鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞排列清楚、形態(tài)正常，間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖9）。由此判定，以元寶山茶紅茶工藝樣提取物喂養(yǎng)SD大鼠30 d未見(jiàn)有明顯毒性意義的病理變化。

3 討論

本研究對(duì)元寶山茶（鮮葉固定樣和紅茶工藝樣）水提物的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，鮮葉固定樣提取物對(duì)小鼠的LD₅₀為5.123 g/kg，紅茶工藝樣提取物對(duì)小鼠的LD₅₀為7.573 g/kg。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）頒布的食品毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（付立杰，2001），2種水提物樣品的LD₅₀均大于5000 mg/kg，因此可判定元寶山茶鮮葉固定樣和紅茶工藝樣的水提物均為實(shí)際無(wú)毒。根據(jù)樣品水提物提取率換算可知，元寶山茶鮮葉固定樣和紅茶工藝樣干茶對(duì)小鼠的LD₅₀分別為13.341和25.413 g/kg，明顯高于以茶（C. sinensis）或其變種鮮葉為原料加工而成的烘青綠茶（LD₅₀為7.5 g/kg）（劉勤晉等，2003）、普洱茶（LD₅₀12.2 g/kg）（劉勤晉等，2003）及六堡茶（LD₅₀為9.38 g/kg）（吳文亮等，2017）等，說(shuō)明元寶山茶具有更高的飲用安全性;根據(jù)食品毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，與沙棘茶（張小民等，2001）、藤茶（周月嬋等，2001;陳玉瓊等，2005）、羅布麻茶（虞穎映和王海明，2006）、肉蓯蓉茶（彭亮等，2011）及杜仲茶（蔡鐵全等，2016）等代茶飲料植物均屬于實(shí)際無(wú)毒或無(wú)毒物。在小鼠急性經(jīng)口灌胃毒性試驗(yàn)中，高劑量的元寶山茶鮮葉固定樣提取物和紅茶工藝樣提取物均導(dǎo)致小鼠死亡，究其原因可能是元寶山茶含有較高濃度的茶多酚所引起。楊賢強(qiáng)等（1992）、宋小鴿等（1999）、陸益等（2005）、袁根良等（2015）先后研究報(bào)道了茶多酚的急性經(jīng)口毒性LD₅₀，分別為2496、2499、2640和2710 mg/kg。在本研究中，元寶山茶鮮葉固定樣提取物和紅茶工藝樣提取物在LD₅₀灌胃劑量下對(duì)應(yīng)的茶多酚劑量分別為4180和5611 mg/kg，已遠(yuǎn)高于茶多酚的LD₅₀，因此推斷小鼠死亡的原因與高劑量的茶多酚中毒有關(guān)。

此外，Ames試驗(yàn)和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。按0.87、1.74和3.47 g/kg的劑量經(jīng)口灌胃元寶山茶紅茶工藝樣提取物給大鼠30 d，試驗(yàn)期間各劑量組大鼠的體重增重、攝食量、食物利用率、血液指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、臟器濕重及臟/體比值等除個(gè)別指標(biāo)與陰性對(duì)照組相比差異顯著或極顯著外，絕大部分指標(biāo)均無(wú)明顯的劑量—反應(yīng)關(guān)系，且均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。剖檢觀察及組織病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)以元寶山茶紅茶工藝樣提取物灌胃30 d對(duì)大鼠產(chǎn)生明顯毒性意義的病理變化?？梢?jiàn)，元寶山茶鮮葉固定樣和紅茶工藝樣的水提物均無(wú)致突變作用，對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物的體細(xì)胞染色體也無(wú)損傷作用，且對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、造血功能和各臟器組織無(wú)明顯毒性，進(jìn)一步說(shuō)明元寶山茶具有較高的飲用安全性。但值得注意的是，任何食物達(dá)到一定劑量均有可能致死，本研究的30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)高劑量組的劑量已達(dá)人體日常推薦飲用量（7 g/d）的100倍，正常情況下也不可能達(dá)到該飲用劑量。因此，按照食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可判定元寶山茶屬于無(wú)毒級(jí)食品。

元寶山茶不僅具有高含量的茶多酚，還富含可溶性糖和可可堿，鮮葉固定樣的可溶性糖含量高達(dá)（10.96±0.59）%，紅茶工藝樣的可可堿含量高達(dá)（3.98±0.20）%，遠(yuǎn)高于常規(guī)茶樹(shù)品種資源。其中，可可堿含量遠(yuǎn)高于李金（2013）測(cè)定的25個(gè)茶樹(shù)品種的可可堿含量（0.04%～0.34%），但咖啡堿含量較常規(guī)茶樹(shù)品種資源低，遠(yuǎn)低于李金（2013）對(duì)25個(gè)茶樹(shù)品種的測(cè)定結(jié)果（2.74%～5.28%），也遠(yuǎn)低于李文萃等（2020）對(duì)以鳩坑種為原料加工綠茶的測(cè)定結(jié)果（2.6%～2.7%）及宋加艷等（2021）對(duì)碧香早鮮葉原料的測(cè)定結(jié)果（3.67%）。這也充分說(shuō)明元寶山茶屬于典型的高茶多酚、高可溶性糖、高可可堿及低咖啡堿的特異性資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

元寶山茶屬于典型的高茶多酚、高可溶性糖、高可可堿及低咖啡堿的特異性資源，且具有很高的飲用安全性，按食品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)屬于無(wú)毒級(jí)食品，作為代茶飲料植物具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）