劉俊仙　陽(yáng)太億　劉菁　張榮華　盧曼曼　雷敬超　高軼靜　丘立杭　李松　熊發(fā)前

劉俊仙（1982-），副研究員，廣西知識(shí)產(chǎn)權(quán)中青年專家和廣西標(biāo)準(zhǔn)化專家，廣西大學(xué)校外碩士生導(dǎo)師，主要從事甘蔗生物技術(shù)與分子生物學(xué)研究工作，近期專注甘蔗全基因組轉(zhuǎn)座子挖掘、開(kāi)發(fā)應(yīng)用及其功能研究。主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)、地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)，主持廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目1項(xiàng)、面上項(xiàng)目2項(xiàng)、青年科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)，獲廣西科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第四），連續(xù)兩次被評(píng)為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院有功人員，以第一發(fā)明人獲授權(quán)國(guó)家專利17項(xiàng)，以第一著作權(quán)人登記計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)15項(xiàng)，主要參與育成果蔗新品種桂果蔗1號(hào)，主要參與制定廣西地方標(biāo)準(zhǔn)5項(xiàng)，以第一作者、共同第一作者或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)文章近20篇，其中SCI文章4篇。

摘要：【目的】分析Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶基因（RT）序列特征、多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及轉(zhuǎn)錄活性，為深入研究果蔗Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)序列、轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性及生物學(xué)功能提供理論參考。【方法】以果蔗品種拔地拉為試材，根據(jù)Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物對(duì)，利用其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的條帶回收純化后連接至pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。依據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)RT基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】從果蔗拔地拉中擴(kuò)增獲得51條序列（SoRT4-1～SoRT4-51），去除重復(fù)序列和非RT基因序列后共獲得44條RT基因序列，長(zhǎng)度為423～433 bp，AT含量為56.84%～64.97%，AT∶GC比值為1.32～1.85，核苷酸序列間相似性為44.4%～99.3%，其編碼的氨基酸序列間相似性為10.8%～100.0%，說(shuō)明氨基酸序列比核苷酸序列表現(xiàn)出更高異質(zhì)性。44條RT基因序列被劃分為4個(gè)家族，其中Ⅰ和Ⅲ為主要家族。44條RT基因編碼的氨基酸序列中有20條發(fā)生了無(wú)義突變，說(shuō)明其突變率較高。44條RT基因編碼蛋白序列存在5種保守基序，其中，有29條序列同時(shí)包含Motif 1～Motif 4，其余15條序列的保守基序變異較大，說(shuō)明保守基序存在一定異質(zhì)性。4個(gè)家族代表性序列編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)在氫鍵和轉(zhuǎn)角的數(shù)量方面差異較大;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，44條RT基因序列被分為七大類，Ⅰ類和Ⅱ類中的果蔗RT基因序列分別占序列總數(shù)的40.91%和27.27%，Ⅱ類和Ⅵ類中的部分果蔗RT基因序列與擬南芥的BAB40828.1、粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1親緣關(guān)系較近，推測(cè)這些物種在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的橫向傳遞。初步發(fā)現(xiàn)1條Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（SoRT4-40）具有轉(zhuǎn)錄活性?！窘Y(jié)論】獲得44條果蔗Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列，其中僅有1條序列具有轉(zhuǎn)錄活性，這些RT基因序列可用于開(kāi)發(fā)基于Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甘蔗分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞： 果蔗;Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子;反轉(zhuǎn)錄酶;拔地拉;多樣性

中圖分類號(hào)： S566.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0287-12

Diversity analysis of Ty3-gypsy-like retrotransposonsRT gene sequences in fruit sugarcane

LIU Jun-xian YANG Tai-yi LIU Jing ZHANG Rong-hua LU Man-man LEI Jing-chao GAO Yi-jing QIU Li-hang LI Song XIONG Fa-qian

（1Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Nanning? 530007， China; 2Cash Crops Research Institute， Guangxi Academy of

Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】To analyze the characteristics， diversity， phylogenetic evolution and transcriptional activity of Ty3-gypsy-like retrotransposons in fruit sugarcane so as to provide a theoretical reference for the in-depth study of the full-length sequence， transcriptional transposition activity and biological function of Ty3-gypsy-like retrotransposons （RTs） in sugarcane. 【Method】Using the fruit sugarcane variety Badila as the test material， degenerate primers were designed corresponding to the conserved region of Ty3-gypsy-like RT for PCR amplification. The amplified targets were recovered， purified and ligated into pMD18-T vectors. After transformation into Escherichia coli competent cells DH5α， positive clones were picked for sequencing. Ty3-gypsy-like retrotransposon sequences were analyzed by bioinformatics. 【Result】Fifty-one sequences （SoRT4-1-SoRT4-51） were amplified from fruit sugarcane Badila. After removing repetitive sequences and non-RT sequences， a total of forty-four RT sequences were obtained， with lengths of 423-433 bp，an AT content of 56.84%-64.97%，and an AT∶GC ratio of 1.32-1.85. The similarity between the nucleotide sequences was 44.4%-99.3%，whereas the similarity between the encoded amino acid sequences was 10.8%-100.0%， indicating that the amino acid sequences showed higher heterogeneity than nucleotide sequences. The forty-four RT gene sequences were divided into four families，of which I and III were the main families. Nonsense mutations occurred in twenty of the forty-four RT genes， indicating a high mutation rate. There were five conserved motifs in the forty-four RT protein sequences， of which twenty-nine sequences contained motifs 1-4 while the conserved motifs of the remaining fifteen sequences varied greatly. The protein tertiary structures of representative RT gene sequences in four families differ in the number of hydrogen bonds and corner. A phylogenetic tree analysis showed that the forty-four RT gene sequences were divided into seven classes. The sugarcane RT gene sequences in class I and II accounted for 40.91% and 27.27% of the total sequences，respectively. Some su-garcane RT gene sequences in class II and VI were closely related to those of BAB40828.1 of Arabidopsis thaliana，BAB40824.1 of Japonica rice，BAB40833.1 of spinach and BAB40834.1 of soybean. It is speculated that the lateral transmission of Ty3-gypsy-like retrotransposons occurred in the evolution of these species. One Ty3-gypsy-like retrotransposon （SoRT4-40） was initially found to have transcriptional activity. 【Conclusion】Forty-four Ty3-gypsy-like retrotransposons RT gene sequences in fruit sugarcane were obtained， of which only one sequence had transcriptional activity. Molecular markers based on these Ty3-gypsy-like retrotransposons can be used in future analyses of sugarcane genetics.

Key words： fruit sugarcane; Ty3-gypsy-like retrotransposons; reverse transcriptase; badila; diversity

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31960416）; Guangxi Natural Science Foundation Program（2018GXNSFDA294004，2020GXNSFAA297081）;Guangxi Academy of Agricultural Sciences Fund Project （Guinongke 31960416）

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國(guó)重要的糖料作物、能源作物和經(jīng)濟(jì)作物。2000年以來(lái)，甘蔗種植面積和產(chǎn)糖量均占我國(guó)糖料作物總種植面積和食糖總量的90%以上，甘蔗產(chǎn)業(yè)對(duì)于保障國(guó)家蔗糖供給安全發(fā)揮舉足輕重的作用（劉俊仙等，2019）。但我國(guó)甘蔗生產(chǎn)品種存在單一化且長(zhǎng)期連作，導(dǎo)致種性退化嚴(yán)重等問(wèn)題，種性恢復(fù)最經(jīng)濟(jì)有效的辦法之一就是培育甘蔗優(yōu)良新品種，但傳統(tǒng)雜交育種手段選擇效率低下、選擇時(shí)間長(zhǎng)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于作物的新品種選育，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)定向選擇，從而提高育種效率，但限制甘蔗分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)展的主要因素之一是缺乏簡(jiǎn)單、實(shí)用、高效的DNA分子標(biāo)記。根據(jù)長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的高拷貝數(shù)和豐富DNA插入多態(tài)性，可開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單實(shí)用高效的分子標(biāo)記，對(duì)甘蔗分子標(biāo)記輔助育種具有重要的意義。【前人研究進(jìn)展】目前，ISSR（余愛(ài)麗等，2002）、RAPD（王英等，2009）、SRAP（廖詩(shī)童等，2012）、SCoT（Que et al.，2014）和AFLP（昝逢剛等，2015）分子標(biāo)記技術(shù)已在甘蔗上應(yīng)用，且均可檢測(cè)出DNA多態(tài)性。但這些技術(shù)均存在一些弊端，如RAPD分子標(biāo)記技術(shù)的重復(fù)性差;AFLP技術(shù)操作流程較繁瑣，且對(duì)科研人員及實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備上要求較高;ISSR、SRAP和SCoT技術(shù)雖然操作不復(fù)雜，但結(jié)果易受擴(kuò)增條件和環(huán)境的影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性和重復(fù)性不高。由于SSR分子標(biāo)記能揭示豐富的DNA多態(tài)性，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于甘蔗QTLs定位（Aljanabi et al.，2007）、遺傳圖譜構(gòu)建（劉新龍等，2010;Andru et al.，2011）和遺傳多樣性分析（劉新龍等，2015）。雖然已開(kāi)發(fā)出一定數(shù)量的甘蔗SSR分子標(biāo)記，但數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且擴(kuò)增效率較低。近年來(lái)主要通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或簡(jiǎn)化基因組測(cè)序?qū)Ω收酳SR標(biāo)記進(jìn)行規(guī)模化開(kāi)發(fā)（Huang et al.，2016），但對(duì)于基因組龐大（約10 Gb）且復(fù)雜的甘蔗而言，設(shè)計(jì)出總SSR及多態(tài)性SSR標(biāo)記引物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。另外，SSR分子標(biāo)記在甘蔗上擴(kuò)增特異性不強(qiáng)，擴(kuò)增條帶數(shù)較多，擴(kuò)增條帶模式復(fù)雜。LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有豐富的插入多態(tài)性、高拷貝等特性，根據(jù)這些特性已開(kāi)發(fā)建立了4種主要分子標(biāo)記技術(shù)，包括S-SAP、IRAP、REMAP和RBIP（Waugh et al.，1997;Kalendar et al.，1999;Flavell et al.，1998）。在其他物種上，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子已被廣泛研究，但在甘蔗上，鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。Rossi等（2001）以轉(zhuǎn)座元件、轉(zhuǎn)座酶、DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為搜索關(guān)鍵詞，搜索參數(shù)設(shè)置為期望值低于e-50，在甘蔗EST庫(kù)中進(jìn)行廣泛搜索，結(jié)果顯示，總共獲得了276個(gè)轉(zhuǎn)座元件，DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子分別有148和128個(gè)，分別占總數(shù)的54%和46%，Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子明顯少于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，既無(wú)LINE類和SINE類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，也無(wú)MITE轉(zhuǎn)座子。Raza等（2011）以栽培種甘蔗BL4為材料，一方面使用已知兼并引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另一方面根據(jù)與Activator（Ac）和Mutator（Mu）DNA轉(zhuǎn)座子同源的甘蔗表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列設(shè)計(jì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終從甘蔗BL4中分離出甘蔗Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及Ac和Mu類DNA轉(zhuǎn)座子;Zhang等（2016）利用多種手段從甘蔗屬96個(gè)細(xì)菌人工染色體（BAC）克隆鑒定出了各類轉(zhuǎn)座子。吳子鶯等（2020）通過(guò)簡(jiǎn)并PCR技術(shù)從甘蔗屬大莖野生種中擴(kuò)增分離出60條Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶基因（RT）序列。劉俊仙等（2021）首次從甘蔗品種新臺(tái)糖22中分離出36條Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)座子RT基因序列?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前未見(jiàn)對(duì)果蔗Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列多樣性分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆果蔗品種拔地拉的Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列，并分析其序列特征、多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及轉(zhuǎn)錄活性，不僅為研究RT基因的轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)座活性及調(diào)控功能提供原始序列，還為開(kāi)發(fā)果蔗基于Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

以目前我國(guó)種植面積最大的果蔗品種拔地拉為供試材料。主要試劑：rTaq酶和載體pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;其他生化試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：Biometra TOne PCR擴(kuò)增儀（Analytik Jena AG，德國(guó)）和核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 參考劉俊仙等（2019）的方法提取果蔗品種拔地拉的總DNA。

1. 2. 2 基因克隆 利用Kumekawa等（1999）設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物對(duì)Gyrt1和Gyrt2進(jìn)行RT基因擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參考劉俊仙等（2019）進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1.0 μL，5 U/μL rTaq酶0.2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃，4 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。取6 μLPCR產(chǎn)物加入4 μL上樣緩沖液并充分混合，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液為1×TAE）進(jìn)行檢測(cè)，凝膠用溴化乙錠（EB）染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。用無(wú)菌刀片迅速切下目的條帶并回收純化，將其連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，聯(lián)合使用氨芐青霉素、IPTG和X-gal進(jìn)行篩選，挑取在37 ℃下培養(yǎng)12～16 h后的單菌落接種至LB培養(yǎng)基（含50 mg/L 氨芐青霉素）中培養(yǎng)4～6 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序（熊發(fā)前等，2019）。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 利用BLAST對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用BioEdit對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，綜合使用DNAMAN、Jalview和Weblogo進(jìn)行序列多重比對(duì)及其Logo生成，利用Phyre2對(duì)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合使用RasMol和MEME計(jì)算蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角、氫鍵并預(yù)測(cè)其保守基序（陽(yáng)太億等，2019）。利用MEGA 6.0的鄰接法和No. of differences模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);通過(guò)與甘蔗EST庫(kù)比對(duì)鑒定Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 果蔗RT基因克隆結(jié)果

簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，從果蔗拔地拉中擴(kuò)增出一條約430 bp的目的條帶，經(jīng)過(guò)克隆、測(cè)序及序列分析，共獲得51條序列（SoRT4-1～SoRT4-51）。去除重復(fù)序列和非RT基因序列后，共獲得44條RT基因序列，長(zhǎng)度為423～433 bp。對(duì)44條RT基因序列采用多重比對(duì)分析并生成Logo，如圖2和圖3所示。

2. 2 果蔗RT基因序列的相似性分析結(jié)果

由表1可知，44條RT基因序列的長(zhǎng)度為423～433 bp，其中，SoRT4-1為423 bp，相較于其他序列，該序列表現(xiàn)為在第285～293 bp處缺失了9 bp，其次是SoRT4-20，該序列表現(xiàn)為在第238～242 bp處缺失了6 bp，但多數(shù)序列長(zhǎng)度為432 bp。A和T的數(shù)量分別為109～147個(gè)和110～156個(gè)，G和C的數(shù)量分別為80～110個(gè)和55～92個(gè)，AT含量為56.84%～64.97%，AT∶GC比值為1.32～1.85（表1）。44條RT基因的核苷酸序列相似性為44.4%～99.3%，其中，SoRT4-33與SoRT4-38間的相似性最低（44.4%），SoRT4-1與SoRT4-41、SoRT4-8與SoRT4-10間的相似性均最高（99.3%）。44條RT基因編碼的氨基酸序列間相似性為10.8%～100.0%。

2. 3 RT基因序列的聚類分析結(jié)果

44條RT基因序列被劃分為4個(gè)家族，家族Ⅰ包含14條序列，約占序列總數(shù)的31.82%，家族Ⅱ包含9條序列，約占序列總數(shù)的20.45%，家族Ⅲ包含14條序列，約占序列總數(shù)的31.82%，家族Ⅳ包含7條序列，約占序列總數(shù)的15.91%（圖4）。結(jié)合圖2推測(cè)不同程度的點(diǎn)突變和堿基替換引起家族間及家族內(nèi)的差異，最終導(dǎo)致果蔗品種Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有較高異質(zhì)性及多拷貝性。

2. 4 RT基因編碼的氨基酸序列分析結(jié)果

對(duì)44條RT基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)有20條序列存在1～14個(gè)無(wú)義突變。發(fā)生1個(gè)無(wú)義突變的分別是SoRT4-21（第137個(gè)aa）、SoRT4-23（第30個(gè)aa）和SoRT4-30（第116個(gè)aa）、SoRT4-47（第43個(gè)aa）;發(fā)生2個(gè)無(wú)義突變的分別是SoRT4-8（第65、129個(gè)aa）和SoRT4-10（第65、129個(gè)aa）;發(fā)生4個(gè)無(wú)義突變的是SoRT4-4（第23、56、131、133個(gè)aa）：發(fā)生5個(gè)無(wú)義突變的分別是SoRT4-33（第30、52、108、121、125個(gè)aa）和SoRT4-48（第70、87、95、99、107個(gè)aa）;發(fā)生6個(gè)無(wú)義突變的分別是SoRT4-26（第23、68、93、97、105、125個(gè)aa）、SoRT4-42（第71、88、96、100、108、125個(gè)aa）、SoRT4-44（第23、68、93、97、105、125個(gè)aa）和SoRT4-50（第23、92、93、97、105、125個(gè)aa）;發(fā)生7個(gè)無(wú)義突變的是SoRT4-29（第107、108、109、117、121、128、135個(gè)aa）;發(fā)生8個(gè)無(wú)義突變的分別是SoRT4-4（第77、87、88、101、108、121、123、128個(gè)aa）、SoRT4-34（第23、54、92、93、97、105、125、140個(gè)aa）和SoRT4-38（第23、44、68、93、97、105、125、140個(gè)aa）;發(fā)生10個(gè)無(wú)義突變的是SoRT4-20（第88、95、96、103、104、117、127、130、134、137個(gè)aa）;發(fā)生無(wú)義突變最多的是SoRT4-5和SoRT4-28，均達(dá)到了14個(gè)，SoRT4-5突變位點(diǎn)分別是在第23、25、26、29、41、69、90、97、105、112、114、122、129和141個(gè)aa，SoRT4-28突變位點(diǎn)分別是在第11、29、33、35、41、54、58、105、106、114、119、122、130和136個(gè)aa;SoRT4-29發(fā)生了3個(gè)連續(xù)無(wú)義突變。推測(cè)無(wú)義突變引起反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子失去轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致果蔗品種拔地拉Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表現(xiàn)出較高異質(zhì)性和多拷貝性。

根據(jù)44條RT基因核苷酸序列的聚類分析結(jié)果，選擇各家族中的代表序列，預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（表2）顯示，這些蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有5個(gè)α-螺旋、8或9個(gè)β-折疊;三級(jí)結(jié)構(gòu)含有轉(zhuǎn)角16～19個(gè)及氫鍵68～94個(gè)，還含有明顯的螺旋結(jié)構(gòu)5個(gè)和折疊結(jié)構(gòu)5個(gè)（紅色為N端，藍(lán)色為C端）。圖6為家族Ⅰ中代表序列SoRT4-11編碼蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2. 5 RT基因編碼蛋白的保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果

由圖7可知，44條RT基因編碼的蛋白序列存在5種保守基序（Motif 1～Motif 5），其中，有29條序列同時(shí)包含Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4，約占序列總數(shù)的65.91%，尤其是Motif 1在44條序列中均存在，高度保守，該保守基序決定了44條序列的編碼基因均為RT基因;其余15條序列中，SoRT4-26、SoRT4-44、SoRT4-38、SoRT4-50和SoRT4-34這5條序列出現(xiàn)了不同的保守基序即Motif 5、SoRT4-33、SoRT4-48和SoRT4-42這3條序列的Motif 4均出現(xiàn)在序列下游。

2. 6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

將44條果蔗RT基因序列和GenBank中已發(fā)表的18條來(lái)源于單子葉、雙子葉和裸子植物RT基因序列（表3）翻譯成氨基酸序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖8）。根據(jù)果蔗和其他植物RT基因編碼的氨基酸序列，RT基因可劃分為七類（Ⅰ～Ⅶ），Ⅰ類包含18條果蔗RT基因序列，Ⅱ類包含12條果蔗RT基因序列和擬南芥的BAB40828.1，Ⅰ類和Ⅱ類中的果蔗RT基因序列分別占到序列總數(shù)的40.91%和27.27%，表明果蔗RT基因序列的保守性較高;Ⅲ類中的14條RT基因序列均來(lái)自其他物種植物，但與Ⅰ類和Ⅱ類中的序列親緣關(guān)系相對(duì)較近;Ⅳ類只包含SoRT4-20，Ⅴ類和Ⅶ類僅包含2條果蔗RT基因序列;Ⅵ類包含果蔗的7條RT基因序列及禾本科粳稻（Oryza sativa japo-nica，BAB40824.1）、藜科菠菜（Spinacia oleracea，BAB 40833.1）和豆科大豆（Glycine max，BAB40834.1）的RT基因序列，表明這些物種親緣關(guān)系較近。

2. 7 RT基因序列的轉(zhuǎn)錄活性初步分析

將RT基因序列與甘蔗EST庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)查詢覆蓋度均為87%時(shí)，SoRT4-40與GE325024.1和GE325034.1的一致性均為91.78%，暗示這2條EST序列為果蔗品種拔地拉Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的部分轉(zhuǎn)錄序列，推測(cè)SoRT4-40具有轉(zhuǎn)錄活性。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，利用簡(jiǎn)并引物對(duì)PCR擴(kuò)增同一種質(zhì)，擴(kuò)增出的目的條帶是由很多條序列組成的混合體，長(zhǎng)度約430 bp，與在其他作物中的擴(kuò)增結(jié)果（侯小改等，2013;張文波等，2016;彭磊等，2017;白楊等，2018;王慶竹等，2018）一致，且這些Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列在長(zhǎng)度、堿基含量和核苷酸相似性上存在較大的差異，表現(xiàn)出較高異質(zhì)性。另外，在核苷酸序列間相似性和無(wú)義突變發(fā)生率上，44條果蔗RT基因異質(zhì)性較高，而在氨基酸序列相似性上，44條果蔗RT基因異質(zhì)性更高。本研究44條果蔗RT基因編碼氨基酸序列的主要保守基序?yàn)镸otif 1～Motif 4，表明44條果蔗RT基因保守性較高，但有15條果蔗RT基因序列的保守基序變異較大，表明44條果蔗RT基因序列也存在一定程度的異質(zhì)性。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座高頻突變、自然突變、同源重組及橫縱向傳遞均會(huì)導(dǎo)致序列異質(zhì)性的產(chǎn)生（陽(yáng)太億等，2019）。

本研究基于RT基因的核苷酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示44條果蔗RT基因序列可劃分為四大家族，主要家族是Ⅰ和Ⅲ，表明這些果蔗RT基因呈現(xiàn)一定程度的保守性，初步推測(cè)具有轉(zhuǎn)錄活性的家族是Ⅰ和Ⅲ，它們存在的歷史愈久遠(yuǎn)（Tang et al.，2005）。另外，4個(gè)家族代表性RT基因編碼的蛋白在氫鍵數(shù)量和轉(zhuǎn)角數(shù)量等三級(jí)結(jié)構(gòu)上存在差異，家族Ⅳ中的7條RT基因序列均存在多個(gè)無(wú)義突變，其中SoRT4-26的氫鍵數(shù)量明顯少于其他3個(gè)家族中的代表性序列，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性依靠氫鍵維持，推測(cè)該家族RT基因編碼的蛋白已失去活性。

本研究系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，Ⅱ類中的12條果蔗RT基因序列與擬南芥的BAB40828.1親緣關(guān)系較近;Ⅵ類中的7條果蔗RT基因序列與粳稻的BAB40824.1、菠菜的BAB40833.1和大豆的BAB40834.1親緣關(guān)系最近，推測(cè)橫向傳遞曾發(fā)生在果蔗Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與這些物種植物之間。Ⅳ類只包含SoRT4-20，Ⅴ類和Ⅶ類中的RT基因序列均來(lái)自果蔗，但所包含的RT基因序列較少，且這3類與其他家族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)這3類RT基因在起源和進(jìn)化上較古老，為果蔗所特有，特異性較強(qiáng)。

4 結(jié)論

從果蔗品種拔地拉克隆獲得44條Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列，這些RT基因在序列長(zhǎng)度、AT含量、核苷酸及氨基酸序列間相似性、無(wú)義突變發(fā)生率、保守基序異質(zhì)性及蛋白結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出多樣性，44條中的1條RT基因序列SoRT4-40具有轉(zhuǎn)錄活性。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）