郭伶俐， 任 旭， 何曉東， 張 凱， 徐立群

（西南大學(xué)材料與能源學(xué)院，重慶 400715）

聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有無毒、化學(xué)和熱穩(wěn)定等特點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，其產(chǎn)品包括導(dǎo)尿管、腹腔透析管、人工氣道導(dǎo)管、傷口引流管、假體以及人工心臟瓣膜等醫(yī)用裝置[1-5]。然而，生物分子、蛋白質(zhì)和細菌等傾向于附著在PDMS表面，形成細菌繁殖和生物被膜，引起嚴(yán)重感染，導(dǎo)致裝置故障，手術(shù)失敗，甚至患者死亡[6]。為了解決生物醫(yī)用材料植入感染問題，維持其性能且延長其使用壽命，有必要在PDMS表面構(gòu)筑功能化抗菌/抗污涂層[4]。目前，提高PDMS表面抗菌/抗污性能常見的策略是建立接觸殺菌、釋放殺菌和防黏涂層[7]。接觸殺菌是在材料表面接枝或耦合抗菌劑，如抗菌肽[8]、陽離子型聚合物[9]、光活性化合物[10]等，以殺死附著的細菌。雖然構(gòu)建接觸殺菌涂層的方法已有大量報導(dǎo)，但如何簡便快捷地在PDMS表面形成接觸殺菌涂層仍然是該研究領(lǐng)域的難題。

ε-聚賴氨酸（Ply）具有良好的廣譜抑菌性、水溶性、生物安全性、熱穩(wěn)定性以及優(yōu)異的防腐性能。Ply被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)為“公認(rèn)為安全”（GRAS）的食品防腐劑[11,12]。單寧酸（TA）是天然提取的多酚類化合物，具有較強的生物學(xué)特性和藥理活性，同樣被美國FDA批準(zhǔn)為“公認(rèn)為安全”的食品添加劑[13]。TA能夠黏附在各種基材表面，并充當(dāng)表面后修飾平臺，通過邁克爾加成、席夫堿反應(yīng)或無電電鍍反應(yīng)實現(xiàn)表面功能化[14]。此外，TA的酚羥基可與氫鍵受體產(chǎn)生強氫鍵作用，形成水凝膠、納米顆粒、自組裝涂層等[15]。TA與Ply能通過氫鍵作用結(jié)合，也能發(fā)生邁克爾加成或席夫堿反應(yīng)產(chǎn)生共價鍵合。因此，以安全無毒的TA和Ply在PDMS表面沉積，有望解決其存在的植入感染問題。

本文首先使用浸泡法和風(fēng)干法將TA快速沉積到PDMS表面，再用相同方法將Ply快速沉積到TA修飾的PDMS表面，獲得功能化涂層修飾的PDMS（PDMS-TA-Ply）。表面沉積的Ply帶有正電荷，能夠與帶有負(fù)電荷的細菌膜通過靜電作用結(jié)合，破壞細菌膜的完整性，使內(nèi)含物流出，進而導(dǎo)致菌體死亡[16]。本文探討了PDMS-TA-Ply的表面組成、親疏水性以及抗蛋白質(zhì)吸附、抗細菌黏附、抗生物被膜形成等性能。PDMS-TA-Ply具有良好的抗蛋白質(zhì)吸附以及抗細菌黏附和生物被膜形成能力，且生物毒性較低。當(dāng)Ply的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，PDMS-TA-Ply涂層的抗菌/抗污效果更好，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

Ply：由南京工業(yè)大學(xué)徐虹教授課題組提供；TA、牛血清白蛋白（BSA）、纖維蛋白原（FBG）、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）：生物級，上海Sigma-Aldrich有限公司；PDMS：醫(yī)用級，美國BIOPLEXUS公司；大腸桿菌（E.coli）: 細菌編號ATCC 25 922，美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)庫；金黃色葡萄球菌（S.aureus）：編號5 639，寧波大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院提??；細菌細胞活性測定試劑盒：上海恪敏生物科技有限公司；瓊脂：食品級，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 測試與表征

X射線光電子能譜（XPS）儀：美國 Thermo Fisher 科技公司ESCALAB 250Xi型，以Al Kα 單色射線為X射線源（能量分辨率小于0.45 eV）測試材料表面化學(xué)元素組成；接觸角測量儀：上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司JC2000D型，采用切線法測試材料表面親疏水性；表面等離子共振（SPR）儀：美國生物傳感儀器公司BI-4 000型，以20 μL/min的流速測試材料表面蛋白質(zhì)吸附行為；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本JEOL公司JSM-6 510型，噴鉑處理后觀察材料表面細菌黏附情況；共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）：德國Carl Zeiss LSM700型，利用細菌細胞活性測定試劑盒染色后觀察材料表面活/死細菌；酶標(biāo)儀：美國寶特公司Bio-Tek ELX800型，測定菌液在570 nm的吸光度。

1.3 PDMS-TA-Ply的制備

TA與Ply在PDMS表面快速沉積示意圖如圖1所示。將空白PDMS裁剪成邊長為1 cm的正方形，在等離子體機中處理5 min。用三羥甲基氨基甲烷（Tris）水溶液（10 mmol/L, pH=8.5）配制TA溶液，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。把等離子體處理的PDMS置于TA溶液中浸泡15 min，取出后用氬氣吹干，得到TA修飾的PDMS（PDMS-TA）基底。將Ply溶于Tris水溶液中，得到質(zhì)量濃度分別為0.5、2 mg/mL的Ply溶液，把PDMSTA浸入Ply溶液15 min，取出后用氬氣吹干，即得到PDMS-TA-Ply。當(dāng)Ply的質(zhì)量濃度分別為0.5、2 mg/mL時，得到的樣品分別標(biāo)記為PDMS-TA-Ply0.5和PDMS-TA-Ply2。

圖1 TA與Ply在PDMS表面快速沉積示意圖Fig.1 Schematic illustration of surface deposition of TA and Ply on PDMS surface

1.4 TA-Ply涂層的抗蛋白質(zhì)吸附性能

按照1.3節(jié)的步驟，將PDMS基材換成裸金芯片，制備得到Au-TA-Ply。利用SPR實時監(jiān)測裸金和Au-TA-Ply芯片表面蛋白質(zhì)非特異性吸附行為。將磷酸鹽（PBS）緩沖溶液（10 mmol/L, pH=7.4）以20 μL/min的速率流過芯片表面直至基線信號平穩(wěn)，再注入200 μg/mL的BSA或FBG的PBS溶液，以20 μL/min的流速在芯片表面流動10 min，隨后用PBS緩沖液以相同的流速在芯片表面流動，以去除芯片表面未牢固吸附的蛋白質(zhì)。本文以裸金芯片和Au-TA-Ply暴露于BSA或FBG溶液前后的角偏移計算蛋白質(zhì)在材料表面的吸附量。通常而言，SPR角度偏移0.1o表示蛋白質(zhì)在芯片表面的吸附量約為1 ng/mm2。

1.5 PDMS-TA-Ply的抗菌性能評價

1.5.1 細菌培養(yǎng) 將S.aureus和E.coli接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% 的TSB培養(yǎng)基中，菌液在37 ℃電熱恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。用酶標(biāo)儀測定菌液在570 nm處的吸光度（OD）。通常情況下，OD=1代表每毫升菌液約含有1×109個細菌。

1.5.2 抑菌圈實驗 將S.aureus和E.coli培養(yǎng)液用PBS緩沖液稀釋至每毫升1×106個細菌。吸取100 μL稀釋的菌液均勻滴在TSB瓊脂板中，用涂布棒均勻涂布直至菌液完全被吸收。將空白PDMS和PDMS-TA-Ply貼壁至TSB瓊脂板，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h。觀察材料底部和周圍抑菌圈形成情況，并用相機拍照記錄。

1.5.3 稀釋涂布平板計數(shù)法 將S.aureus和E.coli培養(yǎng)液用PBS緩沖液稀釋至每毫升1×107個細菌。將空白PDMS和PDMS-TA-Ply置于24孔板中，每孔加入1 mL稀釋的菌液，在37 ℃孵育4 h。將孔中的菌液吸出，輕輕加入1 mL PBS緩沖液清洗PDMS表面，以除去未牢固黏附的細菌，重復(fù)進行3次。將清洗后的PDMS片材取出，置于含有3 mL PBS緩沖液的離心管中，超聲處理5 min，剝離PDMS片材表面黏附的細菌。將從表面剝離的細菌溶液按照一定的倍數(shù)進行梯度稀釋，吸取100 μL梯度稀釋的菌液均勻滴在TSB瓊脂板上，用涂布棒均勻涂布，直至菌液被瓊脂板吸收。將TSB瓊脂板在37 ℃孵育12 h，觀察TSB瓊脂板上細菌的生長情況，統(tǒng)計菌落數(shù)，并用相機拍照記錄。

1.5.4 PDMS-TA-Ply表面的細菌黏附情況 用PBS緩沖液清洗PDMS片材后，往孔中加入1 mLw=3%的戊二醛水溶液以固定PDMS表面黏附的細菌。將24孔板置于4 ℃冰箱中過夜，吸出孔中的戊二醛溶液，利用乙醇進行梯度脫水處理。將處理后的PDMS片材在室溫下干燥后進行表面噴鉑處理，用SEM觀察表面細菌黏附情況。

1.5.5 PDMS-TA-Ply表面形成的細菌生物被膜 配制TSB-PBS（體積比1∶1）混合液，用其稀釋S.aureus和E.coli培養(yǎng)液至濃度為1×105cells/mL。將空白PDMS和PDMS-TA-Ply置于24孔板中，每孔加入1 mL稀釋的菌液，在37 ℃孵育24 h。吸出孔中的細菌混合液，輕輕加入1 mL PBS緩沖液清洗PDMS表面，重復(fù)進行2次。將20 μL熒光染色劑SYTO 9和碘化丙啶（PI）滴到PDMS表面，避光浸染20 min。沿孔壁加入1 mL PBS緩沖液，再緩慢吸出。經(jīng)SYTO 9和PI細菌活/死染色劑著色后，細胞膜完整的活細菌會發(fā)出綠色熒光，細胞膜破損的細菌會發(fā)出紅色熒光。將PDMS片材置于CLSM下觀察表面紅色和綠色熒光強度。同時，參照1.5.4節(jié)方法處理PDMS片材，并用SEM觀察PDMS表面形成的細菌生物被膜。

1.6 PDMS-TA-Ply的生物相容性（細胞毒性）評價

利用噻唑藍（MTT）法檢測樣品對L929小鼠成纖維細胞的細胞毒性。將空白PDMS和PDMS-TA-Ply分別浸泡在5 mL改進的Eagle基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基（DMEM）中，在4 ℃冰箱中保存1、2、3 d和4 d。在96孔板中每孔接種5 000個細胞，將其在37 ℃孵育36 h，吸出孔中的培養(yǎng)基，將其替換空白PDMS和PDMS-TA-Ply預(yù)處理的培養(yǎng)基，以未經(jīng)任何處理的DMEM培養(yǎng)基作為對照組。在37 ℃培養(yǎng)箱中分別孵育24、48 h后，吸出培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗每個孔，重復(fù)進行3次。向孔中加入0.2 mL MTT的DMEM溶液（0.5 mg/mL），37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。輕輕吸出培養(yǎng)基，向孔中加入0.2 mL二甲基亞砜以溶解藍紫色結(jié)晶甲臜。15 min后利用酶標(biāo)儀測定溶液在570 nm處的吸光度。實驗結(jié)果相對于對照組，用百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 TA-Ply的表面沉積

圖2（a）為TA溶液與Ply溶液混合前后的圖片。從圖中可以看出，0.5 mg/mL的Ply溶液與TA溶液混合后，溶液的狀態(tài)和顏色沒有明顯變化；當(dāng)Ply的質(zhì)量濃度增加到2 mg/mL時，混合后的溶液變渾濁，并伴隨著絮狀沉淀產(chǎn)生，說明Ply能夠與TA發(fā)生反應(yīng)。圖2（b）為空白PDMS和PDMS-TA-Ply的XPS譜圖。與空白PDMS相比，PDMS-TA-Ply表面Si2p的信號強度降低，且出現(xiàn)了N1s信號。該結(jié)果表明Ply涂層被成功引入到PDMS表面。由于XPS譜圖中仍然能夠檢測到基材硅元素信號，推測TA-Ply涂層厚度應(yīng)該低于公認(rèn)的XPS檢測深度（約為10 nm）。圖2（c）為空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面的靜態(tài)水接觸角?？瞻譖DMS表面是疏水的，其接觸角為（109.0±1.1）°；PDMS-TA-Ply0.5、PDMS-TA-Ply2 表面的水接觸角分別為 55.4°、35.6°。TA-Ply的沉積能夠提高PDMS表面的親水性，賦予其抗細菌黏附性能。

圖2 （a）TA溶液與Ply溶液混合前后的圖片；空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面的（b）XPS譜圖和（c）靜態(tài)水接觸角Fig.2 （a）Photographs of TA and Ply solutions before and after mixing; （b）XPS patterns and （c）the static water contact angles of the PDMS and PDMS-TA-Ply surfaces（*** represents p＜0.001, vs PDMS）

2.2 Au-TA-Ply的抗蛋白質(zhì)吸附性能

圖3（a，b）為BSA和FBG在裸金芯片和Au-TA-Ply表面的SPR角偏移曲線圖，圖3（c）為BSA和FBG在空白和修飾的裸金芯片表面的吸附量。裸金芯片表面較疏水，能夠引起蛋白質(zhì)在表面的吸附，所以裸金芯片表面SPR角偏移較大。與裸金芯片相比，Au-TA-Ply0.5的SPR角偏移降低，Au-TA-Ply2的SPR角偏移則進一步降低。通過定量計算，BSA和FBG在裸金芯片表面的吸附量分別為（3.12±0.12）、（5.39±0.06）ng/mm2。BSA和FBG在Au-TA-Ply0.5表面的吸附量約降至裸金芯片的57.5%和63.1%，而在Au-TA-Ply2表面的吸附量約降至裸金芯片的34.9%和23.0%。這些結(jié)果表明Au-TA-Ply涂層能夠抑制蛋白質(zhì)的表面吸附，且Au-TA-Ply2涂層具有較好的抗蛋白質(zhì)吸附性能。

圖3 （a）BSA和（b）FBG在裸金芯片和Au-TA-Ply表面的SPR角偏移曲線以及（c）吸附量Fig.3 SPR sensorgrams of bare Au and Au-TA-Ply surfaces upon exposure to （a）BSA and （b）FBG, （c）adsorbed amounts（* represents p＜0.05, ** represents p＜0.01, and *** represents p＜0.001, vs bare Au）

2.3 PDMS-TA-Ply的抗細菌黏附性能

圖4為空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面在E.coli和S.aureus細菌黏附后的SEM照片。如圖4所示，大量聚集的桿狀菌（E.coli）和球形菌（S.aureus）黏附在空白PDMS表面。與空白PDMS相比，PDMS-TA-Ply0.5表面黏附的細菌減少，但是仍能觀察到E.coli的聚集。PDMS-TA-Ply2表面E.coli的聚集現(xiàn)象消失，S.aureus的附著菌落數(shù)量顯著降低。結(jié)果表明，PDMS-TA-Ply2具有一定的抗細菌黏附性能，對S.aureus的黏附抑制作用更加明顯。

圖4 空白 PDMS 和 PDMS-TA-Ply 表面與（a，b，c）E.coli和（d，e，f）S.aureus接觸 4 h 后的 SEM 照片F(xiàn)ig.4 SEM images of adhered （a, b, c）E.coli and （d, e, f）S.aureus on the pristine PDMS and PDMS-TA-Ply surfaces after 4 h incubation

圖5（a）為空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面黏附的E.coli和S.aureus，經(jīng)超聲脫落、梯度稀釋和涂板培養(yǎng)，在TSB瓊脂板上形成的菌落。在同一梯度稀釋的樣品中，PDMS-TA-Ply2表面形成的菌落數(shù)最少。相比于E.coli，PDMS-TA-Ply2對S.aureus抑制作用更加明顯，其原因可能與革蘭氏陽性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。S.aureus細胞壁結(jié)構(gòu)簡單，主要由肽聚糖組成，而革蘭氏陰性菌E.coli的細胞壁被攜帶有負(fù)電荷的脂多糖外膜所包被，外膜層有可能減弱聚賴氨酸對E.coli的滅活作用。通過計數(shù)分析（圖5（b））得到，空白PDMS表面黏附的E.coli和S.aureus數(shù)量分別為 4.02×106、3.41×106cells/cm2。與空白 PDMS 相比，PDMS-TA-Ply0.5表面黏附的E.coli和S.aureus數(shù)量分別下降到前者的56%和52%。E.coli和S.aureus在PDMS-TA-Ply2表面黏附的活細菌的數(shù)量分別減少到空白PDMS表面的24%和6.1%。如圖5（c,d）所示，與PDMS-TA-Ply接觸的E.coli和S.aureus涂布的瓊脂板區(qū)域透明，細菌生長較少，而未覆蓋或被空白PDMS覆蓋的瓊脂板則形成大量菌落。結(jié)果表明PDMS-TA-Ply表面具有接觸抗菌性能。

圖5 空白和改性PDMS表面（a）黏附的E.coli和S.aureus在TSB瓊脂板形成的菌落圖和（b）黏附的活細菌數(shù)量，以及對（c）E.coli和（d）S.aureus的接觸殺菌實驗（1～3分別代表空白PDMS、PDMS-TA-Ply0.5和PDMS-TA-Ply2）Fig.5 （a）The formed E.coli and S.aureus colonies and （b）the number of live bacteria on the pristine and modified PDMS surfaces, and the contact killing performance of the pristine and modified PDMS substrates against （c）E.coli and （d）S.aureus（1, 2 and 3 represent pristine PDMS, PDMS-TA-Ply0.5 and PDMS-TA-Ply2）

2.4 PDMS-TA-Ply的抗生物被膜形成性能

圖6為空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面形成的E.coli和S.aureus生物被膜的CLSM圖像。如圖6（a,d）所示，空白PDMS表面綠色熒光較強，只有較弱的紅色熒光，說明疏水的空白PDMS表面有利于形成細菌生物被膜。PDMS-TA-Ply0.5表面綠色熒光減弱，說明它在一定程度上抑制了細菌生物被膜的形成。PDMS-TAPly2表面只檢測到微弱的綠色熒光和紅色熒光，說明它能夠顯著抑制細菌生物被膜的形成。通過ImageJ軟件分析每張圖像上的綠色和紅色熒光信號強度。與空白PDMS表面相比，E.coli黏附的PDMS-TA-Ply0.5和PDMS-TA-Ply2表面綠色（紅色）熒光強度分別降低到前者的57.50%（88.89%）和17.50%（32.52%），而S.aureus黏附的 PDMS-TA-Ply0.5和 PDMS-TA-Ply2表面綠色（紅色）熒光強度分別降低到PDMS的56.20%（10.05%）和16.60%（17.65%）。熒光強度定量分析進一步證明PDMS-TA-Ply2表面具有較強的抑制生物被膜形成能力。

圖6 空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面形成的（a, b, c）E.coli 和（d, e, f） S.aureus生物被膜的CLSM圖像Fig.6 CLSM images of （a, b, c） E.coli and （d, e, f） S.aureus biofilms formed on the pristine PDMS and PDMS-TA-Ply surfaces

圖7為空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面形成的E.coli和S.aureus生物被膜的SEM照片。如圖所示，空白PDMS表面分布大量聚集的E.coli和S.aureus細菌斑塊。相對于空白PDMS，PDMS-TA-Ply0.5表面未出現(xiàn)大塊的細菌聚集體，黏附的細菌數(shù)量減少。PDMS-TA-Ply2表面的細菌斑塊消失，細菌數(shù)量進一步減少。分析表明PDMS-TA-Ply2可以更有效地抑制生物被膜的形成。

圖7 空白 PDMS 和 PDMS-TA-Ply 表面形成的（a，b，c）E.coli和（d，e，f）S.aureus生物被膜的 SEM 照片F(xiàn)ig.7 SEM images of （a, b, c）E.coli and （d, e, f）S.aureus biofilms formed on the pristine PDMS and PDMS-TA-Ply surfaces

2.5 PDMS-TA-Ply的生物相容性

圖8為接觸空白PDMS、PDMS-TA-Ply表面浸泡DMEM培養(yǎng)基后，L929細胞的存活率，3組樣品的數(shù)值均在90%以上。結(jié)果表明，PDMS-TA-Ply0.5和PDMS-TA-Ply2涂層對L929細胞具有較低的細胞毒性。

圖8 L929小鼠成纖維細胞與空白PDMS和PDMS-TA-Ply表面預(yù)處理的DMEM培養(yǎng)基共孵育（a）24 h和（b）48 h后的存活率Fig.8 Relative cell viabilities of L929 mouse fibroblasts culturing in DMEM pretreated with the pristine PDMS and PDMS-TA-Ply surfaces for （a）24 h and （b）48 h（* represents p＜0.05, vs PDMS in each group）

3 結(jié) 論

（1）TA和Ply可以通過分子間氫鍵、邁克爾加成、席夫堿反應(yīng)等作用在PDMS表面形成PDMS-TA-Ply涂層。

（2）相比于PDMS-TA-Ply0.5涂層，PDMS-TA-Ply2涂層的親水性更好。

（3）PDMS-TA-Ply具有良好的抗蛋白質(zhì)吸附以及抗細菌黏附和生物被膜形成能力，且具有較低的生物毒性。其中，PDMS-TA-Ply2涂層的抗菌/抗污效果更好，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。