龐惟俏，佐兆杭，孫 維，張乃丹，周欣雨，王 穎，2，3，4*

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江 大慶 163319 2 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江 大慶 163319 3 糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心 黑龍江 大慶 163319 4 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江 大慶 163319）

豆醬屬于一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，豐富了中國人餐桌上的飲食文化和飲食選擇的多樣性，備受消費(fèi)者青睞和商家關(guān)注。豆醬的原料挑選、種曲篩選[1]、發(fā)酵條件優(yōu)化、產(chǎn)品研發(fā)，每個環(huán)節(jié)對制作和生產(chǎn)高質(zhì)量豆醬和醬衍生類產(chǎn)品十分重要[2]。工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬的發(fā)酵過程是原料大豆、面粉等物質(zhì)，在曲精（霉菌、酵母菌、芽孢桿菌等）的作用下[3]于發(fā)酵池內(nèi)進(jìn)行一系列生化反應(yīng)及能量代謝，包括淀粉糖化、糖酵解、產(chǎn)酯增香等，進(jìn)而生成各類代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)，賦予其獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)和功能特性。研究證實(shí)，傳統(tǒng)大豆醬中的核心微生物對其風(fēng)味物質(zhì)的形成和不同發(fā)酵階段的表觀性質(zhì)具有重要作用[4]。結(jié)合傳統(tǒng)方式自然發(fā)酵加工工藝生產(chǎn)的大豆醬，因發(fā)酵生產(chǎn)過程處于開放式環(huán)境，最終生產(chǎn)出的豆醬品質(zhì)不一。研究大豆醬微生物群落結(jié)構(gòu)組成、演替規(guī)律、優(yōu)勢微生物及代謝過程等，對其發(fā)酵過程、產(chǎn)物生成及風(fēng)味類別起重要作用[5]。

早期大豆醬及發(fā)酵醬制品微生物多樣性和群落組成的研究，大都采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、PCRDGGE、構(gòu)建基因文庫克隆技術(shù)[6-8]等方法，以便深入認(rèn)識并揭示其微生物群落環(huán)境的整體情況。如陳依淼等[9]采用傳統(tǒng)方法分離蝦醬發(fā)酵過程中的17 株優(yōu)勢細(xì)菌；Nam 等[10]利用高通量測序技術(shù)比較分析韓國市售9 種成品傳統(tǒng)大豆醬的微生物多樣性，證明芽孢桿菌屬（Bacillus）是主要的優(yōu)勢菌屬。近年來，多數(shù)研究集中在大豆醬的微生物群落多樣性和組成，對其發(fā)酵過程中微生物的功能性預(yù)測分析的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的微生物群落多樣性及優(yōu)勢微生物對其發(fā)酵理化性質(zhì)和香氣品質(zhì)的影響可能存在差異。宏基因組測序技術(shù)和宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠深入表達(dá)基因和獲得發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)及特定微生物，并可預(yù)測其發(fā)酵過程中微生物潛在的功能特性[11-13]，其應(yīng)用越來越受到重視。本試驗(yàn)以不同發(fā)酵時間節(jié)點(diǎn)的工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬為研究對象，分析其發(fā)酵過程中理化性質(zhì)變化和微生物群落的演替規(guī)律并進(jìn)行相關(guān)性分析，同時預(yù)測發(fā)酵過程中的微生物群落組成，以期保證在釀造周期內(nèi)生產(chǎn)的大豆醬保持穩(wěn)定的天然釀造風(fēng)味，同時，通過了解大豆醬生產(chǎn)和風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)制，為日后完善大豆醬標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步研究功能性和風(fēng)味穩(wěn)定的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大豆醬，黑龍江省某知名品牌大豆醬醬廠。

3，5 -二硝基水楊酸、苯酚，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；福林酚試劑、碳酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對甲氧基苯甲醛、酪蛋白，上海嵐派生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有有機(jī)溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純級。DNA 提取試劑盒QIAamp DNA stool mini kit，美國OMEGA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

720 紫外-可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器有限公司；微量高速離心機(jī)，Thermo 公司；Pico-21 臺式離心機(jī)，Thermo Fisher 公司；GL-88B 漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C 型電泳儀電源、DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；T100TM Thermal Cyeler PCR 儀，BIO-RAD 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆醬樣品采集 分別收集大醬池中發(fā)酵1，7，14，21，28，34 d 的大豆醬，在醬池頂部、中部、底部隨機(jī)采集翻醅后的醬醅各20 g 后混勻；置于滅菌袋中，-80 ℃保存，以備進(jìn)行DNA 提取。

1.3.2 大豆醬風(fēng)味理化物質(zhì)測定 大豆醬粗提液的制備：稱取5.0 g 大豆醬用蒸餾水定容100 mL，28 ℃下均質(zhì)振蕩60 min，3 500 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，過濾后溶液為粗提液。參照醬衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法 （GB 5009.40-2003）[14]和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定方法（GB 5009.235-2016）[15]，測定大豆醬總酸和氨基酸態(tài)氮含量。通過3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖和葡萄糖淀粉酶含量；采用福林酚法測定蛋白酶含量。單位體積大豆醬粗酶液1 min 水解淀粉生成1 μg 麥芽糖為1 個酶活力單位（U）；單位體積大豆醬粗酶液1 min 水解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸為1 個酶活力單位（U）。

通過氣相色譜-質(zhì)譜連用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）測定大豆醬揮發(fā)性成分。每組分別取約2.0 g 的大豆醬樣品加入40 mL 樣品瓶中，加入經(jīng)過稀釋的對甲氧基苯甲醛內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，將樣品瓶放入60 ℃水浴中平衡10 min，將老化5 min 的50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）萃取針頭插入樣品瓶中，恒溫60 ℃萃取30 min，插入GC-MS 的進(jìn)樣器于250 ℃條件下解析1 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。GC-MS 分析時，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min。程序升溫條件，由室溫升至80 ℃保持2 min，然后以4 ℃/min升至180 ℃在此溫度下保持3 min，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，降溫至80 ℃，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：MS 離子源在225 ℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍：50～500 u。通過檢索質(zhì)譜圖和NIST02.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照匹配進(jìn)行定性分析；根據(jù)內(nèi)標(biāo)物的濃度、樣品中各組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值進(jìn)行定量分析。

1.3.3 大豆醬DNA 的提取 使用QIAamp DNA stool mini kit 試劑盒提取大豆醬的總DNA，確保所提取的DNA 純度和完整性，-80 ℃保存，待構(gòu)建測序文本備用。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增及高通量測序 16S rDNA 擴(kuò)增引物是利用測序平臺的341F 引物/805R 引物；18S rDNA 擴(kuò)增引物是NS1-FUNG 通用引物，通過Illumina Miseq 測序平臺對文庫進(jìn)行測序。使用PEARV0.9.6 將Miseq 雙端測序的reads 重疊部分拼接成一條序列，利用軟件UsearchV5.2.236 去除非靶區(qū)域序列、嵌合體及短片段序列，為減少錯誤率，對樣本序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（Q20 和Q30 得分均是99%）。利用MothurV1.30.2 將多條序列按其序列間的距離進(jìn)行聚類，根據(jù)序列之間的相似性0.97 作為閾值分成OTU （Operational taxonomic unit），獲取樣品屬水平的分類和豐度，利用RDP classifer（v2.2）軟件將OTU 序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得物種注釋。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 基于Excel 2021 軟件和GraphPad Prism 9.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖形繪制。用Simca-p11.5 軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析 （Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），基于R 語言version 3.3.1 進(jìn)行主成分分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）。通過使用LEfSe 線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小，鑒定不同發(fā)酵時期細(xì)菌和真菌群落物種之間的差異，并將LDA 的篩選值設(shè)置為2[16]。通過PICRUSt2 對OTU豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后通過每個OTU 對應(yīng)的greengene id，獲得OTU 對應(yīng)的COG 家族信息；并計算各COG 的豐度和KO 豐度，根據(jù)eggNOG 數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG 的預(yù)測性描述信息，以及其功能信息。RDA 分析即冗余分析，97%相似性的樣本OTU 進(jìn)行分析，判斷理化因素與不同發(fā)酵時期的豆醬菌群之間相關(guān)性和顯著性。使用R 語言軟件包psych 和corr.test 函數(shù)計算斯皮爾曼（Spearman） 兩兩相關(guān)性并分析相關(guān)性的顯著性，通過Cytoscape 軟件將顯著性P＜0.05 且相關(guān)系數(shù)|r|＞0.6 的高度相關(guān)性可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆醬風(fēng)味理化物質(zhì)的監(jiān)測

總酸、氨基酸態(tài)氮、還原糖、揮發(fā)性成分、微生物酶活性的動態(tài)變化是影響豆醬發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵因素[17]。工業(yè)化生產(chǎn)大豆醬在發(fā)酵過程中可滴定酸和氨基酸態(tài)氮呈先上升后下降的趨勢，如圖1a和1b 所示，可滴定酸度在發(fā)酵第28 天含量最高，為4.05%；氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵第21 天含量最高，為9.31 g/100g。這是由于發(fā)酵過程中乳酸菌或者乳酸桿菌發(fā)酵代謝，促使大豆醬中的酸不斷富集；氨基酸態(tài)氮在大豆醬發(fā)酵過程中對其風(fēng)味品質(zhì)具有一定影響，發(fā)酵后期時其含量下降可能是由于蛋白酶活性減弱，進(jìn)而影響氨基酸態(tài)氮含量的變化。還原糖在大豆醬發(fā)酵過程中影響其顏色和微生物的生長情況，如圖1c 所示，還原糖在發(fā)酵第14 天時含量最高，為6.32 g/L，含量最低時是第21天，為4.24 g/L，含量突然變化可能是由于微生物的代謝能力下降以及微生物對碳源消耗的增加導(dǎo)致。蛋白酶和淀粉酶是將大分子物質(zhì)分解為小分子的催化劑，如圖1d 和1e 所示，這2 種酶的活性隨發(fā)酵時間的延長而減弱，結(jié)果表明大豆醬中微生物的代謝在發(fā)酵后期也逐漸趨于穩(wěn)定。通過HS-SPME-GC-MS 檢測分析發(fā)現(xiàn)，大豆醬發(fā)酵過程中共檢出45 種揮發(fā)性化合物，其中包括7 種醇類、17 種酯類、4 種酸類、3 種酚類、2 種醛類、2種酮類和10 種其它類揮發(fā)性成分。如圖1f 所示，總揮發(fā)性化合物含量在發(fā)酵過程中逐漸積累，而在第28 天時，揮發(fā)性成分下降至285.42 ng/g，這與酶活性的結(jié)果相吻合，除了微生物群落的影響因素，可能與發(fā)酵過程中翻醅的次數(shù)和車間環(huán)境因子相關(guān)；待發(fā)酵結(jié)束時，揮發(fā)性成分含量積累到最大（945.91 ng/g）。醇類和酯類是大豆醬的主要揮發(fā)性成分，其中酯類化合物占揮發(fā)性化合物總含量的60%以上。這與賈云等[18]的相關(guān)研究結(jié)果一致，醇酯類揮發(fā)性成分是大豆醬風(fēng)味的主成分。

圖1 大豆醬發(fā)酵過程中風(fēng)味理化指標(biāo)的動態(tài)變化情況Fig.1 Dynamic changes of physicochemical and flavor indicators during fermented soybean paste

由不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬揮發(fā)性成分熱圖（圖2）可以看出，發(fā)酵代謝產(chǎn)生的各種揮發(fā)性成分出現(xiàn)更替變化，揮發(fā)性成分在發(fā)酵后期顯著富集，同時發(fā)酵中后期是醇酯類化合物的高產(chǎn)期。醇酯類化合物賦予大豆醬適宜的特殊醇酯香氣，豐富其獨(dú)特的發(fā)酵品質(zhì)和性質(zhì)。乙醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、麥芽醇、異戊醇等醇類化合物在大豆醬中被檢出，其是脫水縮合酯化反應(yīng)的重要前體成分[19]。例如，乙醇在許多類發(fā)酵食品中被廣泛檢出，是微生物的主要代謝產(chǎn)物，對發(fā)酵食品的風(fēng)味、質(zhì)地和顏色的形成發(fā)揮重要作用[20]。大豆醬中的酯類化合物，除了酸醇催化反應(yīng)生成酯以外，微生物代謝反應(yīng)亦可代謝可溶性酯。本試驗(yàn)中檢測到的酯包括亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯等，它們具有各自獨(dú)特的花果芳香氣味。大豆醬中酸來源于乳酸菌等微生物的代謝產(chǎn)物和酯類化合物分解產(chǎn)物；酚類化合物來源于代謝產(chǎn)物還原糖的美拉德反應(yīng)。本試驗(yàn)中酸酚類化合物盡管含量和種類較少，包括棕櫚酸、乙烯基愈創(chuàng)木酚、肉豆蔻酸、甲基麥芽酚等，賦予大豆醬獨(dú)特的酸味、辛香味和焙烤香氣[21]。苯乙醛、2-羥基-5-甲基苯乙酮、六甲基環(huán)三硅氧烷等醛酮化合物和其它類化合物在大豆醬中被檢出，賦予大豆醬類似水果甜味和風(fēng)信子的香氣[22]。

圖2 大豆醬發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Fig.2 Changes of volatile flavor compounds in soybean paste during fermentation

2.2 大豆醬微生物物種注釋及組成

2.2.1 大豆醬微生物群落多樣性 序列經(jīng)過高通量測序平臺質(zhì)量控制，根據(jù)OTU 數(shù)目和OTU 所含的序列數(shù)得到大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的豐富度和多樣性，揭示其物種多樣性的信息。由圖3可知，細(xì)菌多樣性指數(shù)呈先上升后下降的趨勢，表明大豆醬中細(xì)菌多樣性先增加后減少，發(fā)酵第14 天時，Shannon 指數(shù)為2.54，細(xì)菌多樣性最高，發(fā)酵初期細(xì)菌多樣性最低為1.35；真菌豐富度更替變化，多樣性指數(shù)在第21 天最低，第7 天最高，Shannon 指數(shù)分別為0.30 和0.81，發(fā)酵初期大豆醬醅中微生物營養(yǎng)物質(zhì)含量高，生長條件適宜，大部分微生物生長和代謝增強(qiáng)。這些結(jié)果與以往多數(shù)發(fā)酵食品報道的結(jié)果相似[18-19]。

圖3 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬細(xì)菌（a）和真菌（b）群落Shannon 指數(shù)Fig.3 Shannon index of the community of active bacteria （a） and fungi （b） in fermented commercial soybean paste at different fermentation nodes

2.2.2 大豆醬微生物物種組成 大豆醬中豐富的微生物物種組成賦予其獨(dú)特的發(fā)酵品質(zhì)和特性，利用宏基因組測序技術(shù)，篩選出其中序列豐度大于5%的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌，得到了大豆醬在屬水平上，不同發(fā)酵階段動態(tài)優(yōu)勢微生物的種類和豐度。如圖4所示，不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)優(yōu)勢細(xì)菌屬不同，最高豐度分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus，58.78%），阪崎腸桿菌屬（Cronobacter，57.34%），四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus，37.83%），腸桿菌屬（Enterobacter，32.49%），乳酸桿菌屬（Lactobacillus，18.55%），魏斯氏菌屬（Weissella，12.85%）。在整個發(fā)酵周期中隨著發(fā)酵溫度和鹽度的升高，細(xì)菌序列豐度最高的是葡萄球菌屬，其序列豐度呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，是發(fā)酵初期的2 倍左右。然而，大豆醬中優(yōu)勢真菌屬組成種類較單一，主要的真菌屬分別是接和酵母屬 （Zygosaccharomyces） 和曲霉屬（Aspergillus）。接和酵母屬的序列豐度在發(fā)酵初期和中期呈不斷上升的趨勢，由14.04%升高到97.38%；然而，曲霉屬的序列豐度變化趨勢與之相反，從81.36%下降至1.07%。曲霉菌屬在大豆醬發(fā)酵過程中，提供了豐富的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，對醬的鮮味具有較大的貢獻(xiàn)。在隨后的發(fā)酵過程中需不斷加入鹽水，形成高滲透壓和缺乏氧氣的生長環(huán)境，使得霉菌的生長被抑制，曲霉屬含量逐漸下降[23-24]。

圖4 大豆醬發(fā)酵過程中屬水平群落演替柱狀圖Fig.4 Successions and distributions community structure in commercial soybean paste at the genus level

通過PCoA 分析，第1 個主坐標(biāo)軸（PCoA1）對細(xì)菌和真菌群落總變化的解釋度分別為 57.98%和79.56%，對一系列特征值和特征向量進(jìn)行排序，根據(jù)優(yōu)勢微生物物種的豐度，不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬中細(xì)菌和真菌的微生物群落組成差異顯著，結(jié)果如圖5a、5b 所示。通過微生物群落聚類分析，將大豆醬整體發(fā)酵過程分為發(fā)酵初期 （0～7 d）、發(fā)酵中期（7～14 d）、發(fā)酵中后期（14～27 d）、發(fā)酵后期（28～34 d）。

圖5 大豆醬屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)PCoA 和聚類分析Fig.5 Principal component and clustering analysis of microbial community diversity during commercial soybean paste fermentation

根據(jù)LEfSe 及線性判別分析（LDA 閾值為2）檢測不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的顯著性差異優(yōu)勢類群，并判斷其差異效果的程度。如表1所示，發(fā)酵初期的差異物種主要是四聯(lián)球菌屬和曲霉屬，發(fā)酵中期富集大量腸桿菌屬和曲霉屬，而發(fā)酵中后期和后期葡萄球菌屬和接合酵母菌屬顯著富集。在相關(guān)大豆醬的研究[25-26]中，測定出的優(yōu)勢菌屬是耐鹽性的接合酵母菌屬和葡萄球菌屬，它們一般對氧需求量不高，可減少大豆醬在發(fā)酵過程中翻醅次數(shù)，并可產(chǎn)生大量的酯類物質(zhì)，貢獻(xiàn)于大豆醬香氣成分的形成。

表1 大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的差異優(yōu)勢微生物Table 1 Commercialize dominant biomarkers during the different fermentation stages of soybean paste

2.3 大豆醬微生物的功能預(yù)測

基于宏基因組數(shù)據(jù)的功能注釋分析，分別對16S rDNA 基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行PICRUSt2 功能預(yù)測和ITS 基因組的FUNGuild 功能預(yù)測分析，進(jìn)而揭示大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落功能。COG 數(shù)據(jù)庫按照功能共分為26 類，在大豆醬發(fā)酵的所有樣品中比對得到了23 種功能類別，如圖6a 所示，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵階段的細(xì)菌群落的預(yù)測功能種類豐度分布均勻且變化穩(wěn)定，豐度高的功能類別主要包括“S：Function unknown（未知功能）”、“E：Amino acid transport and metabolism（氨基酸的運(yùn)輸和代謝）”、“G：Carbohydrate transport and metabolism（碳水化合物運(yùn)輸和代謝）”、“J：Translation，ribosomal structure and biogenesis（翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）”、“K：Transcription（轉(zhuǎn)錄）”、“P：Inorganic ion transport and metabolism （無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）”。這說明大豆醬中細(xì)菌群落可能存在很多功能值得去深入挖掘；氨基酸和碳水化合物代謝主要是大豆醬發(fā)酵前、中期的代謝活動，這可能是由于其中的微生物可編碼與氨基酸和碳水化合物代謝相關(guān)的酶，同時表明大豆醬在發(fā)酵過程中微生物群落細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)生能量物質(zhì)很積極。使用FUNGuild 對大豆醬真菌進(jìn)行功能分類，見圖6b，不同發(fā)酵階段樣品未知功能（Unknown） 和未定義的腐生生物 （Undefined saprotrophs）占所有真菌OTU 的90%以上，大豆醬中此類真菌在屬水平上分類地位和具體功能類別未定，需要進(jìn)一步探索其真菌資源，相關(guān)報道指出腐生營養(yǎng)型（Saprotroph）通過降解死亡的宿主細(xì)胞來獲取營養(yǎng)[27]，本試驗(yàn)結(jié)果中此類功能隨著大豆醬發(fā)酵時間的延長，豐度逐漸減少，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵后期真菌活性減弱，促進(jìn)其風(fēng)味品質(zhì)趨于成熟，進(jìn)一步證實(shí)真菌對其發(fā)酵程度的影響。目前，本研究及相關(guān)研究均是基于DNA 水平技術(shù)研究大豆醬中微生物的情況，然而，可能會檢測到的微生物會處于休眠狀態(tài)進(jìn)而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的片面性[28]，后期研究可以基于宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA水平）揭示大豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的組成、演替和功能性注釋，同時，也可利用代謝組學(xué)技術(shù)靶向性定性、定量地研究微生物代謝產(chǎn)物。

圖6 大豆醬微生物群落演替功能預(yù)測對比分析Fig.6 Comparative analysis of function prediction of successions and distributions of microbial community during commercial soybean paste fermentation

2.4 大豆醬與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

2.4.1 不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬與理化因素的相關(guān)性 為揭示大豆醬不同發(fā)酵時期與理化性質(zhì)的關(guān)系，通過對細(xì)菌屬和真菌屬相對豐度與理化性質(zhì)進(jìn)行RDA 分析。由圖7可知，揮發(fā)性成分、氨基酸態(tài)氮、蛋白酶活性對不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬的影響程度較大，說明這幾種指標(biāo)是影響大豆醬風(fēng)味物質(zhì)的主要因素，其余指標(biāo)（總酸、葡萄糖淀粉酶、還原糖）的影響程度相對較小。氮是微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，其含量會影響某些微生物生長[29]。根據(jù)6 種理化指標(biāo)箭頭間的夾角大小可知，揮發(fā)性成分與總酸和氨基酸態(tài)氮呈正相關(guān)；還原糖與蛋白酶、葡萄糖淀粉酶活性相關(guān)，這與其它文獻(xiàn)研究相似[30]。

圖7 理化性質(zhì)與大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的RDA 分析Fig.7 RDA analysis of physicochemical properties and different fermentation period of commercialize soybean paste

2.4.2 大豆醬微生物群落與風(fēng)味物質(zhì)因素的相關(guān)性 基于上述微生物功能預(yù)測，通過對大豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌屬與風(fēng)味物質(zhì)因素進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步證明了大豆醬微生物發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物的重要性及微生物功能預(yù)測的準(zhǔn)確性。由圖8可知，葡萄球菌屬和接和酵母屬與揮發(fā)性物質(zhì)及其組成成分酸醛、醇酯等物質(zhì)呈正相關(guān)，這與前期的研究結(jié)果及他人研究結(jié)果相吻合[18]，這兩種優(yōu)勢菌屬對大豆醬揮發(fā)性物質(zhì)形成具有貢獻(xiàn)。曲霉屬與總酸、蛋白酶和淀粉酶呈正相關(guān)，這表明前期添加的曲霉菌屬可通過分泌酶降解代謝產(chǎn)物，這與菌群主要功能預(yù)測中碳水化合物和氨基酸代謝結(jié)果相似；其余菌屬如阪崎腸桿菌與還原糖，乳桿菌屬與蛋白酶呈正相關(guān)。

圖8 大豆醬不同節(jié)點(diǎn)微生物屬與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between microbial genera and physicochemical properties of different period soybean paste

利用R 語言軟件，通過對序列豐度大于5%的37 種細(xì)菌屬和真菌屬以及45 種揮發(fā)性化合物之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，如圖9所示，葡萄球菌屬與醇酯、醛酮、酸類化合物呈正相關(guān)，如與苯乙醇、棕櫚酸乙酯、2，2，4，4-四甲基-3-戊酮、對甲氧基苯甲酸等呈正相關(guān)。接和酵母屬與醇酯類、酮類化合物呈正相關(guān)，包括乙醇、肉豆蔻酸乙酯、亞油酸甲酯、2，2，4，4-四甲基-3-戊酮等揮發(fā)性成分具有相關(guān)性?？傊?，優(yōu)勢菌葡萄球菌屬和接和酵母屬是對大豆醬風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)最大的微生物菌屬，對醇酯類形成具有重要作用；其中葡萄球菌屬促進(jìn)代謝產(chǎn)物酸類物質(zhì)和氨基酸態(tài)氮的形成。

圖9 大豆醬不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)微生物屬與揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性分析Fig.9 Correlation analysis between microbial genera and volatile flavor compounds of different period soybean paste

3 結(jié)論

本研究采用宏基因組技術(shù)對工業(yè)化生產(chǎn)不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)大豆醬中主要理化指標(biāo)、微生物群落及功能演替規(guī)律進(jìn)行分析，并將風(fēng)味物質(zhì)影響因素與優(yōu)勢微生物進(jìn)行相關(guān)性分析，揭示大豆醬微生物生態(tài)分布情況，預(yù)測其功能性變化。在微生物屬水平上，細(xì)菌的微生物群落組成較真菌更加豐富，其中最主要的優(yōu)勢菌是細(xì)菌屬的葡萄球菌屬和真菌屬的接和酵母屬，隨著發(fā)酵時間的延長，其序列豐度呈上升趨勢。根據(jù)微生物菌群功能預(yù)測可知，大豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌屬水平功能豐度分布主要是未知功能，這說明大豆醬中的菌群功能值得進(jìn)一步深入研究。其次，優(yōu)勢菌屬主要富集在氨基酸的運(yùn)輸和代謝以及碳水化合物的運(yùn)輸和代謝兩種功能。相關(guān)性分析表明，氨基酸態(tài)氮、還原糖、揮發(fā)性成分等6 種理化因素對不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的大豆醬具有不同程度的影響，且彼此之間呈正相關(guān)。優(yōu)勢菌屬葡萄球菌屬和接和酵母屬與揮發(fā)性成分醇酯、醛酮類化合物相關(guān)性較大，促進(jìn)大豆醬后期風(fēng)味物質(zhì)的形成，是揮發(fā)性成分形成的關(guān)鍵微生物。本試驗(yàn)從微生物群落結(jié)構(gòu)和功能角度研究，有助于進(jìn)一步探明傳統(tǒng)工藝結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)生產(chǎn)大豆醬的釀造機(jī)制，為大豆醬生產(chǎn)條件的控制及發(fā)酵種曲的開發(fā)提供一定的理論支持。