王忠合，胡文梅，盧燎源，李偉斌，李曉婷，吳家俊，王 軍

（韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 廣東 潮州 521041）

基于三重四極桿的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Selective reaction monitoring，SRM）也稱(chēng)為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）是質(zhì)譜定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在蛋白質(zhì)定量中廣泛使用，而根據(jù)專(zhuān)一性肽段的母離子質(zhì)量和子離子質(zhì)量，最大程度地去除干擾離子，監(jiān)測(cè)母離子與子離子形成的離子對(duì)信號(hào)響應(yīng)，是目標(biāo)蛋白驗(yàn)證和絕對(duì)定量的有效手段[1-2]。然而，隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)的深入發(fā)展，樣本基質(zhì)越來(lái)越復(fù)雜，目標(biāo)蛋白豐度越來(lái)越低，容易受到高豐度蛋白的掩蓋，而SRM 由于質(zhì)量分辨率低，難以有效去除復(fù)雜基質(zhì)背景的干擾，易造成假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，隨著分析通量的要求越來(lái)越高，一次分析可能需要監(jiān)測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)離子對(duì)，而由于SRM 靈敏度的局限，使得同時(shí)監(jiān)測(cè)的離子對(duì)數(shù)量有限；此外，離子對(duì)、碰撞能量等條件的優(yōu)化也費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以滿(mǎn)足目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)高通量發(fā)展的需要[3]。四極桿-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（如QTOF、QOrbitrap） 的發(fā)展以及掃描速度的提升，為目標(biāo)蛋白定量提供了新的途徑。數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集（Data dependent acquisition，DDA）方式是一種隨機(jī)選取豐度最高的前幾名離子進(jìn)行二級(jí)碎裂檢測(cè)，在非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域具有非常突出的優(yōu)勢(shì)，主要用于過(guò)敏原檢測(cè)[1，4]、蛋白功能分析[5]、生物標(biāo)志物和差異蛋白鑒別等[6-7]?；贒DA 策略的非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法主要有兩種：一種是信號(hào)強(qiáng)度法，即利用提取一級(jí)譜圖峰面積或峰強(qiáng)度進(jìn)行定量；另一種是譜圖計(jì)數(shù)法，即通過(guò)統(tǒng)計(jì)同一蛋白質(zhì)所有肽段二級(jí)譜圖總數(shù)來(lái)確定蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，豐度越高的蛋白質(zhì)肽段，被檢測(cè)到的次數(shù)越多，其得到的二級(jí)譜圖張數(shù)越多；前者基于一級(jí)峰面積或峰強(qiáng)度定量存在共流出肽段干擾定量而影響準(zhǔn)確性的問(wèn)題，后者基于二級(jí)譜圖張數(shù)定量法則存在低豐度蛋白被掩蓋而無(wú)法定量的情況。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)以定性和定量樣本中所有蛋白質(zhì)為目標(biāo)，可分為標(biāo)記定量和非標(biāo)記定量，常用的標(biāo)記方法為同位素標(biāo)記試劑法。其中，同位素標(biāo)記法準(zhǔn)確度高，而試劑價(jià)格昂貴且可標(biāo)記的樣本數(shù)量有限；非標(biāo)記定量技術(shù)無(wú)需昂貴的同位素試劑，耗費(fèi)低，對(duì)樣品酶解產(chǎn)物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，使其最接近原始狀態(tài)，能夠更好地反映出樣品中蛋白質(zhì)的差異性[8]。近年來(lái)，肉類(lèi)摻假事件層出不窮，隨著肉類(lèi)價(jià)格差異不斷擴(kuò)大，不法商家為了追求利益，借機(jī)用價(jià)格低廉的雞肉、馬肉、鴨肉等偽制牛羊肉制品，使得消費(fèi)者對(duì)肉類(lèi)及其制品的食品安全問(wèn)題甚為擔(dān)憂(yōu)。要想打擊“摻假肉”泛濫的問(wèn)題，首先要制定準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法。歐盟等在“馬肉風(fēng)波”后[9]，批準(zhǔn)了對(duì)肉制品進(jìn)行DNA 檢測(cè)的分子方法，其靈敏度高，操作簡(jiǎn)易，檢測(cè)過(guò)程短，特別適用于原料肉中摻假肉的鑒別。然而，食品中DNA 成分復(fù)雜，加之該技術(shù)的高靈敏度，使得應(yīng)用擴(kuò)增方法來(lái)鑒定物種具有因非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，由于該方法無(wú)法區(qū)分同一種屬來(lái)源的不同產(chǎn)品，如雞肉和雞蛋、牛肉和牛奶等，因而常采用質(zhì)譜法鑒別特征肽質(zhì)量圖譜的結(jié)果做對(duì)比。本文采用納流液相色譜-四極桿串聯(lián)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（nLC-QE）分析肉和肉丸樣品，采用數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集模式（DDA）分析篩選肉中的特異性肽段，定量測(cè)定肉蛋白，對(duì)比不同分離條件下特征肽段測(cè)定情況，并根據(jù)特征肽鑒別肉的種屬以提高鑒別的準(zhǔn)確性，為肉類(lèi)摻假檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用的豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉等購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，剔除脂肪和筋膜，?jīng)絞肉機(jī)絞碎備用。市售牛肉丸購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，自制牛肉丸采用100%牛肉制成。

質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲醇、純水，F(xiàn)isher 公司；碘代乙酰胺（IAA）、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶、質(zhì)譜級(jí)甲酸、色譜級(jí)正己烷、二硫蘇糖醇（DDT），Sigma-Aldrich 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、尿素、硫脲、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、碳酸氫銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris），生工生物工程（上海）有限公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、無(wú)水乙醇等均為分析純級(jí)；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm），實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器及設(shè)備

EASY-nLC 1200 納升級(jí)液相色譜、Q Exactive 四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（QE），Thermo 公司；JY3002 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZX4 漩渦振蕩器，意大利VELP 公司；IKA T25 高剪切均質(zhì)機(jī)，IKA 公司；T1901 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Direct-Q5 超純水機(jī)，美國(guó)密理博有限公司；SIGMA 2-16P 高速離心機(jī)，西格瑪有限公司；Scientz-950E 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；HLB 固相萃取柱（3 mL/200 mg），Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理及牛肉丸的制備 選擇經(jīng)衛(wèi)生檢疫合格的黃牛后腿肉1 000 g，剔除脂肪和筋膜，順著紋路切成5 cm×5 cm×5 cm 的立方體，放入冰箱冷藏至5 ℃。斬拌過(guò)程中加入3 次冰，添加冰的總質(zhì)量為所有原料總質(zhì)量的15%，以保證肉糜溫度在10 ℃以下，加入紅薯粉80 g、味精4 g、肉彈素5 g、食鹽25 g 等配料，斬拌至膠狀肉泥。左手抓肉泥，從拇指和十指間擠出2.5 cm 左右的肉丸，右手用調(diào)羹接住后放入35 ℃的溫水鍋中，緩慢升溫，待肉丸中心溫度達(dá)80 ℃，肉丸浮起、變色，撈起。迅速放入15 ℃水中冷卻15 min。放入冰箱-20℃冷凍，備用。

1.3.2 蛋白提取及含量測(cè)定 將瘦肉和肉丸樣品切碎，各取0.5 g 樣品加入2.5 mL 正己烷，超聲3 min，渦旋5 min，于4 500 r/min 離心3 min，保留沉淀物。重復(fù)以上步驟2 次，用氮?dú)獯蹈沙恋砦铩＜尤? mL 不同的提取液，旋渦混勻30 s，超聲處理3 min，在4 ℃下于12 000 r/min 離心5 min，取上清液采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)用的蛋白質(zhì)提取液主要有以下3 種，提取液1：0.3 mol/L KCl、0.15 mol/L KH2PO4、0.15 mol/L K2HPO4；提取液2：6 mol/L 尿素、1 mol/L 硫脲、50 mmol/L Tris-HCl；提取液3：0.1%三氟乙酸。

1.3.3 蛋白酶解與肽段純化 取200 μL 混合溶液或肉丸蛋白酶解液，加入裝有150 μL 碳酸氫銨（0.5 mol/L）的2 mL 離心管中，渦旋30 s，加入10 μL DTT 溶液（500 mmol/L），混勻后置于75 ℃水浴中處理30 min，以使溶液中的蛋白質(zhì)變性，后將提取物冷卻至室溫。添加150 mmol/L 碘代乙酰胺使蛋白質(zhì)烷基化，最終濃度為15 mmol/L，暗處反應(yīng)30 min。隨后，添加50 μL 牛胰蛋白酶溶液（0.5 mg/L，用30 mmol/L NH4HCO3配制）和10 μL 氯化鈣溶液（0.1 mol/L）。立即將酶解液渦旋1 min，置于37 ℃水浴中酶解12 h。向酶解液中加入20 μL甲酸終止反應(yīng)，混勻后置于室溫中15 min，加入水，使得溶液終體積為1 mL。取1 mL 酶解液過(guò)活化的HLB 柱，并用0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)1%的甲酸沖洗空的離心管，將洗滌液裝入小柱，以定量轉(zhuǎn)移樣品[10]。然后用2 mL 體積分?jǐn)?shù)1%的甲酸水洗滌小柱。最后，將肽用1 mL 乙腈/水混合液（體積比1∶1，含0.1%甲酸）洗脫到10 mL 離心管中，加入洗脫液后將小柱浸泡10 min，使得肽能完全洗脫。再加1 mL 混合洗脫液重復(fù)洗脫1 次。隨后，將全部洗脫液在氮?dú)饬髦写蹈?，色譜分析前將提取物用0.5 mL 的乙腈/水混合液（體積比3∶97，含有0.1%甲酸）復(fù)溶，渦旋30 s，過(guò)0.22 μm 有機(jī)系濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 色譜及質(zhì)譜分析條件 將酶切肽段用Easy-nLC 1200 和QE 進(jìn)行LC-HRMS 分析，肽段以800 bar 的壓力直接上樣到PepMap 100 C18分析柱上 （250 mm×75 μm，2 μm），再用300 nL/min 流速進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和80%乙腈混合溶液，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫箱溫度為40 ℃。離子源為nano-Flex 納噴霧離子源；掃描模式：正離子；毛細(xì)管電壓為2.0 kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；RF-lens 為50%；DDA 采集模式，一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000，自動(dòng)增益目標(biāo)值（AGC）為1×106，最大注入時(shí)間（IT）為100 ms，掃描范圍為m/z 300～1 500；二級(jí)譜圖分辨率設(shè)為17 500，最大注入時(shí)間為80 ms，掃描范圍為m/z 150～2 000，隔離窗口設(shè)為1.6 u，歸一化碎裂能量（NCE） 設(shè)為28，碎裂模式為HCD，自動(dòng)增益值（AGC）為1×105，采集top N 設(shè)為20，其余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)置。

表1 納升級(jí)液相色譜分離梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program employed for separation of peptides by nano LC

1.3.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行一維方差分析，差異顯著性采用Duncan（鄧肯）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平P＜0.05。肽段DDA 數(shù)據(jù)使用MaxQuant 軟件進(jìn)行搜庫(kù)鑒定，檢索UniProt _Bovine（包含876 759 條蛋白序列）、_Chicken （包含709 277 條蛋白序列）、_Pig（包含709 277 條蛋白序列）、_Duck（包含842 876 條蛋白序列）數(shù)據(jù)庫(kù)，一級(jí)質(zhì)譜中母離子質(zhì)量誤差為：10 ppm，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子質(zhì)量精度：0.02 u，酶為胰蛋白酶（Trypsin），完全酶切，漏切數(shù)目為2 個(gè)，固定修飾為半胱氨酸的烷基化（C，+57.02150 u），可變修飾為甲硫氨酸的氧化（M，+15.99492 u），從鑒定結(jié)果中挑選4 種肉類(lèi)的特征肽段。非標(biāo)記定量使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Scientific）軟件的 PWF_QE_Precursor_Quan_and_ LFQ_SequestHT_Percolator 模版搜索和 CWF_Comprehensive_Enhanced Annotation_LFQ_and_ Precursor_Quan 模板組裝，檢索fasta 數(shù)據(jù)庫(kù)文件、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的參數(shù)同上，Percolator 結(jié)點(diǎn)進(jìn)行FDR 值計(jì)算，PSM、肽段、蛋白質(zhì)假陽(yáng)性率均控制在1%。非標(biāo)記定量用Minora Feature Detector 結(jié)點(diǎn)進(jìn)行色譜峰提??；Feature Mapper 結(jié)點(diǎn)進(jìn)行色譜峰和肽段鑒定結(jié)果的匹配，設(shè)置保留時(shí)間對(duì)齊，最大的保留時(shí)間偏差為10 min，最小信噪比為5；Precursor Ions Quantifier 結(jié)點(diǎn)進(jìn)行定量結(jié)果輸出，用Unique+Razor 肽的母離子信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量、蛋白的強(qiáng)度為前三強(qiáng)（top 3）肽段強(qiáng)度的總和，數(shù)據(jù)輸出后導(dǎo)入SIMCA 13.0 進(jìn)行主成分分析（PCA）和二維正交偏最小二乘判別分析（O2PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響

將牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉4 種純?nèi)鈽悠泛图兣Ｈ馔璨捎貌煌鞍踪|(zhì)提取劑，提取得到5 種蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白含量，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，純?nèi)鈽悠返淖顑?yōu)提取劑為提取液3，而提取液2 次之，顯著高于提取液1 的提取效果，這主要是由于提取液2 中加入了一定量的尿素，可促進(jìn)蛋白質(zhì)變性，有助于蛋白質(zhì)的提取。純牛肉丸樣品的最優(yōu)提取劑為提取液2，而提取液3 次之，此結(jié)果不同于純?nèi)鈽悠分械鞍踪|(zhì)的提取效果，可能是由于肉丸加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性程度大，并且受到其它組分的影響，而不利于蛋白質(zhì)的提取。因此，后續(xù)步驟采用提取液2 提取純?nèi)夂腿馔铇悠分械牡鞍踪|(zhì)，且在處理肉丸樣品時(shí)增加攪碎時(shí)間3.5 min 和超聲強(qiáng)化提取3 min，這與已報(bào)道文獻(xiàn)[11]的純?nèi)獾鞍滋崛∫翰贿m用于肉制品中蛋白提取的研究結(jié)果一致。

圖1 提取劑對(duì)不同樣品中蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.1 Effects of extraction buffer on efficiency of proteins from different samples

2.2 蛋白質(zhì)的分析與鑒別

純?nèi)鈽悠凡捎锰崛【彌_溶液2 提取蛋白，酶解后過(guò)HLB 柱，采用nLC-QE 高分辨質(zhì)譜儀分析，納升級(jí)液相色譜分離系統(tǒng)采用含2.0 μm 填料的納米色譜柱，具有更出色的分離能力，在更高的壓力下縮短了梯度分離時(shí)間，提高了蛋白質(zhì)和多肽的分析通量和識(shí)別率，將液相不同洗脫時(shí)間分離的蛋白質(zhì)酶解液的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定結(jié)果如表2所示。不同液相洗脫梯度對(duì)酶解液中蛋白和特異肽的鑒定有顯著影響（P＜0.05），在洗脫梯度為120 min 時(shí)，鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)以及特異肽段數(shù)最多，而不同洗脫梯度對(duì)不同種屬來(lái)源的特征肽數(shù)目的鑒定影響不大。本研究建立的數(shù)據(jù)依賴(lài)型采集模式在豬肉、牛肉、雞肉和鴨肉中分別鑒定到80 554，33 350，40 969，32 923 條特異性多肽，其中序列相同、修飾不同的肽段視為不同的肽段，肽段電荷數(shù)為2～7，這些肽段在蛋白水平上分別歸屬于2 715，889，659，1 143 種蛋白質(zhì)，與文獻(xiàn)[12]采用納升級(jí)液相色譜-四極桿軌道阱質(zhì)譜法分離鑒別到的蛋白數(shù)量相當(dāng)，而遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[13]中采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜采集的結(jié)果。該方法鑒定到的蛋白質(zhì)有較高的序列覆蓋度，且不同洗脫梯度分離出的特異肽的信號(hào)強(qiáng)度分布波動(dòng)非常小，如圖2所示。結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好。由此可知，非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到的蛋白質(zhì)比較全面且可靠，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同洗脫梯度分離的肉類(lèi)特異肽的豐度分布Fig.2 Abundance distribution of meat marker peptides separated by different elution gradients

表2 不同梯度洗脫分離的肉蛋白酶解物中鑒定到的蛋白數(shù)和肽段數(shù)Table 2 Identified protein numbers and peptide numbers from meat protein hydrolysates separated by different gradient elution

2.3 特征肽的篩選與鑒別

將4 種肉類(lèi)分別用120 min 梯度洗脫重復(fù)測(cè)定5 次建庫(kù)，用MaxQuant 軟件鑒別肽段數(shù)據(jù)后，將鑒定到的肽段進(jìn)行UniProt 的BLAST 搜索，分別找出不同種屬肉中的特征肽段，結(jié)果如表3所示。

表3 特征肽來(lái)源及其特性Table 3 Source and characteristics of marker peptides

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

肉類(lèi)摻假鑒別和篩選用的特征肽段要求不易發(fā)生修飾，質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)且易被質(zhì)譜檢測(cè)到，色譜保留時(shí)間適當(dāng)，氨基酸數(shù)在8～20 之間，熱穩(wěn)定性好，不含半胱氨酸（C）和蛋氨酸（M）的特征肽[14]，根據(jù)條件最終分別篩選出12 條豬肉、15 條牛肉、19 條雞肉、16 條鴨肉的特征肽段，各特征肽段的質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng)，峰型較好，圖3所示為2 條豬源性特征肽的色譜-質(zhì)譜圖。采用納升級(jí)液相色譜-高分辨質(zhì)譜法篩選到的特征肽段主要來(lái)自肌紅蛋白、肌球蛋白、清蛋白、載脂蛋白和血紅蛋白等，部分特征肽與文獻(xiàn)[2]、[4]、[12]報(bào)道的結(jié)果一致，部分特征肽為首次鑒別報(bào)道，具有物種特異性，可用于肉類(lèi)摻假鑒別和定量分析不同物種的肉類(lèi)。

圖3 豬源性特征肽SALAHAVQSSR（m/z 563.8）和DLADEVALVDVMEDK（m/z 831.4）的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrometry of porcine marker peptides SALAHAVQSSR （m/z 563.8）and DLADEVALVDVMEDK （m/z 831.4）

2.4 色譜洗脫梯度及蛋白提取液對(duì)特征肽檢出數(shù)和強(qiáng)度的影響

由表4可知，不同梯度的色譜分離對(duì)4 種肉類(lèi)中特征肽的檢出數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度影響不大，然而隨著色譜分離時(shí)間的延長(zhǎng)，部分特征肽的信號(hào)強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，這主要是由于流動(dòng)相線性變化梯度小、色譜峰展寬所引起。DDA 模式根據(jù)設(shè)定的閾值，每次只選擇超過(guò)閾值的1 個(gè)母離子進(jìn)行MS/MS 質(zhì)譜采集，離子歸屬清晰，然而質(zhì)譜儀掃描速度有限，會(huì)導(dǎo)致離子漏檢。同時(shí)，多肽鑒別重復(fù)性分析研究[15]也表明，可鑒定出新多肽的速率在2次重復(fù)樣品注射后急劇增加，而在約5 次重復(fù)注射后逐漸減少，這主要是由DDA 采集模式中肽類(lèi)的半隨機(jī)取樣所引起，試驗(yàn)中采用多次重復(fù)技術(shù)采樣分析法探討不同洗脫梯度對(duì)特征肽檢出及信號(hào)強(qiáng)度的影響，特征肽段的同位素點(diǎn)積值（idot）均大于0.9，且大部分肽段的idotp 值接近于1.0，與譜圖庫(kù)中的匹配度非常高，可信度高。豬肉源特征肽主要來(lái)自于肌球蛋白、肌紅蛋白、酶蛋白，牛肉源特征肽主要來(lái)自于肌球蛋白、血清白蛋白、酶蛋白、熱休克蛋白，雞肉源特征肽主要來(lái)自于肌球結(jié)合蛋白C、酶蛋白、肌球調(diào)控蛋白，鴨肉源特征肽主要來(lái)自于載脂蛋白、血紅蛋白亞基、球蛋白，綜合考慮特征肽的檢出情況與信號(hào)強(qiáng)度，以及縮短分析時(shí)間，提高檢測(cè)效率等方面，可選擇梯度1（60 min）的色譜分離條件進(jìn)行肉丸中肉蛋白含量的測(cè)定及肉種屬鑒定。

表4 色譜洗脫梯度對(duì)特征肽檢出數(shù)和強(qiáng)度的影響Table 4 Effect of elution gradient on identified number and intensity of marker peptides

（續(xù)表4）

2.5 非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)法檢測(cè)肉丸中蛋白的含量及鑒定肉種屬

非標(biāo)記定量蛋白組學(xué)不需要經(jīng)過(guò)任何標(biāo)記，直接酶解后經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析采集數(shù)據(jù)，利用Proteome Discoverer 軟件對(duì)譜圖進(jìn)行歸一化后，可用肽段離子峰強(qiáng)度或峰面積來(lái)鑒定和定量蛋白質(zhì)，這主要利用了肽段的峰強(qiáng)度或峰面積與其來(lái)源的蛋白質(zhì)的濃度呈正比，且其定量具有重復(fù)性和準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，該方法常用于定量分析肉類(lèi)樣品中蛋白質(zhì)豐度的變化[16]。采用非標(biāo)記定量蛋白法鑒別的不同價(jià)格牛肉丸樣品的結(jié)果如圖4和圖5所示。純?nèi)夂团Ｈ馔铇悠返馁|(zhì)譜測(cè)定結(jié)果經(jīng)PD 軟件預(yù)處理，導(dǎo)出蛋白的豐度值進(jìn)行PCA 聚類(lèi)分析，PCA 屬于無(wú)監(jiān)督的判別分析，試驗(yàn)中的前2 個(gè)主成分的累計(jì)可信度較高，圖4a 中橫坐標(biāo)為每個(gè)樣本的第1 主成分得分值，縱坐標(biāo)為每個(gè)樣本的第2 主成分得分值，牛肉和純牛肉丸樣品聚合度很好，緊密的分布在第4 象限，而且不同樣品間的差別不大；豬肉、雞肉、鴨肉樣品的聚合度也很好，緊密的分布在第1、2、3 象限，摻有豬肉和雞肉的牛肉丸樣品分別在第1、2 象限均勻分布，部分樣品間的聚集度較高，而部分牛肉丸樣品在PCA 得分圖中的區(qū)分效果一般，出現(xiàn)部分混淆情況，這表明PCA 方法可以在很大程度上將數(shù)據(jù)降維，且降維后的數(shù)據(jù)能夠最大程度地表達(dá)原始變量的數(shù)據(jù)特征而不丟失有效信息，然而對(duì)部分樣品的區(qū)分效果一般。O2PLS-DA 是常用的有監(jiān)督判別分析，是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，在一個(gè)算法下實(shí)現(xiàn)回歸建模（多元線性回歸）、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化（主成分分析）及兩組變量之間的相關(guān)性分析（典型相關(guān)性分析）[17-18]。在PCA 基礎(chǔ)上進(jìn)行O2PLS-DA 分析的純?nèi)夂筒煌瑑r(jià)格牛肉丸樣品的結(jié)果如圖5所示。從圖5a 得分圖可知，豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉和13 批不同價(jià)格的牛肉丸樣品可以分成7 大類(lèi)，純牛肉丸和摻有豬肉或雞肉的牛肉丸樣品可以很好的根據(jù)O2PLS-DA 模型區(qū)分開(kāi)，且PCA 中聚集度較差的樣品也能可被分開(kāi)，13 批樣品中共有4 批為純牛肉丸樣品，且在檢出的摻有其它肉類(lèi)的樣品中有明確標(biāo)識(shí)的僅占22.2%。由圖5b 載荷圖可知，每1 個(gè)點(diǎn)代表1種潛在蛋白標(biāo)志物，離中心點(diǎn)和坐標(biāo)軸越遠(yuǎn)，對(duì)模型的影響越大，即對(duì)不同樣本的分組貢獻(xiàn)率越高。

圖4 不同價(jià)格牛肉丸樣品的蛋白PCA 得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.4 Protein PCA scores （a） and load （b） of beef meatball samples with different prices

圖5 不同價(jià)格牛肉丸樣品的蛋白O2PLS-DA 得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.5 Protein O2PLS-DA scores （a） and load （b） of beef meatball samples with different prices

從不同種屬的肉類(lèi)樣品中篩選出的特征肽段（如表4） 可作為進(jìn)一步確證肉制品中肉類(lèi)的來(lái)源，從兩種牛肉丸樣品中鑒別出豬源和雞源特征肽的色譜-質(zhì)譜結(jié)果分別如圖6和圖7所示。牛肉丸樣品W1 中共鑒別出豬源特征肽3 條，信號(hào)強(qiáng)度（NL）非常大，碎片離子中共測(cè)得多個(gè)y 離子和b 離子與理論圖譜庫(kù)匹配程度高，這表明在該牛肉丸樣品中混有豬肉成分。牛肉丸樣品W3 中共鑒別出雞源特征肽3 條，信號(hào)強(qiáng)度（NL）非常大，碎片離子中共測(cè)得多個(gè)y 離子和b 離子與理論圖譜庫(kù)匹配程度高，這表明在該牛肉丸樣品中混有雞肉成分，因此非標(biāo)記蛋白定量法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可用于區(qū)分樣品中肉的種屬與分類(lèi)，特征肽定量法可用于進(jìn)一步確認(rèn)鑒別結(jié)果與定量分析。

圖6 牛肉丸樣品W1 中鑒別出的豬源特征肽色譜-質(zhì)譜圖Fig.6 Chromatography-mass spectrometry of porcine-specific peptides identified in beef meatball sample W1

圖7 牛肉丸樣品W3 中鑒別出的雞源特征肽色譜-質(zhì)譜圖Fig.7 Chromatography-mass spectrometry of chicken-specific peptides identified in beef meatball sample W3

3 結(jié)論

不同蛋白質(zhì)提取緩沖液對(duì)純?nèi)夂团Ｈ馔铇悠分械鞍踪|(zhì)的提取效果影響顯著（P＜0.05），且由于牛肉丸在加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的變性程度大，不利于蛋白質(zhì)的提取，因此在處理牛肉丸樣品時(shí)需增加攪碎時(shí)間和超聲強(qiáng)化提取時(shí)間。不同液相洗脫梯度對(duì)肉中蛋白數(shù)和肽段數(shù)的鑒定結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），在蛋白水平上，DDA 采集模式分別從豬肉、牛肉、雞肉和鴨肉樣品中鑒定出2 715，889，659，1 143 種蛋白質(zhì)，不同洗脫梯度分離出的特異肽的信號(hào)強(qiáng)度分布波動(dòng)非常小，表明該方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好。UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST算法搜索結(jié)果表明，在豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉中分別鑒定出12，15，19，16 條不同種屬肉類(lèi)的特征肽段，不同梯度的色譜分離對(duì)4 種肉類(lèi)特征肽的檢出數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度影響不大，在DDA 采集模式下特征肽的匹配度非常好，可信度高，然而部分特征肽的重現(xiàn)性較差。非標(biāo)記定量結(jié)果表明，純牛肉丸樣品與摻假肉丸樣品能很好的鑒別，所測(cè)定的牛肉丸樣品中有69.2%的樣品摻有豬肉或雞肉，有明確標(biāo)識(shí)的僅占22.2%，O2PLS-DA 作為一種有監(jiān)督的判別分析方法較PCA 法更適合用于非標(biāo)蛋白定量法中用于區(qū)分牛肉丸樣品，特征肽定量法可進(jìn)一步確認(rèn)鑒別結(jié)果與定量分析。